一种同时提高生物量和油脂含量的微藻异养培养方法

摘要

本发明提供了一种提高生物量和油脂含量的微藻培养方法，即在NO3‑‑N浓度为50mg/L，PO43‑‑P浓度为25～45mg/L，葡萄糖浓度为10g/L的条件下，异养培养微藻。6天后生物量可达到4.53g/L，油脂含量达到42.3％，与氮限制磷正常条件相比，生物量提高了1.9倍，与氮磷均正常的条件相比，油脂含量提高了1.7倍，并且油脂生产率达到310.0mg/(L·d)，C16和C18脂肪酸含量超过95％，因此，本发明的微藻培养方法可以显著同时提高微藻油脂的含量和产量，并且提高微藻制备的生物柴油的品质。

权利要求

1.一种同时提高生物量和油脂含量的微藻低氮异养培养方法，其特征在于，在氮限制与磷过量的条件下异养培养微藻，将外加的碳源直接转化为油脂储存在微藻细胞内，过量的磷以多聚磷酸酯的形式储存在微藻细胞中；

所述氮限制的条件为以NO3-离子计的N浓度为20～80mg/L；

所述磷过量的条件为以PO43-离子计的P浓度为45mg/L；

所述异养培养微藻的外加碳源为葡萄糖，葡萄糖的浓度为5～10g/L；

所述培养温度为25℃，黑暗条件下培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻为小球藻或其他富油微藻。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述小球藻的培养时间为5～8天。

4.一种根据权利要求3所述的方法培养获得的微藻，其特征在于，所述微藻的生物量达到4.53g/L，油脂含量达到42.3％，油脂产率达到310.0mg/(L·d)，C16和C18脂肪酸含量超过95％。

5.权利要求4所述的微藻在制备生物柴油中的应用。

说明书

一种同时提高生物量和油脂含量的微藻异养培养方法

技术领域

[0001] 本发明属于微藻培养领域，具体涉及一种同时提高生物量和油脂含量的微藻异养培养方法。

背景技术

[0002] 生物柴油是一种清洁的可再生能源，是石油、柴油的优质替代品，对经济的可持续发展、减缓环境压力、应对能源危机方面具有重要的战略意义。利用油料作物、油料林木制备生物柴油，由于植物生长周期长、占用耕地面积大，因此经济价值有限。微藻具有生长周期短、含油量高、不占用耕地的优点，是制备生物柴油的最佳原料，近年来，利用微藻制备生物柴油引起越来越多的关注。

[0003] 目前，关于微藻制备生物柴油的研究主要集中在提高油脂产量的方面，可以通过两种途径来实现：(1)提高微藻生长速率，也就是提高生物量；(2)提高微藻细胞内油脂含量。Breuer和Damiani等均发现氮缺乏的条件可以促进微藻细胞积累油脂，但是会明显影响微藻的正常生长，导致生物量大幅下降。添加葡萄糖作为碳源，可以显著提高微藻生长速率，短期内即可获得很大的生物量，但是微藻的异养培养并不能提高微藻细胞内的油脂含量。将氮缺乏与微藻异养培养相结合，仍然不能同时满足高生物量与高油脂含量的要求，说明氮缺乏条件可能并不是提高油脂含量的最佳方法，富油微藻的培养条件需要进一步优化。Raghothama等最新研究发现磷在微藻的生长、代谢、生物合成中具有重要作用，这部分研究工作在微藻培养方法的改进方面给了我们新的启示。

[0004] 现有的微藻培养方法，生物量和油脂含量两者不能兼顾。因此，需要根据已有的微藻培养现状及遇到的问题进行分析，探索新的培养方法，急需开发一种生物量快速增长、并且能够同时提高油脂含量的微藻培养方法，从而提高微藻制备生物柴油的经济效益，促进生物柴油的实际应用。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时提高生物量和油脂含量的微藻异养培养方法，即在氮限制与磷过量的条件下异养培养微藻，将外加的碳源直接转化为油脂储存在微藻细胞内，过量的磷以多聚磷酸酯的形式储存在微藻细胞中。

[0006] 优选地，本发明所述的同时提高生物量和油脂含量的微藻异养培养方法中，所述氮限制的条件为以NO3-离子计的N浓度为20～80mg/L。

[0007] 优选地，本发明所述的同时提高生物量和油脂含量的微藻异养培养方法中，所述磷过量的条件为以PO43-离子计的P浓度为25～45mg/L。

[0008] 优选地，本发明所述的同时提高生物量和油脂含量的微藻异养培养方法中，所述异养培养微藻的外加碳源为葡萄糖。

[0009] 优选地，本发明所述的同时提高生物量和油脂含量的微藻异养培养方法中，所述葡萄糖的浓度为5～10g/L。

[0010] 优选地，本发明所述的同时提高生物量和油脂含量的微藻异养培养方法中，所述微藻为小球藻或其他富油微藻。

[0011] 优选地，本发明所述的同时提高生物量和油脂含量的微藻异养培养方法中，所述小球藻的异养培养时间为5～8天。

[0012] 本发明的另一目的在于提供上述方法培养获得的微藻，所述微藻的生物量可达到4.53g/L，油脂含量达到42.3％，油脂产率达到310.0mg/(L·d)，C16和C18脂肪酸含量超过
95％。

[0013] 本发明的再一目的在于以上述方法培养的微藻为原料制备生物柴油。

[0014] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0015] 本发明同时提高生物量和油脂含量的微藻培养方法，是在NO3--N浓度为50mg/L，PO43--P浓度为25～45mg/L，葡萄糖浓度为10g/L的条件下，异养培养微藻。6天后生物量可达到4.53g/L，油脂含量达到42.3％，与氮限制磷正常条件相比，生物量提高了1.9倍，与氮磷均正常的条件相比，油脂含量提高了1.7倍，并且油脂产率达到310.0mg/(L·d)，C16和C18脂肪酸含量超过95％。因此，本发明的微藻培养方法可以显著同时提高微藻生物量和油脂含量，进而提高油脂产量，并且提高微藻制备生物柴油的品质。

具体实施方式

[0016] 下面将结合实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下实施例仅仅是本发明的部分而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0017] 实施例1

[0018] 以小球藻Chlorella regularis var.minima(C.regularis,FACHB-729，中国科学院淡水藻种库)作为培养对象，选用BG11培养基进行氮磷正常的条件异养培养，以NaNO3作为氮源，NO3--N浓度为240mg/L；以K3PO4作为磷源，PO43--P浓度为5.5mg/L；以葡萄糖作为碳源，浓度为10g/L。培养基需要121℃灭菌20分钟。在温度为25℃的黑暗条件下培养6天。

[0019] C.regularis生物量为4.73g/L，油脂含量为24.3％，油脂产生率为234.7mg/(L·d)，磷以磷酸单酯形态在胞内出现。具体测定方法如下：

[0020] 生物量测定方法：利用0.45μm的膜过滤，105℃烘干至恒重。用电子天平称量计算得到生物量数据。

[0021] 油脂含量测定方法：利用体积比为2:1的氯仿-甲醇溶液，在频率40KHz功率240W超声的条件下提取油脂。

[0022] 实施例2：

[0023] 以小球藻Chlorella regularis var.minima(C.regularis,FACHB-729，中国科学院淡水藻种库)作为培养对象，选用BG11培养基进行氮限制磷正常的条件异养培养，以NaNO3作为氮源，NO3--N浓度为50mg/L；以K3PO4作为磷源，PO43--P浓度为5.5mg/L；以葡萄糖作为碳源，浓度为10g/L。培养基需要121℃灭菌20分钟。在温度为25℃的黑暗条件下培养6天。

[0024] 小球藻C.regularis生物量为2.34g/L，油脂含量为27.9％，油脂产生率为120.9mg/(L·d)，磷以磷酸二酯形态在胞内出现。与氮磷正常的条件相比，氮限制导致生物量显著减少，仅为原来的49％，而油脂含量略有增加，为原来的1.1倍。

[0025] 实施例3：

[0026] 以小球藻Chlorella regularis var.minima(C.regularis,FACHB-729，中国科学院淡水藻种库)作为培养对象，选用BG11培养基进行氮限制磷正常的条件异养培养，以NaNO3作为氮源，NO3--N浓度为50mg/L；以K3PO4作为磷源，PO43--P浓度为25mg/L；以葡萄糖作为碳源，浓度为10g/L。培养基需要121℃灭菌20分钟。在温度为25℃的黑暗条件下培养6天。

[0027] 小球藻C.regularis生物量为3.67g/L，油脂含量为35.7％，油脂产生率为208.8mg/(L·d)，磷以磷酸二酯形态在胞内出现。

[0028] 生物量测定方法：利用0.45μm的膜过滤，105℃烘干至恒重。用电子天平称量计算得到生物量数据。

[0029] 油脂含量测定方法：利用体积比为2:1的氯仿-甲醇溶液，在频率40KHz功率240W超声的条件下提取油脂。

[0030] 与氮限制的条件相比，生物量提高了57.3％，而油脂含量为氮磷正常条件的1.5倍。

[0031] 实施例4：

[0032] 以小球藻Chlorella regularis var.minima(C.regularis,FACHB-729，中国科学院淡水藻种库)作为培养对象，选用BG11培养基进行氮限制磷过量的条件异养培养，以NaNO3作为氮源，NO3--N浓度为50mg/L；以K3PO4作为磷源，PO43--P浓度为45mg/L；以葡萄糖作为碳源，浓度为10g/L。培养基需要121℃灭菌20分钟。在温度为25℃的黑暗条件下培养6天。

[0033] 小球藻C.regularis生物量为4.53g/L，油脂含量为42.3％，油脂产生率为310.0mg/(L·d)，磷以多聚磷酸酯形态在胞内储存。

[0034] 生物量测定方法：利用0.45μm的膜过滤，105℃烘干至恒重。用电子天平称量计算得到生物量数据。

[0035] 油脂含量测定方法：利用体积比为2:1的氯仿-甲醇溶液，在频率40KHz功率240W超声的条件下提取油脂。

[0036] 与氮限制磷正常的条件相比，生物量明显增加，为原来的1.9倍；与氮磷正常的条件相比，油脂含量显著提高，增加至原来的1.7倍。油脂含量和油脂产率均为最高值，并且C16和C18脂肪酸含量达到99％，生物柴油品质得到提升。因此，氮限制磷过量与异养培养相结合是一种高效的微藻培养方法，可以同时满足微藻制备生物柴油对大生物量和高油脂含量的需求。

[0037] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。