一株海洋来源产蛋白酶的链霉菌用于食醋生物强化的方法

摘要

本发明公开了一株海洋来源产蛋白酶的链霉菌用于食醋生物强化的方法，属于食品酿造技术领域。本发明从海洋环境中筛选到了一株链霉菌(Streptomyces sp.)CCTCC NO:M 2017210，该菌可耐高温(68℃‑70℃)且具有高产蛋白酶能力。将该菌株制作成菌粉用于强化食醋醋酸发酵，该方法可提高食醋中氨基酸含量，并能改善食醋的产品风味和提升食醋品质。

权利要求

1.一株链霉菌(Streptomyces sp.)PRO1，其特征在于，所述链霉菌已于在2017年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2017210。

2.含有权利要求1所述链霉菌的微生物菌剂。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为链霉菌CCTCC NO:M 2017210的液体菌剂或固体菌剂。

4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为链霉菌CCTCC NO:M 2017210的冻干粉。

5.权利要求1所述的链霉菌在酿造技术领域的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述酿造是食醋酿造。

7.一种食醋生物强化的方法，其特征在于，所述生物强化方法是采用链霉菌CCTCC NO:M 2017210直接与酿醋原料混合后进行发酵。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生物强化方法是采用链霉菌的菌粉直接与酿醋原料混合后进行发酵。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生物强化方法，是在发酵起始将链霉菌CCTCC NO:M 2017210菌粉按照0.8-1.2％的接种量在发酵池中与酒醪、麸皮原料混匀后进行发酵，发酵采用传统的逐层醅扩大培养的工艺。

说明书

一株海洋来源产蛋白酶的链霉菌用于食醋生物强化的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一株海洋来源产蛋白酶的链霉菌用于食醋生物强化的方法，属于食品酿造技术领域。

背景技术

[0002] 传统食醋酿造以含淀粉多的糯米、麸皮、等为原料，其中也有蛋白质成分。这些蛋白质经蒸熟后，由曲霉所分泌的蛋白酶催化，在糖化、酒精发酵及醋酸发酵各阶段中，逐渐分解成各种氨基酸及其中间代谢产物。但仅利用曲药中微生物所产蛋白酶还不能充分水解原料中的蛋白质，此外，食醋风味物质还有待加强。目前，在工业生产中多采用高温浇淋熏醅、添加复合酶制剂、调味和增味等方法来提高食醋中氨基酸含量及其风味物质，虽然风味有所改善，但生产成本明显提高，不利于生产上的广泛应用。目前为止，国内外研究中尚未有关于将链霉菌应用于食醋酿造中氨基酸和风味强化方面的报道。

[0003] 因此，利用现代生物技术，筛选优良性能的微生物对于生产出高质量、高产量、风味独特的优质食醋具有重要意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于解决现有食醋固态酿造技术的不足，提供一种性能优良的菌粉(Streptomyces sp.CCTCC NO:M 2017210)用于固态酿造食醋的发酵过程中进行生物强化，以改善食醋的产品风味，提升食醋品质，提高原料利用率，更好的发挥海洋来源微生物在食醋酿造中的应用。

[0005] 本发明的第一个目的是提供一株链霉菌，所述链霉菌已于在2017年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2017210。

[0006] 本发明的链霉菌，具有如下优良性能：

[0007] (1)应用于食醋发酵体系，不会影响到食醋的正常发酵；

[0008] (2)用于强化食醋发酵，不仅可以提高原料利用率而且可以提升食醋风味和品质；醋醅中的游离氨基酸的含量可达到1413.83mg/100g干醅，相比不添加链霉菌进行强化对照组提高了14％，挥发性酯类和羧酸类物质的含量比对照组分别提高了27％和21％。

[0009] (3)是从海洋沉积物中分离，能适应68℃-70℃的高温环境生长，并且具有产蛋白酶的能力，酶活高达2036U/mL发酵液。

[0010] 本发明的第二个目的是提供所述含有所述链霉菌CCTCC NO:M 2017210菌株的微生物菌剂。

[0011] 在一种实施方式中，所述微生物菌剂含有链霉菌CCTCC NO:M 2017210菌体的活细胞、冷冻干燥得到的链霉菌CCTCC NO:M 2017210干菌体、固定化的链霉菌CCTCC NO:M2017210细胞、链霉菌CCTCC NO:M 2017210的液体菌剂、链霉菌CCTCC NO:M 2017210的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的链霉菌CCTCC NO:M 2017210菌株。

[0012] 在一种实施方式中，所述微生物菌剂为链霉菌CCTCC NO:M 2017210的冻干粉。

[0013] 在一种实施方式中，所述冻干粉的制备：先采用LB培养基进行多级活化培养得到种子液，然后离心、洗涤多次得到菌泥；然后使用含有脱脂乳粉和海藻糖的冻干保护剂溶解菌泥，预冻，再采用冻干机中进行冻干，冻干温度为-72℃，压力位0.1MPa，冻干后取出。

[0014] 在一种实施方式中，所述保护剂使用量为种子液的10％。

[0015] 本发明的第三个目的是提供所述链霉菌CCTCC NO:M 2017210菌株或者微生物菌剂的应用。

[0016] 在一种实施方式中，所述应用是指用于酿造技术领域。

[0017] 在一种实施方式中，所述酿造是食醋酿造。

[0018] 在一种实施方式中，所述应用是用于提升食醋风味或原料利用率。

[0019] 本发明的第四个目的是提供一种食醋生物强化的方法，所述生物强化方法是采用链霉菌CCTCC NO:M 2017210直接与酿醋原料混合后进行发酵。

[0020] 在一种实施方式中，所述生物强化方法是采用链霉菌的菌粉直接与酿醋原料混合后进行发酵。

[0021] 在一种实施方式中，所述生物强化方法，是在发酵起始将链霉菌CCTCC NO:M 2017210菌粉按照0.8-1.2％的接种量在发酵池中与酒醪、麸皮等原料混匀后进行发酵，发酵采用传统的逐层醅扩大培养的工艺。

[0022] 本发明的有益效果：

[0023] (1)本发明从海洋环境中筛选高产蛋白酶的高温菌，然后基于微生物强化技术，对食醋醋酸发酵过程中添加高产蛋白酶菌粉，提高了原料中蛋白质的水解率并进一步提高醋液中氨基酸含量，同时了提高食醋的营养价值、鲜味、色泽和口感，达到了提高食醋中氨基酸和挥发性物质含量和提升食醋品质目的。

[0024] (2)采用链霉菌强化后，醋醅中的游离氨基酸的含量可达到1413.83mg/100g干醅，相比对照组提高了14％，挥发性酯类和羧酸类物质的含量均有显著，比对照组分别提高了27％和21％。

[0025] 生物材料保藏

[0026] 一株链霉菌(Streptomyces sp.)，分类学命名为链霉菌PRO1Streptomyces sp.PRO1，所述链霉菌已于在2017年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2017210。

附图说明

[0027] 图1：添加Streptomyces sp.的实验组与对照组中氨基酸总含量变化情况；

[0028] 图2：添加Streptomyces sp.的实验组与对照组中挥发性物质总含量变化情况。具体实施方案

[0029] 食醋理化指标的检测：总酸按照GB/T 5009.41(2003)NaOH中和法进行检测；还原糖测定按照GB/T 5009.7(2008)中采用直接滴定法进行测定；氨基酸采用HPLC进行检测；风味物质种类采用气质联用仪器进行检测。

[0030] 实施例1：海洋沉积物中高产蛋白酶菌株的筛选

[0031] (1)海洋沉积物样品预处理

[0032] 沉积物采用直接稀释涂布法，现场涂布于酪素海水平板，25℃培养20d。

[0033] 海水酪素培养基：NaH2PO4·7H2O 1.07g，KH2PO40.36g，干酪素4g，琼脂15g，陈海水1000mL。

[0034] (2)平板透明圈初筛

[0035] 挑选酪素海水平板上的单菌落点种到到筛选培养基上，25℃培养48h后测量透明圈直径(Rt)和菌落直径(Rs)，计算圈径比K，K＝Rt/Rs。选择圈径比较大的菌落进行划线纯化2-3次，镜检确定纯培养后接种至斜面4℃保存，菌悬液与10％甘油中-20℃保存。

[0036] 筛选培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸铁0.1g，脱脂奶粉20g，陈海水1000mL，琼脂粉15g，pH 8.0。

[0037] (3)摇瓶复筛

[0038] 斜面接种种子培养基，25-28℃，200rpm培养24h，2％接种量转接至基础发酵培养基25℃，200rpm培养48h，取发酵上清液，测定发酵液中蛋白酶活力。

[0039] (4)蛋白酶酶活测定

[0040] 参考蛋白酶制剂国标GB/T23527-2009。蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，产生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件将福林试剂还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。

[0041] 蛋白酶酶活定义：30℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量定义为一个蛋白酶活力单位。

[0042] 根据初筛培养基中透明圈大小，并结合摇瓶复筛中发酵48h后的发酵液中蛋白酶活性筛选出1株高产蛋白酶的菌株，该菌株酶活高达2036U/mL发酵液，经鉴定该菌株系链霉菌属(Streptomyces sp.)。将该菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017210。

[0043] 实施例2：高产蛋白酶菌株Streptomyces sp.CCTCC NO:M 2017210冻干粉的制备[0044] (1)产蛋白酶菌株Streptomyces sp.CCTCC NO:M 2017210的活化培养[0045] 将菌株Streptomyces sp.CCTCC NO:M 2017210的菌粉接入150mL液体活化培养基中，37℃摇床培养48-50h，得到一级种子液；将一级种子按照6％(v/v)接种量接入400mL液体培养基中，37℃摇床培养48-50h，得到二级种子液；二级种子液按照8％(v/v)接种量接入6000mL液体培养基中，37℃摇床培养50-55h，得到三级种子液。

[0046] 海水LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，陈海水1000mL。

[0047] (2)Streptomyces sp.CCTCC NO:M 2017210冻干粉的制备

[0048] 将三级发酵液倒入500mL离心杯(用75％酒精擦拭晾干后使用)中，4500r/min离心15min，弃去上清液，用无菌生理盐水洗涤两次菌泥，以同样的条件离心，弃去上清液，沉淀即为菌株Streptomyces sp.CCTCC NO:M 2017210的菌泥。称取125g脱脂乳粉溶于900mL水中，105℃灭菌10min；10g海藻糖溶于100mL水中，115℃灭菌20min，使用前将二者混匀。用冻干保护剂溶解菌泥，保护剂使用量为三级种子液的10％，充分震荡，然后倒入无菌培养皿中，液体高度为1cm左右，用保鲜膜密封后放入-80℃冰箱中预冻3h。将预冻好的浓缩液迅速转移到冻干机中进行冻干，冻干温度为-72℃，压力位0.1MPa，冻干48h后取出敲碎封装并放入-20℃保存待用。

[0049] 实施例3：食醋发酵过程的生物强化

[0050] (1)原料

[0051] 本实施例所选取的发酵食醋原料配比为：

[0052] 酒醪：130kg/缸(酒度：9.6，总酸：4.4g/L)；麸皮：50kg/缸；大糠：24kg/缸；水：15kg/缸；NaCl：3kg/缸。

[0053] (2)传统食醋酿造过程

[0054] [1]向缸中加入130kg酒醪和50kg麸皮，搅拌混匀。

[0055] [2]向缸中加入8kg种醅。

[0056] [3]提热阶段：在醅上适当漂水，加糠，并进行翻醅，但并不往下切麸，等待品温上升至40℃以上。

[0057] [4]过杓阶段：提热结束后，根据品温，每天向下切麸、漂水、加糠、翻醅。过杓开始一两天后，开始分缸。在这一阶段，将水和糠全部添加完毕。

[0058] [5]露底阶段：过杓结束后，开始露底，即每天将已翻至底部的醋醅进行全部翻醅。同时每天测定下层卤汁中的卤酸，根据测定值，确定封醅日期。

[0059] [6]封醅阶段：露底结束后，将醋醅压实，上盖塑料膜，扎紧塑料膜边缘，然后在边缘处均匀撒上一层食盐。封醅持续时间为7天。

[0060] (3)强化策略

[0061] 对照组：按照本实施例(2)中的工艺发酵；

[0062] 高温菌Streptomyces sp.CCTCC NO:M 2017210菌粉强化组(即实验组)：是将本实施例中(2)[1]调整为：[1]向缸中加入130kg酒醪和50kg麸皮，搅拌混匀；将0.8-1％的Streptomyces sp.菌粉与原料混合均匀；其他工艺不变。

[0063] 实施例4：高温菌Streptomyces sp.CCTCC NO:M 2017210菌粉强化效果分析[0064] 加入Streptomyces sp.CCTCC NO:M 2017210后，总酸和还原糖均与对照组相差不多，采用HPLC方法对醋酸发酵过程醋醅中的18种氨基酸含量进行了分析，氨基酸的总量整体呈上升趋势(图1)；发酵4天后添加Streptomyces sp.CCTCC NO:M 2017210实验组的氨基酸总含量变化明显高于对照组；发酵12天时氨基酸的总含量达到最高为1413.83mg/100g干醅，相比对照组(1221.28mg/100g干醅)提高了14％，实验组中各类氨基酸的总含量也普遍高于对照组中氨基酸的含量(表1和表2)。

[0065] 表1对照组醋酸发酵过程中氨基酸的变化情况

[0066]mg/100g干醅 0d 2d 4d 6d 8d 10d 12d 14d 18d
天冬氨酸 29.01 50.68 54.82 59.79 70.32 75.91 85.21 82.69 78.17
谷氨酸 35.15 123.45 159.30 170.47 199.98 218.34 239.84 234.53 203.29丝氨酸 0.02 0.12 0.31 0.19 0.24 0.45 0.29 4.47 3.19
组氨酸 2.24 5.98 8.20 9.86 12.38 18.44 16.39 36.99 29.05
甘氨酸 13.33 30.19 38.19 38.14 43.57 46.99 51.99 50.01 47.76
酪氨酸 6.23 25.21 30.61 32.77 38.69 43.13 46.94 45.32 41.15
精氨酸 16.84 32.87 66.68 50.51 61.24 70.86 84.03 82.26 77.00
丙氨酸 23.50 85.36 108.89 114.31 140.83 157.31 178.78 181.21 154.83苏氨酸 4.34 18.05 25.11 27.82 33.19 34.46 38.78 34.33 31.90
胱氨酸 0.27 2.10 1.66 1.53 2.38 2.00 2.48 1.88 1.70
缬氨酸 18.17 59.69 71.07 75.42 88.71 98.59 111.37 107.88 96.14
蛋氨酸 4.37 15.81 18.92 21.02 24.65 26.08 28.44 26.01 20.81
苯丙氨酸 13.75 50.91 57.78 54.94 58.67 60.94 68.77 61.30 59.58
异亮氨酸 7.56 33.36 40.23 44.96 53.19 58.30 65.38 63.61 54.31
亮氨酸 24.72 100.74 129.42 129.89 151.57 164.12 184.02 176.95 158.10赖氨酸 8.20 8.02 11.09 8.89 12.01 14.36 18.57 19.99 18.56
脯氨酸 11.90 43.91 42.45 48.12 53.33 67.15 65.31 67.07 60.57

[0067] 表2 Streptomyces sp.的实验组醋酸发酵过程中氨基酸的变化情况[0068]

[0069] 此外，通过GC-MS方法分析醋酸发酵过程中醋醅的挥发性风味成分，在添加Streptomyces sp.CCTCC NO:M 2017210实验组和对照组中均检测到60种挥发性风味物质，添加Streptomyces sp.CCTCC NO:M 2017210实验组中挥发性物质的总含量为3144.27μg/100g干醅，相比于对照组(2413.28μg/100g干醅)提高了23％。酯类物质在实验组中的含量提高幅度相对较大，发酵结束时酯类的总含量为1656.94μg/100g干醅，相比于对照组(1197.65μg/100g干醅)提升了27.7％；羧酸类物质，实验组发酵结束时的含量为302.62μg/
100g，相比对照组提高了21％，其他类挥发性物质的总含量也有不同程度的提高(图2)。

[0070] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。