富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法

摘要

本发明公开了富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法，利用磷酸纤维素为柱料，色谱柱运行缓冲液包含20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、300毫摩尔/升氯化钠和1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，洗脱液包含20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、1摩尔/升氯化钠和1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，实现对5种低丰度蛋白的同时富集。采用高效液相色谱联合高分辨质谱对富集后样品进行检测，可鉴定上述5种低丰度蛋白并进行定量分析。本发明方法的富集效果明显，方法简便，不需要使用昂贵的设备或耗材，成本低廉，便于推广和应用；不需要使用抗体，可以大大降低检测的费用，也可避免由于抗体质量稳定性问题带来的不确定性。

权利要求

1.富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法，所述5种低丰度蛋白为血管生成素、髓过氧化物酶、乳铁蛋白、脂质运载蛋白2、乙酰肝素酶，包括以下步骤：(1)将柱料装至离心管中，并向所述离心管中加入氢氧化钠和氯化钠的溶液对所述柱料进行碱处理，再向所述离心管中加入盐酸溶液对所述柱料进行酸处理；然后，向所述离心管中加入色谱柱运行缓冲液，悬浮所述柱料并静置后离心弃上清，重复多次；最后，向所述离心管中加入所述色谱柱运行缓冲液，悬浮所述柱料后装到空柱中，得到色谱柱并封闭其出口；

(2)按照每100微升血浆或血清对应5毫升色谱柱运行缓冲液的比例，用所述色谱柱运行缓冲液稀释血浆或血清，然后上样至所述色谱柱，孵育后，打开所述色谱柱出口使液面下降，待液面降至所述柱料时，加入所述色谱柱运行缓冲液清洗，重复清洗多次；

(3)向所述色谱柱中加入洗脱液，孵育后，打开所述色谱柱出口，收集洗脱组分；

其中，

所述柱料为磷酸纤维素；

所述色谱柱运行缓冲液包含20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、300毫摩尔/升氯化钠和1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，溶剂是超纯水，pH值为8.0；

所述洗脱液包含20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、1摩尔/升氯化钠和1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，溶剂是超纯水，pH值为8.0。

2.如权利要求1所述的富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述碱处理具体如下：①向装有1克磷酸纤维素柱料的50毫升离心管中加入50毫升含有0.05摩尔/升氢氧化钠和0.5摩尔/升氯化钠的溶液，晃动进行混合，浸泡5分钟；

②将所述离心管放入离心机在1000g离心1分钟，倒掉上清液；

③向所述离心管加入50毫升超纯水，悬浮所述柱料，放入离心机在1000g离心1分钟后测量上清液pH值，倒掉上清液；如果pH值小于10，结束碱处理进行下一步处理，否则，重复步骤③。

3.如权利要求2所述的富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酸处理具体如下：④向经所述碱处理后的装有柱料的离心管加入50毫升0.5摩尔/升盐酸，晃动进行混合，浸泡5分钟；

⑤将所述离心管放入离心机在1000g离心1分钟，倒掉上清液；

⑥向所述离心管加入50毫升超纯水，悬浮柱料，放入离心机在1000g离心1分钟后测量上清液pH值，倒掉上清液；如果pH值大于4，结束酸处理进行下一步处理，否则重复步骤⑥。

4.如权利要求1～3中任一项所述的富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述静置的时间为30分钟。

5.如权利要求1～3中任一项所述的富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述孵育的时间为30分钟。

6.如权利要求1～3中任一项所述的富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述孵育的时间为20分钟。

说明书

富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及血浆或血清中的低丰度蛋白的富集方法。

背景技术

[0002] 蛋白质组学能高通量地对蛋白质进行研究，可用于发现多种疾病诊断标志物和药物靶点。国际人类蛋白质组研究组织(Human Proteomic Organization,HUPO)早在2002年即启动了人类血浆蛋白质组计划(human plasma proteome project,HPPP)，其科学目标包括全面分析人类血浆和血清蛋白成分，确定不同人种血浆蛋白质的差异程度，以及确定不同生理和病理状态下的个体差异。然而，血浆蛋白质丰度差异巨大，血浆中21种主要高丰度及中等丰度的蛋白，如白蛋白、IgG、ɑ1抗胰蛋白酶、ɑ2巨球蛋白、转铁蛋白等占血浆总蛋白含量的99％以上，而其余的1％则由数千种低丰度甚至极低丰度的蛋白质组成。如白细胞介素6通常浓度范围在0～5ng/L，而白蛋白丰度为(35～50)×109ng/L，高低丰度蛋白含量可差1012之巨，远远超出了二维电泳(two-dimensional electrophoresis,2DE)及其他蛋白质组学技术所能测定的范围。

[0003] 人体组织器官发生病变时，来自病变组织或细胞的蛋白会进入到血液系统，这些蛋白质与机体的病理、生理状况密切相关，因此，对这些蛋白质进行检测和分析是发现与各种疾病相关生物标志物的最有价值样本之一，这些蛋白质包括不少低丰度蛋白，其蛋白浓度在ng/mL量级或更低。本发明中我们关注以下5种低丰度蛋白，这五种蛋白在血浆中的浓度都低于1μg/mL：

[0004] 1.血管生成素(angiogenin,ANG)：是一个由123个氨基酸组成的核酸酶，可刺激血管生成，在肿瘤发展中起着非常重要的作用，与神经退行性疾病也密切相关。

[0005] 2.髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)：是血红素过氧化物酶超家族成员之一，主要存在于髓系细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)的嗜苯胺蓝颗粒中。髓过氧化物酶的基因多态性与多种疾病的易感性有关，其表达水平的升高与患冠状动脉疾病易感性相关，还可以预测早期患心肌梗死的危险性。髓过氧化物酶与肺癌也存在相关性。

[0006] 3.乳铁蛋白(lactotranferrin,LTF)：是铁传递蛋白家族中的一种多功能糖蛋白，主要存在于各种分泌液中。乳铁蛋白具有抗菌和抗病毒的功能，是先天免疫系统的重要成员，还能与DNA、RNA和多糖分子相互作用，参与许多重要生理过程。有研究认为乳铁蛋白是潜在的卵巢癌早期诊断的生物标志物。

[0007] 4.脂质运载蛋白2(lipocalin 2,LCN2)：是一个在先天免疫中起重要作用的蛋白，中性粒细胞中有表达，在肾脏、前列腺、呼吸道和胃肠道中也有低水平的表达。在急性肾损伤发生时，血液和尿液中的LCN2浓度会迅速升高，因而LCN2可作为急性肾损伤的生物标志物。此外，在慢性肾病、肾移植等过程中也可以作为诊断标志物。

[0008] 5.乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)：可在细胞表面或细胞外基质中将硫酸乙酰肝素降解为短链多糖。此蛋白在肿瘤的生长、转移和血管生成中起着重要的作用，因而有研究认为乙酰肝素酶是潜在的肿瘤药物标靶。在乳腺癌、卵巢癌等很多种肿瘤中，HPSE表达上调，且与预后存在一定关联，是可能的肿瘤标志物。

[0009] 在临床检验实践中，这些低丰度蛋白较难检测，如何有效地检测和分析低丰度蛋白一直是分析科学领域具有挑战性的难题。

[0010] 目前，对于这些低丰度蛋白的定量分析主要通过依赖于抗体的技术如ELISA等来实现，这些方法的准确性主要由抗体的质量决定，而抗体质量容易受到多种因素的影响，这会造成测量结果的不稳定。此外这些基于抗体的方法价格都比较昂贵，当需要同时检测多个抗体时成本会进一步上升。

[0011] 质谱技术近年来取得了长足的发展，可以同时定量很多种蛋白，但用质谱技术对血浆或血清这类复杂生物样品进行直接分析也存在一些缺点，影响这一技术在临床检验中的应用。难点主要在两个方面：一方面，血浆或血清蛋白中的高、低丰度蛋白含量的差异巨大，如果不对血浆或血清样品做进一步的处理而直接进行常规质谱分析，低丰度蛋白的信号易被高丰度蛋白所掩盖，造成低丰度的目标蛋白无法被检测到，低丰度蛋白漏检率高；另一方面，用多维液相色谱、电泳预分离等方法以及通过免疫亲和技术剔除高丰度蛋白的预处理方法与质谱联用，虽然可以改善低丰度蛋白的检出几率，但是这些方法对仪器设备、操作技术有严格要求，费时费力或者需要用到昂贵的耗材，不易在实际应用中进行推广。

[0012] 因此，如何简便有效、成本低廉地去除血浆或血清中的高丰度蛋白和富集血浆或血清中的低丰度蛋白，是蛋白质组学的一项重要研究课题，更是实现低丰度蛋白的有效检测和分析的关键。

发明内容

[0013] 有鉴于此，本发明的目的在于提供富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法，无需依赖于抗体，即可简便有效、成本低廉地去除血浆或血清中的高丰度蛋白，从而实现对于血浆或血清中5种低丰度蛋白的同时富集。富集后，能够采用高效液相色谱联合高分辨质谱对这5种低丰度蛋白进行鉴定和定量分析。

[0014] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0015] 富集血浆或血清中5种低丰度蛋白的方法，所述5种低丰度蛋白为血管生成素、髓过氧化物酶、乳铁蛋白、脂质运载蛋白2、乙酰肝素酶，包括以下步骤：

[0016] (1)将柱料装至离心管中，并向所述离心管中加入氢氧化钠和氯化钠的溶液对所述柱料进行碱处理，再向所述离心管中加入盐酸溶液对所述柱料进行酸处理；然后，向所述离心管中加入色谱柱运行缓冲液，悬浮所述柱料并静置后离心弃上清，重复多次；最后，向所述离心管中加入所述色谱柱运行缓冲液，悬浮所述柱料后装到空柱中，得到色谱柱并封闭其出口；

[0017] (2)按照每100微升血浆或血清对应5毫升色谱柱运行缓冲液的比例，用所述色谱柱运行缓冲液稀释血浆或血清，然后上样至所述色谱柱，孵育后，打开所述色谱柱出口使液面下降，待液面降至所述柱料时，加入所述色谱柱运行缓冲液清洗，重复清洗多次；

[0018] (3)向所述色谱柱中加入洗脱液，孵育后，打开所述色谱柱出口，收集洗脱组分；

[0019] 其中，

[0020] 所述柱料为磷酸纤维素；

[0021] 所述色谱柱运行缓冲液包含20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、300毫摩尔/升氯化钠和1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，溶剂是超纯水，pH值为8.0；

[0022] 所述洗脱液包含20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、1摩尔/升氯化钠和1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，溶剂是超纯水，pH值为8.0。

[0023] 由上述富集方法得到的洗脱组分，采用高效液相色谱联合高分辨质谱进行检测，经过数据分析可鉴定所述5种低丰度蛋白，进一步，通过与未经富集的检测结果进行对比，可以明显看出：富集后的样品中所述5种低丰度蛋白的质谱图信号干净，无杂峰干扰，峰面积明显增强，可直接进行相对定量分析，说明上述方法对于所述5种低丰度蛋白的富集效果明显。

[0024] 在本发明的一个具体实施方式中，步骤(1)中，所述碱处理具体如下：

[0025] ①向装有1克磷酸纤维素柱料的50毫升离心管中加入50毫升含有0.05摩/升氢氧化钠和0.5摩尔/升氯化钠的溶液，晃动进行混合，浸泡5分钟；

[0026] ②将所述离心管放入离心机在1000g离心1分钟，倒掉上清液；

[0027] ③向所述离心管加入50毫升超纯水，悬浮所述柱料，放入离心机在1000g离心1分钟后测量上清液pH值，倒掉上清液，如果pH值小于10，结束碱处理进行下一步处理，否则，重复步骤③。

[0028] 在本发明的一个具体实施方式中，步骤(1)中，所述酸处理具体如下：

[0029] ④向经所述碱处理后的装有柱料的离心管加入50毫升0.5摩尔/升盐酸，晃动进行混合，浸泡5分钟；

[0030] ⑤将所述离心管放入离心机在1000g离心1分钟，倒掉上清液；

[0031] ⑥向所述离心管加入50毫升超纯水，悬浮柱料，放入离心机在1000g离心1分钟后测量上清液pH值，倒掉上清液；如果pH值大于4，结束酸处理进行下一步处理，否则重复步骤⑥。

[0032] 在本发明的一个具体实施方式中，步骤(1)中，所述静置的时间为30分钟。

[0033] 在本发明的一个具体实施方式中，步骤(2)中，所述孵育的时间为30分钟。

[0034] 在本发明的一个具体实施方式中，步骤(3)中，所述孵育的时间为20分钟。

[0035] 在本发明的一个具体实施方式中，所述柱料为磷酸纤维素粉末。

[0036] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

[0037] 本发明利用磷酸纤维素，可实现对于血浆或血清中多个低丰度蛋白的同时富集。采用液相色谱联合质谱对富集后样品进行检测，可鉴定这5种低丰度蛋白并进行相对定量分析。本发明富集效果显著，方法简便，不需要使用昂贵的设备或耗材，成本低廉，便于推广和应用。本发明的富集方法以及后续的检测过程中，均不需要使用抗体，可以大大降低检测的费用，也可去除由于抗体质量稳定性问题带来的不确定性。

附图说明

[0038] 图1A为对比例1和实施例1中富集前后的血浆样品中血管生成素的质谱图对比。

[0039] 图1B为对比例1和实施例1中富集前后的血浆样品中乳铁蛋白的质谱图对比。

[0040] 图1C为对比例1和实施例1中富集前后的血浆样品中髓过氧化物酶的质谱图对比。

[0041] 图1D为对比例1和实施例1中富集前后的血浆样品中脂质运载蛋白2的质谱图对比。

[0042] 图1E为对比例1和实施例1中富集前后的血浆样品中乙酰肝素酶的质谱图对比。

[0043] 图2A为对比例2和实施例2中富集前后的血清样品中血管生成素的质谱图对比。

[0044] 图2B为对比例2和实施例2中富集前后的血清样品中乳铁蛋白的质谱图对比。

[0045] 图2C为对比例2和实施例2中富集前后的血清样品中髓过氧化物酶的质谱图对比。

[0046] 图2D为对比例2和实施例2中富集前后的血清样品中脂质运载蛋白2的质谱图对比。

[0047] 图2E为对比例2和实施例2中富集前后的血清样品中乙酰肝素酶的质谱图对比。

具体实施方式

[0048] 为了更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例和附图，对本发明作进一步详细说明。应理解，下述的实施实例仅用于说明本发明，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

[0049] 以下实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购得的常规产品。

[0050] 实施例1血浆中5种低丰度蛋白的富集

[0051] (一)制备色谱柱

[0052] 称量所需的磷酸纤维素粉末作为柱料(0.5克柱料/1个样品×样品数)，将其分装至多个50毫升离心管(每个离心管中装有1克柱料)，并对每个离心管分别进行以下处理：

[0053] ①向离心管中加入50毫升含有0.05摩尔/升氢氧化钠和0.5摩尔/升氯化钠的溶液，晃动进行混合，浸泡5分钟；

[0054] ②将步骤①得到的离心管放入离心机在1000g离心1分钟，倒掉上清液；

[0055] ③向步骤②得到的离心管加入50毫升超纯水，悬浮柱料，放入离心机在1000g离心1分钟后测量上清液pH值，倒掉上清液，如果pH值小于10，可进行步骤④，否则，重复步骤③；

[0056] ④向步骤③得到的离心管加入50毫升0.5摩尔/升盐酸，晃动进行混合，浸泡5分钟；

[0057] ⑤将步骤④得到的离心管放入离心机在1000g离心1分钟，倒掉上清液；

[0058] ⑥向步骤⑤得到的离心管加入50毫升超纯水，悬浮柱料，放入离心机在1000g离心1分钟后测量上清液pH值，倒掉上清液；如果pH值大于4，可进行步骤⑦，否则重复步骤⑥；

[0059] ⑦向步骤⑥得到的离心管中加入50毫升色谱柱运行缓冲液，重新悬浮柱料，静置30分钟后，放入离心机在1000g离心1分钟，倒掉上清液；重复步骤⑦两次；

[0060] 色谱柱运行缓冲液包含20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、300毫摩尔/升氯化钠和1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，溶剂是超纯水，pH值为8.0；

[0061] ⑧向步骤⑦得到的离心管中加入4毫升色谱柱运行缓冲液，悬浮柱料后分装到准备好的空柱子中，每管柱料分装至两个空柱(上海碧云天生物技术有限公司，规格为6mL)中，完成色谱柱的装柱。

[0062] (二)富集低丰度的目标蛋白

[0063] 按照5毫升色谱柱运行缓冲液/100微升血浆的比例，用10毫升色谱柱运行缓冲液稀释200微升血浆，上样至步骤(一)得到的一个装有柱料的色谱柱(出口已封闭)，孵育30分钟后，打开色谱柱出口使液面下降，液面降至柱料时，加入5毫升色谱柱运行缓冲液清洗，共清洗6～8次(共30～40毫升)；

[0064] 加入4毫升洗脱液，孵育20分钟后，打开色谱柱出口，收集洗脱组分，进行下一步分析或冷冻保存；洗脱液包含20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、1摩尔/升氯化钠和1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，溶剂是超纯水，pH值为8.0。

[0065] 采用高效液相色谱联合高分辨质谱对富集后样品(即洗脱组分)进行检测[0066] (1)吸取500μL洗脱组分样品到10K超滤离心管，13000rpm/min离心10分钟，去除滤过液，保留截留部分；再吸取500μL洗脱组分样品到10K超滤离心管，离心10分钟，去除滤过液，保留截留部分；一共重复4次，从而完成对共计2mL洗脱组分样品的浓缩，在10K超滤离心管中得到浓缩的洗脱组分样品；

[0067] (2)吸取200μL的浓度为50mmol/L的碳酸氢铵溶液到步骤(1)得到的10K超滤离心管，13000rpm/min离心10分钟，去除滤过液，保留截留部分；

[0068] (3)向步骤(2)得到的10K超滤离心管中加入二硫苏糖醇，使得终浓度为20mmol/L，60℃孵育20分钟；

[0069] (4)向步骤(3)得到的10K超滤离心管中加入碘乙酰氨，使得终浓度为50mmol/L，室温避光放置30分钟；

[0070] (5)吸取200μL浓度为50mmol/L的碳酸氢铵溶液到步骤(4)得到的10K超滤离心管，13000rpm/min离心10分钟，去除滤过液，保留截留部分；重复一次；

[0071] (6)向步骤(5)得到的10K超滤离心管中加入质谱级胰酶(例如Promega出品的trypsin gold)，使得终浓度为0.01μg/mL，并含有0.4％(w/v)脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,SDC)，37℃孵育12～16小时；

[0072] (7)加入100μL浓度为50mmol/L的碳酸氢铵溶液到步骤(6)得到的10K超滤管，13000rpm/min离心10分钟，收集超滤管截留的液体；加入0.5～1％(v/v)三氟乙酸混匀，
13000rpm/min离心10分钟，吸取截留的液体到新的1.5毫升离心管；使用C18吸头(Thermo pierce货号87784)脱盐后，采用真空浓缩仪干燥，用0.1(v/v)％甲酸重溶，13000rpm/min离心10分钟后，将上清部分转移到质谱上样管进行检测；

[0073] 质谱检测条件设置如下：

[0074] 使用Q-exactive质谱仪和EASY-nLC 1000UPLC system。液相采用60分钟梯度，流速为220nL/min，预柱用AcclaimR PepMap100column(100μm ID,2cm length,C18,5μm, )，分析柱用AcclaimR PepMap RSLC column(50μm ID,15cm length,C18,2μm, )。流动相A为0.1％FA(甲酸)水溶液，流动相B为0.1％FA乙腈溶液。

[0075] 质谱数据采集通过Xcalibur 2.2SP1软件操作，一级母离子扫描范围为350～2000m/z，分辨率为70000；选择信号排名前15的多肽进行碎裂，碎裂模式为HCD，能量为
27％。用Proteome Discoverer software(Version PD1.4,Thermo Scientific,USA)进行蛋白鉴定，Maxquant软件(Version 1.4.0.8)进行定量分析。

[0076] 对比例1

[0077] 不经过富集处理(即不经过制备色谱柱和富集低丰度蛋白的步骤)，直接采用高效液相色谱联合高分辨质谱对富集前样品检测，即：使用富集前的1微升血浆替代实施例1中的浓缩的洗脱组分样品(即，检测步骤中(1)所得的浓缩的洗脱组分样品)，用高效液相色谱联合高分辨质谱检测的其他条件相同。

[0078] 质谱检测结果

[0079] (1)由质谱检测结果可以明显看出：富集后，多种高丰度蛋白浓度显著降低，去除效果明显，例如：

[0080] SERPINA1(登录号为P01009的蛋白)，100微升血浆富集后的蛋白量与1微升未富集血浆中的蛋白量比例为0.0761；ORM1(登录号为P02763的蛋白)，100微升血浆富集后的蛋白量与1微升未富集血浆中的蛋白量比例为0.0702；A2M(登录号为P01023的蛋白)，100微升血浆富集后的蛋白量与1微升未富集血浆中的蛋白量比例为0.0809；TF(登录号为P02787的蛋白)，100微升血浆富集后的蛋白量与1微升未富集血浆中的蛋白量比例为0.0706；HP(登录号为P00738的蛋白)，100微升血浆富集后的蛋白量与1微升未富集血浆中的蛋白量比例为0.1561；APOA2(登录号为P02652的蛋白)，100微升血浆富集后的蛋白量与1微升未富集血浆中的蛋白量比例为0.3213；APOA1(登录号为P02647的蛋白)，100微升血浆富集后的蛋白量与1微升未富集血浆中的蛋白量比例为0.7349；IGHA1(登录号为P01876的蛋白)，100微升血浆富集后的蛋白量与1微升未富集血浆中的蛋白量比例为0.2400；IGHG2(登录号为P01859的蛋白)，100微升血浆富集后的蛋白量与1微升未富集血浆中的蛋白量比例为0.2775。富集样品的起始材料体积为未富集样品的100倍，而富集后这些高丰度蛋白的量少于未富集样品，说明去除的比例均为99％以上。

[0081] (2)由质谱检测结果可以明显看出：富集后，5种目标低丰度蛋白的富集效果显著，详见以下对于富集前后质谱图对比的分析和说明。

[0082] 图1A～1E依次分别为对比例1和实施例1中富集前后的血浆样品中血管生成素、乳铁蛋白、髓过氧化物酶、脂质运载蛋白2、乙酰肝素酶的质谱图对比，其中，Y轴给出信号的相对值，X轴为液相色谱的保留时间，NL给出图中最高峰的绝对值(对应相对值的100％)，Base Peak m/z是荷质比的范围，AA则给出峰面积。图1A～1E中各基峰(base peak)所对应的多肽列表如下：

[0083] 表1：各基峰(base peak)所对应的多肽列表

[0084]编号 多肽 m/z值 位置
SEQ ID NO：1 YCESIMR m/z＝479.70971 图1A
SEQ ID NO：2 ADAVTLDGGFIYEAGLAPYK m/z＝1036.02281 图1B
SEQ ID NO：3 IGLDLPALNMQR m/z＝670.87142 图1C
SEQ ID NO：4 SYPGLTSYLVR m/z＝628.33771 图1D
SEQ ID NO：5 FLILLGSPK m/z＝494.31553 图1E

[0085] 从图1A中可以看出，对比例1未经富集的血浆样品中血管生成素的质谱图上有多个峰，包括来自高丰度蛋白的干扰峰，显示信号较杂；而实施例1经过富集处理后的血浆样品中血管生成素的质谱图信号干净，无杂峰，而且NL值明显提升。

[0086] 从图1B中可以看出，对比例1未经富集的血浆样品中乳铁蛋白的质谱图上存在高丰度蛋白的干扰峰，使得目标蛋白信息被掩盖，而实施例1经过富集处理后的血浆样品中乳铁蛋白的质谱图信号干净，无杂峰，而且NL值高。

[0087] 从图1C中可以看出，对比例1未经富集的血浆样品中髓过氧化物酶的质谱图上有多个峰，包括来自高丰度蛋白的干扰峰，显示信号较杂；而实施例1经过富集处理后的血浆样品中髓过氧化物酶的质谱图信号干净，无杂峰，而且NL值明显提升。

[0088] 从图1D中可以看出，对比例1未经富集的血浆样品中脂质运载蛋白2的质谱图上有多个峰，包括来自高丰度蛋白的干扰峰，显示信号较杂；而实施例1经过富集处理后的血浆样品中脂质运载蛋白2的质谱图信号干净，无杂峰，而且NL值明显提升。

[0089] 从图1E中可以看出，对比例1未经富集的血浆样品中未检测到乙酰肝素酶的质谱峰，推测为乙酰肝素酶丰度低而被高丰度蛋白信号掩盖，而实施例1经过富集处理后的血浆样品中乙酰肝素酶能够被检测到，而且NL值高。

[0090] 由上述图1A～1E的结果可见，未经富集处理样品的质谱中的信号弱、或被掩盖、或来自高丰度蛋白的干扰信号较杂，富集处理后样品的质谱中信号干净，强度高，可进行相对定量检测，说明上述方法对于这五种蛋白有明显的富集效果。

[0091] 实施例2血清中5种低丰度蛋白的富集

[0092] 以血清样品替代实施例1中的血浆样品，其他条件与实施例1完全相同，对样品进行富集。

[0093] 再以与实施例1相同的方法，采用高效液相色谱联合高分辨质谱对富集后样品(即洗脱组分)检测。

[0094] 对比例2

[0095] 以血清样品替代对比例1中的血浆样品，其他条件与对比例1完全相同，对未富集的血清样品进行检测。

[0096] 质谱检测结果

[0097] (1)由质谱检测结果可以明显看出：富集后，多种高丰度蛋白浓度显著降低，去除效果明显。

[0098] (2)由质谱检测结果可以明显看出：富集后，5种目标低丰度蛋白的富集效果显著，详见以下对于富集前后质谱图对比的分析和说明。

[0099] 图2A～2E依次分别为对比例2和实施例2中富集前后的血清样品中血管生成素、乳铁蛋白、髓过氧化物酶、脂质运载蛋白2、乙酰肝素酶的质谱图对比，其中，Y轴给出信号的相对值，X轴为液相色谱的保留时间，NL给出图中最高峰的绝对值(对应相对值的100％)，Base Peak m/z是荷质比的范围，AA则给出峰面积。图2A～2E中各基峰(base peak)所对应的多肽列表如下：

[0100] 表2：各基峰(base peak)所对应的多肽列表

[0101]编号 多肽 m/z值 位置
SEQ ID NO：1 YCESIMR m/z＝479.70971 图2A
SEQ ID NO：2 ADAVTLDGGFIYEAGLAPYK m/z＝1036.02281 图2B
SEQ ID NO：3 IGLDLPALNMQR m/z＝670.87142 图2C
SEQ ID NO：4 SYPGLTSYLVR m/z＝628.33771 图2D
SEQ ID NO：5 FLILLGSPK m/z＝494.31553 图2E

[0102] 从图2A中可以看出，对比例2未经富集的血清样品中血管生成素的质谱图上存在干扰峰，显示信号较杂；而实施例2经过富集处理后的血清样品中血管生成素的质谱图信号干净，无杂峰，而且NL值明显提升。

[0103] 从图2B中可以看出，对比例2未经富集的血清样品中乳铁蛋白的质谱图上存在高丰度蛋白的干扰峰，使得目标蛋白信息被掩盖，而实施例2经过富集处理后的血清样品中乳铁蛋白的质谱图信号干净，无杂峰，而且NL值高。

[0104] 从图2C中可以看出，对比例2未经富集的血清样品中髓过氧化物酶的质谱图上存在高丰度蛋白的干扰峰，使得目标蛋白信息被掩盖，而实施例2经过富集处理后的血清样品中髓过氧化物酶的质谱图信号干净，无杂峰，而且NL值高。

[0105] 从图2D中可以看出，对比例2未经富集的血清样品中脂质运载蛋白2的质谱图上存在高丰度蛋白的干扰峰，使得目标蛋白信息被掩盖，而实施例2经过富集处理后的血清样品中脂质运载蛋白2的质谱图信号干净，无杂峰，而且NL值高。

[0106] 从图2E中可以看出，对比例2未经富集的血清样品中未检测到乙酰肝素酶的质谱峰，推测为乙酰肝素酶丰度低而被高丰度蛋白信号掩盖，而实施例2经过富集处理后的血清样品中乙酰肝素酶能够被检测到。

[0107] 由上述图2A～2E的结果可见，未经富集处理样品的质谱中的信号弱、被掩盖或来自高丰度蛋白的干扰信号较杂，富集处理后样品的质谱中信号干净，强度高，可进行相对定量检测，说明上述方法对于这五种蛋白有明显的富集效果。

[0108] 上述实施例中磷酸纤维素粉末作为阳离子交换柱柱料，其可以通过商业途径购买，如美国Sigma-Aldrich公司、美国Spectrum Chemical公司等。

[0109] 由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的方法以及原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理的情况下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。