微流体装置中测定阳性的区域的自动检测转让专利
申请号 : CN201580075782.8
文献号 : CN107206377B
文献日 : 2020-02-11
发明人 : 杜风雷
申请人 : 伯克利之光生命科技公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种在包括回路元件的微流体装置内检测测定阳性的测定区域以利用试剂测定感兴趣的分析物的自动化方法,所述微流体装置包括:微流体通道;以及
隔离围栏,所述隔离围栏包括具有单个开口的分离区域,以及连接区域,所述连接区域具有到所述微流体通道的近端开口和到所述分离区域的远端开口,其中所述隔离围栏的所述分离区域是所述微流体装置的未波及区域,所述方法包括:
至少部分地基于所述回路元件的尺寸自动地识别测定区域AAx,收集自动识别的所述测定区域AAx的一组数字图像Ii,其中,每组数字图像Ii包括图像I1到In,其中,n被定义为大于1的整数;
基于所述自动识别的测定区域AAx的所述组数字图像Ii,计算在全部或部分测定过程中的自动识别的测定区域AAx至少一个参数的变化率Δx;
将所述变化率Δx与阈值Δo进行比较;以及
如果Δx大于Δo,则确定所述自动识别的测定区域AAx是测定阳性的。
2.根据权利要求1所述的方法,其中至少部分地基于所述微流体通道的尺寸来识别所述自动识别的测定区域AAx。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述通道的所述尺寸包括所述通道的宽度。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中还至少部分地基于所述隔离围栏的尺寸识别所述自动识别的测定区域AAx。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述隔离围栏的所述尺寸包括所述隔离围栏的宽度和所述隔离围栏的长度。
6.根据权利要求4所述的方法,其中,至少部分地基于所述隔离围栏内的生物细胞的位置来识别所述自动识别的测定区域AAx。
7.根据权利要求6所述的方法,还包括检测所述隔离围栏内的所述生物细胞的所述位置。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中至少部分地基于所述测定是否是分泌物测定来识别所述自动识别的测定区域AAx。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中至少部分地基于所述测定中使用的所述试剂或分析物的特性来识别所述自动识别的测定区域AAx。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,还包括通过使包含所述试剂的流体介质流过所述微流体通道来引入用于测定感兴趣的分析物的试剂。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述试剂附着于珠粒。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述感兴趣的分析物从所述隔离围栏扩散至与所述隔离围栏相邻的所述微流体通道中。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述感兴趣的分析物与存在于所述微流体通道中的试剂反应以产生局部可检测反应。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述局部可检测反应能够与所述隔离围栏相关联。
15.根据权利要求4所述的方法,其中至少部分地基于附着于所述隔离围栏的一部分或所述通道的一部分的所述试剂或感兴趣的分析物的位置来识别所述自动识别的测定区域AAx。
16.根据权利要求15所述的方法,还包括通过使用结构化的光来促使光致聚合物网络的凝固,将所述试剂或分析物附着到所述隔离围栏的所述部分。
17.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中周期性地收集所述组数字图像Ii的数字图像。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,用于收集所述组数字图像Ii的数字图像的周期是每隔3到5分钟进行一次。
19.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述组数字图像Ii包括一组像素Pi,j,并且其中计算变化率Δx还包括确定所述组像素Pi,j或所述组像素Pi,j的子组的光强度值Li,j。
20.根据权利要求19所述的方法,其中确定像素Pi,j的光强度值Li,j包括从观察到的光强度水平Li,j(观察到的)减去光强度的背景水平Li,j(背景)。
21.根据权利要求20所述的方法,其中Li,j(背景)是在所述测定开始t=0时或所述测定刚要开始之前为同一像素Pj测量的所述光强度值。
22.根据权利要求20所述的方法,其中,Li,j(背景)是为控制区域观察的光强度值Lctr1。
23.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述组数字图像Ii包括一组像素Pi,j,其中变化率Δx是表示选自由Li,avg、σi、Li,min和Li,max构成的组中两个或更多个参数的变化率的向量或其它数学表达式,其中Li,avg是所述组像素Pi,j或所述组像素Pi,j的子组的平均光强度值、σi是所述组像素Pi,j或所述组像素Pi,j的子组的光强度值的标准偏差、Li,min是所述组像素Pi,j或所述组像素Pi,j的子组的最小光强度值、Li,max是所述组像素Pi,j或所述组像素Pi,j的子组的最大光强度值。
24.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述阈值Δo基于对应于k个不同测定区域AAx的变化率Δx的Δavg和标准偏差σo,其中,变化率Δx包括变化率Δ1到Δk,其中,k被定义为大于1的整数,并且Δavg是一组变化率Δx的平均变化率。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述阈值Δo等于Δavg+1.6σo。
26.一种存储用于执行根据权利要求1至25中任一项所述方法的非暂态机器可读指令的机器可读存储装置。
27.一种在包括回路元件的微流体装置内检测分析物的量的自动化方法,所述微流体装置包括:微流体通道;以及
隔离围栏,所述隔离围栏包括具有单个开口的分离区域,以及连接区域,所述连接区域具有到所述微流体通道的近端开口和到所述分离区域的远端开口,其中所述隔离围栏的所述分离区域是所述微流体装置的未波及区域,所述方法包括:
至少部分地基于所述回路元件的尺寸自动地识别测定区域AAx,收集自动识别的所述测定区域AAx的一组数字图像Ii,其中,每组数字图像Ii包括图像I1到In,其中,n被定义为大于1的整数;
基于所述自动识别的测定区域AAx的所述组数字图像Ii,计算在全部或部分测定过程中的变化率Δx;以及基于校准曲线,确定与所述变化率Δx相关联的分析物的量,其中所述校准曲线包括对应于已知浓度分析物的一个或多个变化率Δx。
28.根据权利要求27所述的方法,还包括确定对应于已知浓度的所述分析物的一个或多个变化率Δx。
29.根据权利要求28所述的方法,还包括:
收集与已知浓度的所述分析物相关联的一个或多个自动识别的测定区域AAx的一组或多组数字图像Ii;以及基于所述自动识别的测定区域AAx的所述一组或多组数字图像Ii,计算在全部或部分测定过程中的一个或多个变化率Δx。
30.一种存储用于执行根据权利要求27至29中任一项所述方法的非暂态机器可读指令的机器可读存储装置。
说明书 :
微流体装置中测定阳性的区域的自动检测
优先权,其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
背景技术
发明内容
述自动识别的测定区域AAx。所述自动化方法还包括:基于所述自动识别的测定区域AAx的所述组数字图像集Ii,计算在全部或部分测定过程中的变化率Δx。所述自动化方法还包括:将所述变化率Δx与阈值Δ°进行比较;以及如果Δx大于Δ°,则确定所述自动识别的测定区域AAx是测定阳性的。
施例中,所述隔离围栏的所述尺寸包括所述隔离围栏的宽度。在一些实施例中,所述隔离围栏的所述尺寸包括所述隔离围栏的长度。
析物的位置来识别所述自动识别的测定区域AAx。在一些实施例中,所述自动化方法包括通过使用结构化的光来促使光致聚合物网络的凝固,将所述试剂或分析物附着到所述隔离围
栏的所述部分。
像的周期是每隔3到5分钟进行一次。
阳性的测定区域的自动化方法。
识别的测定区域AAx。所述自动化方法还包括:基于所述自动识别的测定区域AAx的所述组数字图像Ii,计算在全部或部分测定过程中的变化率Δx。所述自动化方法还包括:基于校准曲线,确定与所述变化率Δx相关联的分析物的量,其中所述校准曲线包括对应于已知浓度分析物的一个或多个变化率Δx。
所述自动识别的测定区域AAy的所述一组或多组数字图像Ii(i=1至n),计算在全部或部分
测定过程中的一个或多个变化率Δx。
物的量的自动化方法。
附图说明
具体实施方式
750、500、250、200、150,100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2μL。在一些实施例中,微流体回路保持大约1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、
5-50、10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300μL的流体。
4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多个)。在一些实施例中,至少一个回路元件中的一个或多个(例如全部)被配置为保持以下体积的流体:大约100pL至1nL、100pL至2nL、
100pL至5nL、250pL至2nL、250pL至5nL、250pL至10nL、500pL至5nL、500pL至10nL、500pL至
15nL、750pL至10nL、750pL至15nL、750pL至20nL、1至10nL、1至15nL、1至20nL、1至25nL或1至
50nL。在其它实施例中,至少一个回路元件中的一个或多个(例如全部)被配置为保持以下
体积的流体:大约100至200nL、100至300nL、100至400nL、100至500nL、200至300nL、200至
400nL、200至500nL、200至600nL、200至700nL、250至400nL、250至500nL、250至600nL或250至750nL。
区域和分离区域。
Phospholipid Bilayer Nanodiscs,Mehotd Enzymol.,464:211-231(里奇等人(2009年),
磷脂双分子层奈米圆盘中的膜蛋白的重组,方法酶学,464:211-231)中描述的)等;或无生命微物体和生物微物体的组合(例如,附着于细胞的微珠、脂质体包覆微珠、脂质体包覆磁珠等)。这些珠还可以具有共价或非共价连接的其它部分/分子,诸如能够在测定中使用的
荧光标记、蛋白质,小分子信号传导部分、抗原或化学/生物物种。
度。
散,但在波及区域与未波及区域之间基本上没有介质的流动。微流体装置可因此被配置为
基本上使未波及区域与波及区域中的介质的流分离,同时使得在波及区域与未波及区域之
间仅能够进行扩散流体连通。例如,微流体装置的流动通道是波及区域的示例,而微流体装置的分离区域(下文将进一步详细描述)是未波及区域的示例。
中。多个生物微物体(例如,哺乳动物细胞,诸如人体细胞)可以针对特定特征而被选择并且被设置在未波及区域中。然后,其余样本材料可以从波及区域流出,并且测定材料可以流入到波及区域中。由于所选择的生物微物体在未波及区域中,因此所选择的生物微物体基本
上不受剩余样本材料的流出或测定材料的流入的影响。所选择的生物微物体可以允许产生
感兴趣的分析物,其可以从未波及区域扩散到波及区域中,其中感兴趣的分析物可以与测
定材料反应以产生局部可检测反应,每个局部可检测反应可以与特定的未波及区域相关
联。与检测到的反应相关联的任何未波及区域可以被分析以确定在未波及区域中的哪些生
物微物体(如果有的话)是感兴趣的分析物的足够生产者。
切除以提供微流体装置100的局部视图。微流体装置100通常包括具有流动路径106的微流
体回路120,流体介质180可以流动到该流动路径106中和/或流动通过微流体回路120,可选地携带一个或多个微物体(未示出)。虽然在图1中示出单个微流体回路120,但是合适的微
流体装置可以包括多个(例如,2或3)这种微流体回路。无论如何,微流体装置100可以被配置为纳流体装置。在图1所示的实施例中,微流体回路120包括多个微流量隔离围栏124、
126、128和130,其每个具有与流动路径106流体连通的一个或多个开口。如下文进一步讨论的,微流体隔离围栏包括已被优化用于即使当介质180流过流动路径106时,仍然保留微流
体装置(例如微流体装置100)中的微物体的各种特性和结构。然而,在描述上述之前,简要说明微流体装置100和系统150。
回路结构108上方。微流体回路结构108与支撑结构104和盖110一起,可以限定微流体回路
120的元件。
104可以位于微流体回路120的顶部,盖110可以位于微流体回路120的底部。无论如何,可以存在一个或多个端口107,其每个包括进入或流出围界102的通路。例如,通路包括阀、门、通孔等。如图所示,端口107是由微流体回路结构108中的间隙形成的通孔。然而,端口107可以位于围界102的其它组件(诸如盖110)中。图1中仅示出一个端口107,但是微流体回路120可以具有两个或更多个端口107。例如,可以存在用作流体进入微流体回路120的入口的第一
端口107,并且可以存在用作流体离开微流体回路120的出口的第二端口107。端口107用作
入口还是出口可以取决于流体流过流动路径106的方向。
组件(“PCBA”)。例如,半导体衬底可以安装在PCBA上。
材料116。框架114可以部分地或完全地包围微流体回路材料116。例如,框架114可以是基本上围绕微流体回路材料116的相对刚性结构。例如,框架114可以包括金属材料。
PDMS。在一些实施例中,盖110可以既包括刚性材料也包括可变形材料。例如,盖110的一个或多个部分(例如,位于隔离围栏124、126、128、130上方的一个或多个部分)可以包括与盖
110的刚性材料相交界的可变形材料。在一些实施例中,盖110还可以包括一个或多个电极。
该一个或多个电极可以包括导电氧化物,诸如氧化铟锡(ITO),其可以涂覆在玻璃或类似绝缘材料上。可替代地,该一个或多个电极可以是嵌入在可变形材料(诸如聚合物(例如
PDMS))中的柔性电极,诸如单壁纳米管、多壁纳米管、纳米线、导电纳米颗粒簇或其组合。已经在例如US2012/0325665(Chiou等人)中描述了可以用于微流体装置的柔性电极,其内容
通过引用并入本文。在一些实施例中,可以修改盖110(例如,通过调节向内朝向微流体回路
120的表面的全部或部分)来支持细胞粘附、生存能力(viability)和/或生长。这种修改可
以包括合成或天然聚合物的涂层。在一些实施例中,盖110和/或支撑结构104可以是透光
的。盖110还可以包括至少一种透气的材料(例如,PDMS或PPS)。
下,成像装置194还包括具有快速帧速率和/或高灵敏度的检测器(例如用于低光应用)。成
像装置194还可以包括用于将刺激性辐射和/或光束引导到微流体回路120中并收集从微流
体回路120(或其中包含的微物体)反射或发射的辐射和/或光束的机构。所发射的光束可以
在可见光谱中,并且可以例如包括荧光发射。所反射光束可以包括源自LED或诸如汞灯(例
如高压汞灯)或氙弧灯的宽光谱灯的发射的反射。如关于图3所讨论的,成像装置194还可以包括显微镜(或光学系统),其可以包括或可以不包括目镜。
(即相对于x轴和y轴为0°)、垂直取向(即相对于x轴和/或y轴为90°)或其间的任何取向。微
流体装置100(和微流体回路120)相对于轴的取向在本文中被称为微流体装置100(和微流
体回路120)的“倾斜”。例如,倾斜装置190可以使微流体装置100相对于x轴倾斜0.1°、0.2°、
0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、
40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°或其间的任何角度。水平取向(以及因此x轴和y轴)被定义为垂直于由重力限定的垂直轴。倾斜装置还可以将微流体装置100(和微流体
回路120)相对于x轴和/或y轴倾斜大于90°的角度,或者使微流体装置100(和微流体回路
120)相对于x轴或y轴倾斜180°,以便完全反转微流体装置100(和微流体回路120)。类似地,在一些实施例中,倾斜装置190围绕由流动路径106或微流体回路120的某些其它部分限定
的旋转轴来倾斜微流体装置100(和微流体回路120)。
将具有比流动路径中的物体高的重力势能)。如本文所用的术语“下方”表示在由重力限定的垂直轴上,流动路径106被定位为低于一个或多个隔离围栏(即,在流动路径106下方的隔离围栏中的物体将具有比流动路径中的物体低的重力势能)。
的贮液器。
体(未示出)和/或介质(例如,介质的液滴)的移动和/或选择;成像模块164,用于控制用来捕捉图像(例如,数字图像)的成像装置194(例如相机、显微镜、光源或其任何组合);以及倾斜模块166,用于控制倾斜装置190。控制设备152还可以包括其它模块168,用于控制、监测或执行关于微流体装置100的其它功能。如图所示,设备152还可以包括显示装置170和输
入/输出装置172。
可执行指令(例如,软件、固件、微码等)操作。可替代地地或另外地,控制模块156可以包括硬连线数字电路和/或模拟电路。可以类似地配置介质模块160、运动模块162、成像模块
164、倾斜模块166和/或其它模块168。因此,可以由如上配置的主控制器154、介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其它模块168中的一个或多个来实施本文所讨论的针对微流体装置100或任何其它微流体装置所执行的功能、过程、动作、行动或过程的步骤。类似地,主控制器154、介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其它模块168可以通信地耦接,以发送和接收本文讨论的任何功能、过程、动作、行动或步骤中所使用的数据。
动路径106中流体介质180的流动。例如,在一些实施例中,在倾斜模块166使倾斜装置190将微流体装置100倾斜到期望的倾斜角度之前,介质模块160阻止介质180在流动路径106中和
通过围界102的流动。
电晶体管)的激活,以选择和移动流动路径106和/或隔离围栏124、126、128、130中的微物体(未示出)和/或介质液滴(未示出)。
型的信息(例如,存在或不存在微物体、介质液滴、标记(诸如荧光标记等)的积聚)。使用由成像装置194捕捉的信息,成像模块164还可以计算微流体装置100内物体(例如,微物体、介质液滴)的位置和/或这些物体的运动速率。
块166与成像模块164通信地耦接,以接收描述微流体回路120中的微物体和/或介质液滴的
运动的数据。使用该数据,倾斜模块166可以调节微流体回路120的倾斜,以便调节微物体
和/或介质液滴在微流体回路120中移动的速率。倾斜模块166还可以使用该数据来迭代地
调节微物体和/或介质液滴在微流体回路120中的位置。
分离。在一些情形下,围栏124、126、128、130被配置为物理地圈住微流体回路120内的一个或多个微物体。根据本发明的隔离围栏可以包括各种形状、表面和特性,其利用DEP、OET、OEW和/或重力优化以被使用,下文将详细讨论和示出。
隔离围栏124、126、128和130各自包含不同的特性和形状,其可以提供有益于执行测定(例如培养和保留测定中使用的微物体)的一个或多个益处。在一些实施例中,微流体回路120
包括多个相同的微流体隔离围栏。在一些实施例中,微流体回路120包括多个微流体隔离围栏,其中两个或更多个隔离围栏包括不同的结构和/或特性。例如,隔离围栏可以提供关于执行测定方面不同的益处。
106和流体介质180流体连通的入口阀或端口107,由此流体介质180可以经由入口端口107
进入通道122。在一些情形下,流动路径106包括单个路径。在一些情形下,单个路径被布置为Z字形图案,使得流动路径106在交替的方向上穿过微流体装置100两次或更多次。
128、130的开口相对。在一些实施例中,捕集器132被配置为从流动路径106接收或捕捉单个微物体。在一些实施例中,捕集器132被配置为从流动路径106接收或捕捉多个微物体。在一些情形下,捕集器132包括基本上等于单个目标微物体的体积的体积。
132内的目标微物体的其它特性。在一些情形下,捕集器132相对于微流体隔离围栏的开口
对准并且位于通道122的相对侧上,使得当微流体装置100围绕平行于通道122的轴倾斜时,被捕集的微物体按照使得微物体落入隔离围栏的开口中的轨迹离开捕集器132。在一些情
形下,捕集器132包括小于目标微物体的侧通路134,以便有助于穿过捕集器132的流,从而增大在捕集器132中捕捉微物体的可能性。
防止隔离围栏(例如,隔离围栏124、126、128或130)内的微物体从隔离围栏移位。此外,在一些实施例中,使用DEP力,来从根据本发明的教导先前收集的隔离围栏中选择性地移除微物体。在一些实施例中,DEP力包括光电镊子(OET)力。
和/或隔离围栏的位置),以操纵、运输、分离和分类位于微流体回路120中的液滴。例如,在一些实施例中,将OEW力施加到支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置,以将单个
液滴从流动路径106转移到期望的微流体隔离围栏中。在一些实施例中,使用OEW力来防止
隔离围栏(例如,隔离围栏124、126、128或130)内的液滴从隔离围栏移位。另外,在一些实施例中,使用OEW力来从根据本发明的教导先前收集的隔离围栏中选择性地移除液滴。
上,并且重力可以将微物体和/或液滴运输到围栏。在一些实施例中,可以在施加其它力之前施加DEP和/或OEW力。在其它实施例中,可以在施加其它力之后施加DEP和/或OEW力。在其它情况下,可以在施加其它力的同时施加DEP和/或OEW力,或者可以交替地施加DEP和/或
OEW力和其它力。
置,包括具有光电镊子(OET)配置的装置和具有光电润湿(OEW)配置的装置。在以下美国专
利文献中示出合适的OET配置的示例,其均通过引用整体并入本文:美国专利第RE 44,711
号(Wu等人)(最初以美国专利号7,612,355发布);和美国专利第7,956,339号(Ohta等人)。
美国专利第6,958,132号(Chiou等人)和美国专利申请公布第2012/0024708号(Chiou等人)
中示出了OEW配置的示例,上述两者都通过引用整体并入本文。光学致动的动电装置的另一个示例包括组合的OET/OEW配置,在美国专利公布20150306598号(Khandros等人)和
20150306599(Khandros等人)以及其对应的PCT公布WO2015/164846和WO2015/164847中示
出其示例,其通过引用整体并入本文。
有各种运动配置,这取决于被移动物体的类型和其它考量。例如,可以利用介电泳(DEP)配置来选择和移动微流体回路中的微物体。因此,微流体装置100的支撑结构104和/或盖110
可以包括DEP配置,用于选择性地在微流体回路120中的流体介质180中的微物体上诱导DEP
力,从而选择、捕捉和/或移动单个微物体或微物体组。可替代地,微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括电润湿(EW)配置,用于在微流体回路120中的流体介质180中的
液滴上选择性地诱导EW力,从而选择、捕捉和/或移动单个液滴或液滴组。
截面图和顶截面图,应当理解,区域/腔室202可以是具有更详细结构的流体回路元件的一
部分,诸如生长腔室、隔离围栏、流动区域或流动通道。此外,微流体装置200可以包括其它流体回路元件。例如,微流体装置200可以包括多个生长腔室或隔离围栏和/或一个或多个
流动区域或流动通道,诸如本文关于微流体装置100所述的那些。DEP配置可以被并入微流
体装置200的任何这种流体回路元件,或选择其一部分。还应当理解的是,上述或下文描述的微流体装置组件和系统组件中的任何一个可以被并入微流体装置200中和/或与微流体
装置200结合使用。例如,包括上述控制和监测设备152的系统150可以与微流体装置200一
起使用,该系统150包括介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和其它模块
168中的一个或多个。
隔开。顶部电极210和电极活化基底206限定区域/腔室202的相对表面。因此,包含在区域/腔室202中的介质180在顶部电极210与电极活化基底206之间提供电阻连接。还示出了电源
212,其被配置为被连接到底部电极204和顶部电极210并且在这些电极之间产生偏置电压,如在区域/腔室202中产生DEP力所需要的。例如,电源212可以是交流(AC)电源。
配置的微流体装置的区域214被称为“DEP电极区域”。)如图2B所示,指向电极活化基底206的内表面208的光图案222可以照亮以诸如正方形的图案选择的DEP电极区域214a(以白色
示出)。在下文中将未照射的DEP电极区域214(交叉阴影线)称为“暗”DEP电极区域214。通过DEP电极活化基底206的相对电阻抗(即,从底部电极204直到与流动区域106中介质180相交
界的电极活化基底206的内表面208)大于通过每个暗DEP电极区域214处的区域/腔室202中
的介质180的相对电阻抗(即,从电极活化基底206的内表面208到盖110的顶部电极210)。然而,照亮的DEP电极区域214a表现出通过电极活化基底206的减小的相对阻抗,其小于通过
每个照亮的DEP电极区域214a处的区域/腔室202中介质180的相对阻抗。
中附近微物体(未示出)的局部DEP力。因此,可以通过改变从光源220投射到微流体装置200的光图案222,在区域/腔室202的内表面处的许多不同的这种DEP电极区域214处选择性地
激活和去激活吸引或排斥流体介质180中微物体的DEP电极。DEP力吸引还是排斥附近的微
物体可以取决于诸如电源212的频率和介质180和/或微物体(未示出)的介电特性的这种参
数。
或移动光图案222来反复改变照亮的/激活的DEP电极区域214的图案。
100*(氢原子数)/(氢和硅原子的总数)计算)。a-Si:H层可以具有约500nm至约2.0μm的厚
度。在这样的实施例中,可以根据光图案222,在电极活化基底206的内表面208上的任何地方以任何图案来形成DEP电极区域214。因此,无需固定DEP电极区域214的数量和图案,而是可以将其对应于光图案222。已经在例如美国专利第RE 44,711号(Wu等人)(最初发布为美
国专利第7,612,355号)中描述了具有包括上述光电导层的DEP配置的微流体装置的示例,
其全部内容通过引用并入本文。
206可以包括多个光电晶体管,包括例如横向双极光电晶体管,每个光电晶体管对应于DEP
电极区域214。可替代地,电极活化基底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如导电金属电极),每个这种电极对应于DEP电极区域214。电极活化基底206可以包括这种光电
晶体管或光电晶体管控制电极的图案。例如,该图案可以是排列成行和列的基本上正方形
的光电晶体管或光电晶体管控制电极的阵列,如图2B所示。可替代地,图案可以是形成六方点格的基本上六边形的光电晶体管或光电晶体管控制电极的阵列。不管何种图案,电路元
件可以在电极活化基底206的内表面208处的DEP电极区域214与底部电极210之间形成电连
接,并且可以由光图案222选择性地激活和去激活那些电连接(即光电晶体管或电极)。当未被激活时,每个电连接可以具有高阻抗,使得通过电极活化基底206的相对阻抗(即,从底部电极204到与区域/腔室202中介质180相交界的电极活化基底206的内表面208)大于在相应
DEP电极区域214处通过介质180的相对阻抗(即,从电极活化基底206的内表面208到盖110
的顶部电极210)。然而,当由光图案222中的光激活时,通过电极活化基底206的相对阻抗小于在每个照亮的DEP电极区域214处通过介质180的相对阻抗,从而在相应DEP电极区域214
处激活DEP电极,如上所述。因此,可以按照光图案222确定的方式,在区域/腔室202中电极活化基底206的内表面208处的许多不同DEP电极区域214处选择性地激活和去激活吸引和
排斥介质180中的微物体(未示出)的DEP电极。
其全部内容通过引用并入本文。在例如美国专利公布第214/0124370号(Short等)中已经描
述了具有包括由光电晶体管开关控制的电极的电极活化基底的微流体装置的示例(参见例
如各个附图所示的装置200、400、500、600和900以及其说明书),其全部内容通过引用并入本文。
的一部分。区域/腔室202可以在第一壁与第二壁之间。在其它实施例中,电极210是第二壁(或支撑结构104)的一部分,并且电极活化基底206和/或电极210中的一个或两个是第一壁
(或盖110)的一部分。此外,光源220可以替代地用于从下方照亮围界102。
室202中选择介质180中的微物体(未示出)。然后运动模块162可以通过相对于装置200移动
光图案222以激活在DEP电极区域214处的第二组一个或多个DEP电极,来移动捕捉到的微物
体。可替代地,可以相对于光图案222来移动装置200。
极的表面(例如,盖110)相对的选择性可寻址和可激励电极。可以选择性地打开和闭合开关(例如,半导体衬底中的晶体管开关),以激活或去激活DEP电极区域214处的DEP电极,从而在激活的DEP电极附近的区域/腔室202中的微物体(未示出)上形成净DEP力。取决于诸如电
源212的频率和区域/腔室202中介质(未示出)和/或微物体的介电特性的特征,DEP力可以
吸引或排斥附近的微物体。通过选择性地激活和去激活一组DEP电极(例如,在形成正方形
图案224的一组DEP电极区域214处),可以在区域/腔室202内捕集和移动区域/腔室202中的
一个或多个微物体。图1中的运动模块162可以控制这种开关,从而激活和去激活各个DEP电极,以选择、捕集和移动区域/腔室202周围的特殊微物体(未示出)。具有包括选择性可寻址和可激励电极的DEP配置的微流体装置在本领域中是已知的,并且已经在例如美国专利第
6,294,063号(Becker等人)和第6,942,776号(Medoro))中描述,其全部内容通过引用并入
本文。
104具有夹在介电层(未示出)与底部电极204之间的电极活化基底206。介电层可以包括疏
水材料和/或可以涂覆有疏水材料。对于具有EW配置的微流体装置200,支撑结构104的内表面208是介电层或其疏水涂层的内表面。
(例如,氧化铝或氧化铪))的层。在一些实施例中,介电层可以包括除金属氧化物之外的介电材料,诸如硅的氧化物或氮化物。无论确切的组分和厚度如何,介电层可以具有约10kΩ至约50kΩ的阻抗。
可以共价接合到介电层的表面。例如,可以通过连接基团(诸如硅氧烷基团、膦酸基团或硫醇基团)将疏水材料的分子共价结合到介电层的表面。因此,在一些实施例中,疏水材料可以包括烷基封端的硅氧烷、烷基封端的膦酸或烷基封端的硫醇。烷基可以是长链烃(例如,具有至少10个碳的链,或至少16、18、20、22或更多个碳的链)。可替代地,可以使用氟化(或全氟化)碳链代替烷基。因此,例如,疏水材料可以包含氟代烷基封端的硅氧烷、氟代烷基封端的膦酸或氟代烷基封端的硫醇。在一些实施例中,疏水涂层具有约10nm至约50nm的厚度。
在其它实施例中,疏水涂层具有小于10nm(例如,小于5nm、或约1.5至3.0nm)的厚度。
以包括以支撑结构104的方式夹在介电层与顶部电极210之间的电极活化基底206。电极活
化基底206和盖110的介电层可以具有与电极活化基底206和支撑结构104的介电层相同的
组分和/或尺寸。因此,微流体装置200可以具有两个电润湿表面。
人)(其全部内容通过引用并入本文)公开了具有诸如a-Si:H的光电导材料的光电润湿配
置,而上述参引的美国专利公布第2204/0124370号(Short等人)公开了具有由光电晶体管
开关控制的电极的电极活化基底。
EW电极可以在支撑结构104的内表面208(即,覆盖介电层或其疏水涂层的内表面)处产生电
润湿力。通过改变入射到电极活化基底206上的光图案222(或相对于光源220移动微流体装
置200),可以移动与支撑结构104的内表面208接触的液滴(例如,含有水介质、溶液或溶剂)穿过存在于区域/腔室202中的不混溶流体(例如,油介质)。
阵列,如图2B所示。可替代地,图案可以是形成六边点格的基本上六边形EW电极的阵列。不管何种图案,可以通过电开关(例如半导体衬底中的晶体管开关)选择性地激活(或去激活)
EW电极。通过选择性地激活和去激活电极活化基底206中的EW电极,可以在区域/腔室202内移动与覆盖的介电层或其疏水涂层的内表面208相接触的液滴(未示出)。图1中的运动模块
162可以控制这样的开关,从而激活和去激活各个EW电极,以选择并移动区域/腔室202周围的特殊液滴。具有包括选择性寻址和可激励电极的EWOD配置的微流体装置在本领域中是已
知的,并且已经在例如美国专利第8,685,344号(Sundarsan等人)中进行了描述,其全部内
容通过引用并入本文。
源192的组件。电源212可以被配置为向顶部电极210和底部电极204提供AC电压和/或电流。
对于AC电压,如上所述,电源212可以提供足以产生足够强大以捕集和移动区域/腔室202中各个微物体(未示出)的净DEP力(或电润湿力)的频率范围和平均或峰值功率(例如,电压或
电流)范围,和/或还如上所述,电源212可以提供足以改变区域/腔室202中支撑结构104的
内表面208(即介电层和/或介电层上的疏水涂层)的润湿特性的频率范围和平均或峰值功
率(例如,电压或电流)范围。这种频率范围和平均或峰值功率范围是本领域已知的。例如,参见美国专利第6,958,132号(Chiou等人)、美国专利第RE44,711号(Wu等人)(最初发布为
美国专利第7,612,355号)和美国专利申请公布第US2014/0124370号(Short等人)、US2015/
0306598(Khandros等人)和US2015/0306599(Khandros等人)。
258和将分离区域258流体上连接到通道122的连接区域254。连接区域254可以包括到通道
122的近端开口252以及到分离区域258的远端开口256。连接区域254可以被配置为使得从
通道122流入隔离围栏244、246、248的流体介质(未示出)流动的最大穿透深度不延伸到分
离区域258。因此,由于连接区域254,因此,布置在隔离围栏244、246、248的分离区域258中的微物体(未示出)或其它材料(未示出)可以与通道122中的介质180的流动分离并且基本
上不受其影响。
240包含流体介质180,则可以选择性地产生和停止通道122中的流体介质180的流260。例
如,如图所示,端口242可以布置在通道122的不同位置(例如,相对端)处,并且可以从用作入口的一个端口242到用作出口的另一端口242形成介质的流260。
区域258中的微物体270与二次流262分离,隔离围栏244的连接区域254的长度Lcon(即,从近端开口252到远端开口256)应该大于二次流262进入到连接区域254的穿透深度Dp。二次流
262的穿透深度Dp取决于在通道122中流动的流体介质180的速度、以及与通道122的配置相
关的各种参数、以及到通道122的连接区域254的近端开口252。对于给定的微流体装置,通道122和开口252的配置将是固定的,而通道122中流体介质180的流260速率将是可变的。因此,对于每个隔离围栏244,可以识别通道122中流体介质180流260的最大速度Vmax,确保二次流262的穿透深度Dp不超过连接区域254的长度Lcon。只要通道122中流体介质180的流260速率不超过最大速度Vmax,则所得到的二次流262可以被限制到通道122和连接区域254并保持在分离区域258之外。因此,通道122中的介质180的流260将不会把微物体270拖拽出分离区域258。相反,位于分离区域258中的微物体270将停留在分离区域258中,而不管通道122中流体介质180的流260。
域258。使得连接区域254的长度Lcon大于二次流262的最大穿透深度Dp,可以因此防止一个隔离围栏244被来自通道122或另一个隔离围栏(例如,图2D中的隔离围栏246、248)的混杂
颗粒污染。
122经过连接区域254并进入到分离区域258中的第二流体介质280)与分离区域258中的第
二流体介质280混合。类似地,分离区域258中第二介质280的组分(未示出)可以基本上仅通过第二介质280的组分扩散(从分离区域258经过连接区域254并进入到通道122中的第一介
质180)与通道122中的第一介质180混合。第一介质180可以是与第二介质280相同或不同的
介质。此外,第一介质180和第二介质280可以在开始时是相同的,然后变得不同(例如,通过由分离区域258中的一个或多个细胞来调节第二介质280,或者通过改变流过通道122的介
质180)。
积);和连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon(或横截面积);通道122中流体介质180的流260的速度V;第一介质180和/或第二介质280的粘度等。
上垂直于介质180的流260;连接区域254在开口252处的宽度Wcon(或横截面积)可以基本上
平行于通道122中介质180的流260;和/或连接区域的长度Lcon可以基本上垂直于通道122中介质180的流260。前述仅仅是示例,并且通道122和隔离围栏244、246、248的相对位置可以是相对于彼此的其它取向。
252处的宽度Wcon所标识的范围。可替代地,连接区域254在远端开口256处的宽度Wcon可以大于连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon。
256之间变窄。例如,使用各种不同的几何形状(例如,斜切连接区域、使连接区域成斜面),连接区域254可以在近端开口与远端开口之间变窄。此外,连接区域254的任何部分或子部
分(例如,连接区域与近端开口252相邻的一部分)可以变窄。
50-150微米、50-100微米、70-500微米、70-400微米、70-300微米、70-250微米、70-200微米、
70-150微米、90-400微米、90-300微米、90-250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100-150微米和100-120微米。上述仅仅是示例,并且通道
122的宽度Wch可以在其它范围内(例如,由上面列出的任何端点限定的范围)。此外,通道122的Wch可以被选择为通道在除了隔离围栏的近端开口之外的区域中的任何一个范围。
200,000至约2,000,000平方微米。在一些实施例中,连接区域具有与对应的隔离围栏的横
截面高度相匹配的横截面高度。在一些实施例中,连接区域具有约50至约500微米、或约100至约300微米的横截面宽度。
80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。上述仅仅是示例,并且通道122的高度Hch可以在其它范围内(例如,由上述任何端点限定的范围)。通道122的高度Hch可以被选择为通道在除了隔离围栏的近端开口之外的区域中的任何一个范围。
000平方微米、500-20,000平方微米、500-15,000平方微米、500-10,000平方微米、500-7,
500平方微米、500-5,000平方微米、1,000-25,000平方微米、1,000-20,000平方微米、1,
000-15,000平方微米、1,000-10,000平方微米、1,000-7,500平方微米、1,000-5,000平方微米、2,000-20,000平方微米、2,000-15,000平方微米、2,000-10,000平方微米、2,000-7,500平方微米、2,000-6,000平方微米、3,000-20,000平方微米、3,000-15,000平方微米、3,000-
10,000平方微米、3,000-7,500平方微米、或3,000至6,000平方微米。上述仅仅是示例,并且通道122在近端开口252处的横截面积可以在其它范围内(例如,由上述任何端点限定的范
围)。
40-60微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、50-80微米、60-200微米、
60-150微米、60-100微米、60-80微米、70-150微米、70-100微米和80-100微米。上述仅仅是示例,并且连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon可以不同于前述示例(例如,由上面列出的任何端点限定的范围)。
15微米、4-10微米、4-7微米、4-5微米、5-15微米、5-10微米、5-7微米、6-15微米、6-10微米、
6-7微米、7-15微米、7-10微米、8-15微米和8-10微米。上述仅仅是示例,并且连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon可以不同于前述示例(例如,由上面列出的任何端点限定的范
围)。
4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或更大。上述仅仅是示例,并且连接区域254的长度Lcon与连接区域254在近端开口252处的宽度Wcon之比可以与上述示例不同。
可以是例如至少3×10、6×10 、9×10、1×10、2×10 、4×10、8×10、1×10、2×10 、4×
105、8×105、1×106、2×106、4×106、6×106立方微米或或更大。在具有隔离围栏的微流体装置的各种实施例中,隔离围栏的体积可以是约5×103、7×103、1×104、3×104、5×104、8×
104、1×105、2×105、4×105、6×105、8×105、1×106、2×106、4×106、8×106、1×107、3×107、
7 7
5×10或约8×10立方微米或更大。在一些实施例中,微流体装置具有其中可以维持不超过
1×102个生物细胞的隔离围栏,并且隔离围栏的体积可以不超过2×106立方微米。在一些实
施例中,微流体装置具有其中可以维持不超过1×102个生物细胞的隔离围栏,并且隔离围
栏可以不超过4×105立方微米。在其它实施例中,微流体装置具有其中可以维持不超过50
个生物细胞的隔离围栏,隔离围栏可以不超过4×105立方微米。
1500个隔离围栏、约1000至约2000个隔离围栏、或约1000至约3500个隔离围栏。
2500至约4000个隔离围栏、约3000至约4500个隔离围栏、约3500至约5000个隔离围栏、约
4000至约5500个隔离围栏、约4500至约6000个隔离围栏、约5000至约6500个隔离围栏、约
5500至约7000个隔离围栏、约6000至约7500个隔离围栏、约6500至约8000个隔离围栏、约
7000至约8500个隔离围栏、约7500至约9000个隔离围栏、约8000至约9500个隔离围栏、约
8500至约10,000个隔离围栏、约9000至约10,500个隔离围栏、约9500至约11,000个隔离围
栏、约10,000至约11,500个隔离围栏、约10,500至约12,000个隔离围栏、约11,000至约12,
500个隔离围栏、约11,500至约13,000个隔离围栏、约12,000至约13,500个隔离围栏、约12,
500至约14,000个隔离围栏、约13,000至约14,500个隔离围栏、约13,500至约15,000个隔离围栏、约14,000至约15,500个隔离围栏、约14,500至约16,000个隔离围栏、约15,000至约
16,500个隔离围栏、约15,500至约17,000个隔离围栏、约16,000至约17,500个隔离围栏、约
16,500至约18,000个隔离围栏、约17,000至约18,500个隔离围栏、约17,500至约19,000个
隔离围栏、约18,000至约19,500个隔离围栏、约18,500至约20,000个隔离围栏、约19,000至约20,500个隔离围栏、约19,500至约21,000个隔离围栏、or约20,000至约21,500个隔离围
栏。
同的通道122和四个不同的流动路径106。微流体装置290还包括通到每个通道122的多个隔
离围栏。在图2F所示的微流体装置中,隔离围栏具有类似于图2E所示围栏的几何形状,因此具有连接区域和分离区域。因此,微流体回路120既包括波及区域(例如,通道122和在二次流262的最大穿透深度Dp内的连接区域254的部分)也包括非波及区域(例如,分离区域258
和不在二次流262的最大穿透深度Dp内的连接区域254的部分)。
体装置360的电连接的插座302。巢300还可以包括集成的电信号生成子系统304。集成的电
信号生成子系统304可以被配置为向插座302提供偏置电压,使得当插座302保持微插流器
装置360时,在微插流器装置360中的一对电极两端施加偏置电压。因此,电信号生成子系统
304可以是电源192的一部分。将偏置电压施加到微流体装置360的能力并不意味着当插座
302保持微流体装置360时会一直施加偏置电压。相反,在大多数情况下,将间歇地施加偏置电压,例如,仅在需要在微流体装置360中便于生成动电力(例如介电泳或电润湿)时,才施加偏置电压。
插座302。
路(未示出)。示波器(如果有的话)可以被配置为测量由插座302保持的提供给微流体装置
360的波形。在一些实施例中,示波器测量在接近微流体装置360(和远离波形发生器)位置
处的波形,从而确保更准确地测量实际施加到装置的波形。例如,从示波器测量值获得的数据可以被提供为对波形发生器的反馈,并且波形发生器可以被配置为基于这种反馈来调节
其输出。Red PitayaTM是一个合适的组合式波形发生器和示波器的示例。
NanoTM。控制器308可以用于执行功能和分析,或者可以与外部主控制器154(图1所示)进行通信以执行功能和分析。在图3A所示的实施例中,控制器308通过接口310(例如,插头或连接器)与主控制器154通信。
TM
Pitaya 单元产生的波形放大并且将放大的电压传送给微流体装置100。在一些实施例中,
Red PitayaTM单元被配置为测量微流体装置360处的放大电压,然后根据需要调节其自身的输出电压,使得在微流体装置360处测量到的电压是期望值。在一些实施例中,波形放大电路可以具有由安装在PCBA 320上的一对DC-DC转换器产生的+6.5V至-6.5V的电源,从而在
微流体装置360处产生高达13Vpp的信号。
Peltier热电装置(未示出)和冷却单元(未示出)。Peltier热电装置可以具有被配置为与微
流体装置360的至少一个表面相交界的第一表面。例如,冷却单元可以是冷却块(未示出),诸如液体冷却铝块。Peltier热电装置的第二表面(例如,与第一表面相对的表面)可以被配置为与这种冷却块的表面交界。冷却块可以被连接到流体路径330,流体路径330被配置为
通过冷却块循环冷却的流体。在图3A所示的实施例中,支撑结构300包括入口332和出口
334,以从外部贮液器(未示出)接收冷却的流体,将冷却的流体引入流体路径330并通过冷
却块,然后将冷却的流体返回到外部贮液器。在一些实施例中,Peltier热电装置、冷却单元和/或流体路径330可以安装在支撑结构300的壳体340上。在一些实施例中,热控制子系统
306被配置为调整Peltier热电装置的温度,以便实现微流体装置360的目标温度。例如,可以通过诸如PololuTM热电电源(Pololu Robotics and Electronics Corp.(Pololu
Robotic和Electronics公司))的热电电源来实现Peltier热电装置的温度调整。热控制子
系统306可以包括反馈电路,诸如由模拟电路提供的温度值。可替代地,可以由数字电路提供反馈电路。
入。例如,来自PID控制环路算法的输出可以驱动PololuTM马达驱动器(未示出)上的定向和脉冲宽度调制的信号引脚,以致动热电电源,从而控制Peltier热电装置。
信。以这种方式,除了其他方面之外,主控制器154可以通过执行用于输出电压调节的缩放计算,以辅助电信号生成子系统308。通过耦接到外部主控制器154的显示装置170提供的图形用户界面(GUI)(图3C中示出其一个示例)可以被配置为绘制分别从热控制子系统306和
电信号生成子系统308获得的温度和波形数据。可替代地或另外地,GUI可以允许更新控制
器308、热控制子系统306和电信号生成子系统304。
(MSA),其中任一个可以被配置为接收来自光源402光并将接收到的光的一部分发送到显微
镜400的光具组中。可替代地,光调制子系统404可以包括产生其自身光的装置(因此无需光源402),诸如有机发光二极管显示器(OLED)、硅基液晶(LCOS)器件、铁电硅基液晶(FLCOS)或透射液晶显示器(LCD)。例如,光调制子系统404可以是投影仪。因此,光调制子系统404能够发射结构化的光和非结构化的光。合适的光调制子系统404的一个示例是来自Andor
TechnologiesTM的MosaicTM系统。在一些实施例中,系统150的成像模块164和/或运动模块
162可以控制光调制子系统404。
和光调制子系统404可以是显微镜400的集成组件。
聚焦在一个或多个检测器422上。显微镜的光具组还可以包括用于不同检测器的不同管透
镜(未示出),使得每个检测器上的最终放大率可以不同。
光,并且第二光源432可以用于提供亮视场照明。在这些实施例中,运动模块162可以用于控制第一光源404,并且成像模块164可以用于控制第二光源432。显微镜400的光具组可以被
配置为(1)从光调制子系统404接收结构化的光,并且当该装置被支撑结构200保持时,将结构化的光聚焦在微流体装置(诸如光学致动的动电装置)中的至少第一区域上,以及(2)接
收从微流体装置反射和/或发射的光并将这种反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到检
测器422上。光具组还可以被配置为从第二光源接收非结构化的光,并且当该装置被支撑结构300保持时,将非结构化的光聚焦在微流体装置的至少第二区域上。在一些实施例中,微流体装置的第一和第二区域可以是重叠区域。例如,第一区域可以是第二区域的一部分。
具组。来自光调制子系统404的结构化光和来自第二光源432的非结构化光通过光具组一起
从分束器436行进到达第二分束器(或二向色滤光器406,取决于光调制子系统404提供的
光),其中光通过物镜408向下反射到样本平面412。然后来自样本平面412的被反射和/或发射的光通过物镜408、通过分束器和/或二向色滤光器406返回至另一个二向色滤光器424。
到达二向色滤光器424的仅仅一部分光穿过并到达检测器422。
任何波长时,对来自光调制子系统404的光的这种滤除才算完成(如图所示)。在实践中,如果来自光调制子系统404的光包括短于495nm的波长(例如,蓝色波长),则来自光调制子系
统的一些光将穿过滤波器424以到达检测器422。在这种实施例中,滤波器424作用为改变从第一光源402和第二光源432到达检测器422的光量之间的平衡。如果第一光源402明显强于
第二光源402,则这是有益的。在其它实施例中,第二光源432可以发射红光,并且二向色滤光器424可以滤除除了红光之外的可见光(例如,波长短于650nm的可见光)。
(i=1到n),其中n是大于1的正整数。在一些实施例中,该方法包括自动识别(例如,选择)微流体装置中的测定区域。通常,将基于从成像装置194(未示出)接收到的数据,由成像模块
164、介质模块160、运动模块162、倾斜模块166、其它模块168和/或主控制器154来执行测定阳性的区域的自动检测。然而,如本领域技术人员所理解的,可以由任何模块或子模块执行测定阳性的区域的自动识别中涉及的任何步骤。
地,可以通过使包含试剂的介质流动通过微流体回路的通道来引入用于各种测定的试剂
(例如荧光团或抗体)。如上文关于图2E所讨论的,隔离围栏和通道(单独地并且相对于彼
此)的形状和尺寸可以影响蛋白质和试剂在物理上位于微流体回路内的位置,并因此影响
待测定的装置的区域。
如,通道)的形状和尺寸、流动路径中流体介质的速度、流体介质的粘度和/或流体介质内聚合剂的存在、测定中测量的的分析物的物理和化学性质(例如抗体或分泌蛋白)、测定中使
用的试剂的物理和化学性质、测定中使用的试剂或分析物的物理位置、被测定的细胞数量
(即单个细胞或克隆群体的细胞)和/或由测定中使用的分析物和/或试剂产生的噪音和背
景的量。下面参考图4、图5和图6详细描述这些方法。
择)至少部分延伸到接近隔离围栏的开口的通道522的区域中的测定区域570、572。也可以
基于隔离围栏内的微物体530(例如细胞)的位置来识别测定区域570、572。例如,如图所示,可以选择测定区域570、572,使得它们包含微物体530在隔离围栏526、528中的位置。在2015年12月8日提交的美国序列申请第14/963230号(Du)和2015年12月8日提交的相应国际申请
第PCT/US2015/064575号中讨论了通过自动识别微物体来确定微物体的位置的计算方法;
每个申请的全部内容通过引用并入本文。除了这些方法之外,还可以基于其它信息(诸如将微物体加载到围栏中的方法(例如通过重力或OET),以及在微物体是细胞的情形下,细胞在围栏中培养的持续时间和/或细胞类型)来估计微物体在围栏中的位置。因此,取决于如上
所述的其它参数,自动识别的测定区域570、572可以至少部分地位于隔离围栏526、528靠近通道522的区域(例如,隔离围栏的近端开口和/或隔离围栏的连接区域或其近端部分)。在
一些情形下,隔离围栏526、528中自动识别的测定区域570、572的深度将部分地基于流入隔离围栏526、528的连接区域560、562的二次流(未示出)的最大穿透深度Dp。如上所述,二次流的最大穿透深度Dp可以基于许多因素,包括隔离围栏526、528和通道522的近端开口的尺寸(例如,宽度)、流体介质的粘度以及流体介质沿着流动路径506移动时的速度。图4A还示出与自动识别的测定区域570、572相关联的示例性控制区域Lctr1 540、542。下面将详细讨论使用控制区域来量化测定区域的变化率。
定区域。图4B示出完全位于与包含生物微物体556的隔离围栏526相邻的通道522内的、具有截断圆形的示例性自动识别的测定区域574。另外,图4B示出具有蘑菇状的自动识别的测定区域576,其包括截断圆形的测定区域574,并且还部分地延伸到包含生物微物体556的隔离围栏528的连接区域中。测定区域574、576的半圆形状或蘑菇形状延伸到通道522的程度可
以基于许多因素,诸如分泌的分析物的扩散速率、流体介质580的粘度、通道522和/或隔离围栏526、528的尺寸和/或分泌分析物的生物微物体556的物理位置。
率。图4C分别示出对应于第一时间点(T1)和第二时间点(T2)的两个蘑菇状的测定区域578、
597。对应于第二时间点(T2)的蘑菇状测定区域579比对应于第一时间点(T1)的蘑菇状测定
区域578延伸到通道522的更大部分,以说明试剂或分析物在第一时间点和第二时间点之间
的时间段内的扩散速率。
或通道的一部分)的分析物或试剂(“附着的分析物或试剂”)。在这些情形下,成像模块可以基于指定附着分析物的位置的数据来自动识别测定区域。在一些情形下,可以使用聚合物
网络将分析物或试剂附着到微流体装置的特定部分(例如,通道的一部分或隔离围栏)。例
如,可以使用结构化的光,通过光诱导的聚合/交联反应来产生包含试剂或分析物的聚合物的局部网络,其中光诱导的聚合/交联反应通过将聚合物交联到网络中来固化聚合物。局部聚合物网络可以减慢试剂和/或分析物的扩散速率,从而将试剂和分析物维持为非常靠近
聚合物网络,以便优化测定(例如通过集中测定信号)。在这些实施例中,成像模块164与运动模块162通信,以发送指定微流体装置发生聚合/交联的部分的信息。然后,成像模块164使用该区域来自动识别至少部分对应于所得聚合物网络的位置的测定区域。
流体回路材料的部分)。
通常,以周期性方式收集图像,周期取决于测定。在一些实施例中,取决于分泌物的速率和密度和/或测定信号产生的速率,可以每分钟、每2分钟、每3分钟、每4分钟、每5分钟等拍摄特定的自动识别的测定区域的图像。在一些实施例中,该测定是抗原结合测定,并且每3至5分钟拍摄一次图像。
或更小(例如,4、3、2、1平方微米或更小)的微流体装置中的区域。
素Pj相关联的光强度值。可替代地,Li,j(背景)可以是Lcon,微流体装置的控制区域的光强度值(即,微流体装置中不期望测定产生阳性信号的区域)。例如,控制区域Lcon可以是隔离围栏中不存在任何微物体的的区域。因此,例如,对于两个或更多个选择的测定区域而言,控制区域Lcon可以相同。可替代地,每个选择的测定区域可以与其自身的控制区域Lcon相关联。
例如,控制区域Lcon可以是隔离围栏526、528中远离通道522和/或与通道522中的任何流体介质180分离的区域(例如,使得来自通道522的二次流的最大穿透深度Dp不延伸到控制区
域Lcon中),诸如控制区域Lcon 540、542、544、546、548、549中的任何一个。
值的分布,如上所述。在一些实施例中,可以将根据一组图像中的每个图像确定的参数彼此进行比较。因此,本发明的方法还可以包括在全部或部分测定过程中(即,在该组n个图像Ii(i=1到n)的两个或更多个不同图像Ii之间)计算所选择的测定区域AAx的至少一个参数的
变化率Δx。在一些实施例中,该至少一个参数选自由Li,avg、σi、Li,min和Li,max构成的组。在一些实施例中,Δx是表示两个或更多个这种参数的变化率的向量或其它数学表达式。
区域上并行执行该方法的一些步骤,而可以连续地执行其它步骤。无论如何,对于一组k个自动识别的测定区域,可以为每个自动识别的测定区域AAx确定Δx。在一些实施例中,自动识别的测定区域AAx(x=1至k)的大小、形状和相对位置(即相对于隔离围栏)可以保持恒
定。在其它实施例中,自动识别的测定区域AAx(x=1至k)的大小、形状和相对位置可以根据不同的参数而不同。例如,自动识别的测定区域的大小、形状和相对位置可以根据以下因素而不同,诸如细胞的位置或不同已知浓度的分析物(其用于产生校准曲线,以确定实验条件下分析物的量)。
整数。因此,在该方法的一些实施例中,可以确定对应于一组k个自动识别的测定区域AAx(x=1至k)的变化率Δx的平均变化率Δavg。在一些实施例中,可以确定一组k个自动识别的测定区域AAx(x=1至k)的变化率Δx的标准偏差σ°。在一些实施例中,可以使用对应于一组k个自动识别的测定区域AAx(x=1至k)的一组值Δx来生成校准曲线,其中每个值Δx与待测定
的已知浓度的分析物相关联。
平均变化率Δavg和标准偏差σ°。例如,阈值Δ°可以是Δavg+1.6σ°。可替代地,阈值Δ°可以是Δavg+2.0σ°、Δavg+3.0σ°、Δavg+4.0σ°等。在使用校准曲线的实施例中,可以为具有相同已知浓度的待测定分析物的每组自动识别的测定区域AAx计算平均变化率Δx。可以对每组
图像迭代地执行上述图像分析的所有方法,以从该组自动识别的测定区域中确定最佳测定
区域。
执行下面讨论的几个步骤。类似地,可以迭代地执行下面讨论的步骤。
164基于微流体回路120的图像来“动态地(on the fly)”计算信息,或者信息可以被预先指定(例如,基于某种类型的微流体回路120的已知尺寸和物理特性)并存储在存储器中。可以使用回路元件的尺寸对流体介质(诸如包含在测定中使用的试剂和分析物的介质)的流动
进行建模。可以使用各种程序和计算模型(例如 或 软件)对流动
进行建模。
中。可选地,在步骤604中,成像模块164可以检索指定测定持续时间的信息。
分析物的投影位置。例如,试剂和分析物的投影位置可以基于在微流体回路中(例如,在流动区域或通道中)流动的介质的二次流的最大穿透深度Dp和影响Dp的任何参数(例如,流动
路径中介质的速度、流动路径的宽度、到隔离围栏的开口宽度等)。类似地,在诸如细胞的生物微物体分泌分析物的情况下,分析物的位置可以基于生物微物体在回路元件(例如隔离
围栏)中的位置。任何上述值可以与分析物或试剂的物理和化学特征相结合,以进一步完善试剂和/或分析物的位置(或投影位置)。例如,从隔离围栏中的细胞分泌的分析物的位置可以基于分析物的已知扩散速率、隔离围栏的尺寸和介质的粘度。
包含分析物和/或试剂的聚合物网络在微流体回路120中的位置。在其它情况下,系统150的用户可以输入试剂和/或分析物的位置。在其它情况下,可以将试剂和/或分析物的位置预
定义并存储在存储器中(例如,用于标准化微流体装置上的已建立的工作流程)。
字化、背景减除、激发光场均匀性校正、热像素移除、图像噪声移除、定量图像值到绝对光水平变换和/或任何其它合适的变换来变换图像。在分析期间,成像模块164可以基于一组光
强度值和/或其它特性来迭代地完善或调节自动识别的测定区域AAx。例如,在一些情形下,成像模块164可以识别表示异常或离群数据的自动识别的测定区域AAx的区域,调节自动识
别的测定区域AAx来排除这些区域,并且重新确定该组光强度值。例如,在一些情形下,图像模块164可以拒绝具有强大但恒定光照水平的区域或拒绝由微粒移动过测定区域所引起的
短寿命亮区域。在一些情形下,成像模块164可以增大或扩展自动识别的测定区域AAx以包
括额外的像素。
和预定义的邻近组,来排除测定背景噪声并且产生用于测定的定量或绝对值。在成像模块
164产生绝对值的情形下,成像模块164可以将测定区域AAx的变化率Δx与预定阈值Δ°进行比较,以产生指定存在或不存在分析物的绝对值。在成像模块164产生相对值的情形下,成像模块164可以将测定区域AAx的变化率与校准曲线进行比较,以便确定用于测定的定量
值。通过确定与分析物的已知量(例如,一系列围栏,每个具有围栏中固定量的分析物)相关联的一组测定区域AAx的变化率Δx生成校准曲线。
AAx变化率Δx的绝对值。成像模块164使用测定区域AAx变化率Δx的绝对值来产生用于测定的定量或绝对值。
道的一部分中,可以加入被标记的抗原结合剂,并且可以自动评估被标记的抗原结合剂与
珠粒之间的关联,如上所述。被标记的抗原结合剂可以被结合至不同于珠粒上的抗原特异
性结合剂所结合的感兴趣的抗原的不同部分。已经在例如美国专利申请公布第US2015/
0151298号(Hobbs等人)和US2015/0165436(Chapman等人)中描述了微流体抗原检测测定
法,其内容通过引用整体并入本文。