一种研究独脚金内酯调控油菜根系生长的方法转让专利
申请号 : CN201710384347.4
文献号 : CN107211853B
文献日 : 2019-11-15
发明人 : 马霓 , 张丰琪 , 张春雷 , 万林
申请人 : 中国农业科学院油料作物研究所
摘要 :
本发明公开了一种研究独角金内酯调控油菜根系生长的方法，步骤是：（1）油菜种子乙醇中浸泡后用蒸馏水冲洗；（2）种子均匀摆放在湿滤纸的培养皿上，于恒温生长箱中光照下催芽；（3）取直径装满蒸馏水塑料杯，杯口覆盖纱布并浸湿在水中，在纱布上摆放催芽后的油菜籽，取生长整齐的菜苗固定在泡沫板上，于1/2霍格兰营养液中培养；（4）油菜移至不同浓度独脚金内酯溶液中生长，每天取样用根系扫描仪扫描；（5）处理油菜群体，筛选对独脚金内酯极度敏感和不敏感材料。方法易行，操作简便，更方便研究植株的形态，对根系无损伤，筛选出根系生长对独角金内酯敏感性不同的材料，为后续生理生化、分子生物学和育种学研究奠定了基础。
权利要求 :
1.一种研究独脚金内酯调控油菜根系生长的方法，其步骤是：(1)水培条件和独脚金内酯浓度：
A：选用中双11和中油杂12油菜种子，在70％体积比乙醇中浸泡10－15分钟后用蒸馏水冲洗5－7次；
B：种子均匀摆放在铺有2－3层湿滤纸的培养皿上，于22℃恒温生长箱中催芽2－3天，设置16小时光照，8小时黑暗处理，保持滤纸湿润；
C：取直径10厘米的塑料杯装满蒸馏水，杯口覆盖、固定纱布并浸湿在水中，在纱布上均匀摆放催芽后的油菜籽，每个塑料杯摆放50粒，3天后当下胚轴长2厘米，取生长整齐的菜苗固定在泡沫板上，每板24株苗，种植3盆即3次重复，于1/2霍格兰营养液中培养15天，每5－7天更换一次营养液；
D：配制0－18μM共7个浓度独脚金内酯溶液，油菜处理7天，每天取3株样品测定植株干鲜重，用根系扫描仪扫描根系生长指标，侧根数目，侧根长度、根系表面积和体积；
(2)根系生长对独脚金内酯不敏感材料筛选：
A：300份油菜自然群体材料种子分别消毒、催芽，3天后每份材料种植6盆，每盆24株，在
1/2霍格兰营养液中培养15天；
B：配制浓度为0.1-0.2μM独脚金内酯溶液，每份材料均在0μM和0.1-0.2μM独脚金内酯中生长，6盆材料分为2组，每组3盆；
C：生长7天后测定植株形态差异，每个重复取10株，测定根系长度、数目、表面积、体积、地上部和根系干鲜重指标，根据两个不同处理根系指标的差值确定对独脚金内酯敏感植株。
说明书 :
一种研究独脚金内酯调控油菜根系生长的方法
技术领域
[0001] 本发明属于农业生物技术领域，更具体涉及一种研究独脚金内酯调控油菜根系生长的方法，优化油菜种子萌发条件，通过分析不同浓度独脚金内酯对油菜根系生长的影响，筛选出最适合的处理浓度，以此处理不同来源的自然群体种子，筛选根系生长对独脚金内酯敏感和不敏感的突变体。该发明首次研究了独脚金内酯对油菜生长的影响，为植物激素敏感差异材料的筛选提供了技术和方法参考。
背景技术
[0002] 作物产量生理是通过两个生理过程形成的，即吸收作用和光合作用(刘晓冰等，2010)。作物地上部有效分枝、叶片等形成冠层，影响光能的吸收和同化物的分配(Hammer et al.,2009；Brunel-Muguet et al.,2013)；根系是土壤系统最重要的生物学成分，是影响产量形成的重要器官，根系形态决定植株获取土壤资源的能力。作物群体要维持地上茎、叶、花、果等器官所需要的水分和养分，必须有强大的根系和庞大的吸收面积(杨建昌，
2011)。油菜是我国主要的油料作物，冬前营养体的生长对春后产量紧密相关。本专利的目标是(1)获得新材料用于高产机理和育种研究；(2)获得加速油菜苗期营养体生长，特别是形成发达的根系，促进油菜高产的研究方法。
2011)。油菜是我国主要的油料作物，冬前营养体的生长对春后产量紧密相关。本专利的目标是(1)获得新材料用于高产机理和育种研究；(2)获得加速油菜苗期营养体生长，特别是形成发达的根系，促进油菜高产的研究方法。
[0003] 植物激素具有用量少，见效快的特点，对植株生长发育、器官建成、产量形成等具有重要的作用。独脚金内酯(strigolactones,SLs)是一种产生于植物根部的类胡萝卜素衍生物,具有刺激寄生植物种子萌发和促进丛枝菌根真菌菌丝分枝的作用(Xie et al.,2010；Foo and Reid,2013)。科学家通过对拟南芥和水稻等模式植物的研究，发现独脚金内酯通过抑制侧芽的生长在株型建成中发挥关键调控作用(Gemez-Roldan et al.,2008；
Elizabeth et al.,2009；Jiao et al.,2010)，独脚金内酯也调控根系发育和构型(Kapulnik et al.,2014)，通过信号转导协调地上和地下部植株生长(Koltai 2011；
Koltai and Beveridge,2013)。
Elizabeth et al.,2009；Jiao et al.,2010)，独脚金内酯也调控根系发育和构型(Kapulnik et al.,2014)，通过信号转导协调地上和地下部植株生长(Koltai 2011；
Koltai and Beveridge,2013)。
[0004] 前期研究存在两个问题：其一，与水稻、拟南芥等模式植物相比，油菜是异源四倍体，得到突变体比较困难；其二，国内外缺乏独脚金内酯调控油菜生长的技术资料，尚没有和本专利相似的创造突变体的技术或文献。本团队成员经过4年的研究，获得了独脚金内酯调控油菜生长的技术资料，优化了水培条件下油菜根系生长对独脚金内酯响应的最适合浓度，并筛选了遗传背景丰富的油菜自然群体，获得了突变体材料，所以，该技术具有独创性，先进性，为后续遗传学、生理学、分子生物学研究提供了材料基础，也为作物新材料选育提供了新途径。
发明内容
[0005] 本发明的目的是在于提供了一种研究独脚金内酯调控油菜根系生长的方法，方法易行，操作简便，包括油菜种子前处理，霍格兰营养液培养条件的优化，独脚金内酯对油菜生长特性影响分析，浓度优化，根系生长敏感和不敏感材料的筛选。和土壤栽培相比，水培方法更方便研究植株的形态，特别是对根系无损伤，可进行扫描分析其生长动态，利用该技术筛选出根系生长对独脚金内酯敏感性不同的材料，为后续生理生化、分子生物学和育种学研究奠定了基础。
[0006] 为了实现上述的目的，本发明通过以下技术方案来实现：
[0007] 其技术构思是：具体操作分三步：水培条件和独脚金内酯浓度优化，筛选根系生长对独脚金内酯不敏感材料，新材料验证。每一过程都有清楚详细的步骤，提高了筛选效率和成功率。
[0008] 一种研究独脚金内酯调控油菜根系生长的方法，其步骤是：
[0009] (1)水培条件和独脚金内酯浓度优化：
[0010] A：选用中双11和中油杂12油菜种子，在70％(体积比，以下相同)乙醇中浸泡10－15分钟后用蒸馏水冲洗5－7次；
[0011] B：种子均匀摆放在铺有2－3层湿滤纸的培养皿上，于22℃恒温生长箱中催芽2－3天，设置16小时光照，8小时黑暗处理，保持滤纸湿润；
[0012] C：取直径约10厘米的塑料杯装满蒸馏水，杯口覆盖、固定纱布并浸湿在水中，在纱布上均匀摆放催芽后的油菜籽，每个塑料杯摆放约50粒，3天后当下胚轴长约2厘米时，取生长整齐的菜苗固定在泡沫板上，每板24株苗，种植3盆即3次重复，于1/2霍格兰营养液中培养15天左右，每5－7天更换一次营养液；
[0013] D：配制0－18μM共7个浓度独脚金内酯溶液，油菜处理7天，每天取3株样品测定植株干鲜重，用根系扫描仪扫描根系生长指标，如侧根数目，侧根长度、根系表面积和体积,扫描仪型号为WinRHIZO 2009software(Regent Company,Canada)；
[0014] (2)根系生长对独脚金内酯不敏感材料筛选：
[0015] A：300份油菜自然群体材料种子分别消毒、催芽，3天后每份材料种植6盆，每盆24株，在1/2霍格兰营养液中培养15天；
[0016] B：配制浓度为0.1-0.2μM独脚金内酯溶液，每份材料均在0μM和0.1-0.2μM独脚金内酯中生长，6盆材料分为2组，每组3盆(3个重复)；
[0017] C：由于生长7天后植株形态差异最大，每个重复取10株，测定根系形态指标，地上部和根系干鲜重，根据0.1－0.2μM独脚金内酯和0μM(对照)处理组指标的差值确定对独脚金内酯敏感植株。
[0018] (3)根系生长差异材料的验证：
[0019] 选取两种处理下根系差异最明显和无差异材料各5-10份，用相同的处理进一步验证，选取极端材料。配制组合和F2群体，进行遗传学和育种学研究。该技术为新材料的选育提供了技术参考，也为植物激素调控研究建立了可靠的试验方法。
[0020] 所述的独脚金内酯(strigolactone,SL)最初是从棉花中分离鉴定出的独脚金(Striga spp.)种子萌发的信号物质。
[0021] 本发明阐明了不同浓度独脚金内酯对油菜生长特别是根系形态的影响；优选出调控油菜根系生长的最适浓度；筛选出对独脚金内酯极度敏感和不敏感的油菜材料。
[0022] 本技术发明，与土壤培养相比，能实现植株生长的实时监控和观察，特别是结合根系扫描技术，获得油菜根系形态指标数据；采用该技术实现植株生长条件精细调控，植株生长整齐，减少试验误差和工作量，准确筛选到根系生长差异材料。
[0023] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0024] (1)本发明中油菜水培方法和激素处理方法是本人及研究团队近年来的研究结果，有别于土培等试验方法，具有稳定性好，便于操作等特点，便于观察根系和地上部植株的生长，植物激素处理后易于吸收，减少试验误差。
[0025] (2)本发明中的独脚金内酯为近年来的研究热点，油菜是异源四倍体，与水稻、拟南芥等模式植物相比难以获得突变体，本发明获得材料可用于进行后续遗传学、育种学研究，发展了植物激素调控作物生长理论研究成果。
[0026] (3)独脚金内酯能抑制拟南芥根系生长，本研究结果与之相反，显示能促进油菜生长，增加根尖数、根系长度等指标，因此，本发明具有创新性，其促进增加绿色营养体生长的效果有助于在生产上提高春后油菜产量，因此为油菜高产栽培提供了理论依据和技术支撑。
附图说明
[0027] 图1为独脚金内酯对油菜根系生长的影响示意图。
[0028] 图1a中双11用0，1.8μM独脚金内酯处理7天后根系情况。左，0μM对照处理，右，1.8μM独脚金内酯处理。
[0029] 图1b中双11和中油杂12用0，1.8μM独脚金内酯处理7天后植株生长情况对比。表明SLs促进叶片和根系生长。左上，中双11号对照处理，右上，中双11号SLs处理；左下，中油杂12对照处理，右下，中油杂12SLs处理。
[0030] 图2为不同浓度SLs处理油菜根尖数和根系长度示意图。
[0031] 图2a 0－18μM 7种浓度独脚金内酯处理后油菜根系长度。SLs处理增加了根系长度，特别是0.018－1.8μM范围内根系长度显著增加，18μM抑制根系生长，但根系长度和数目仍高于对照。图2b 0-18μM7种浓度独脚金内酯处理后根尖数目变化趋势与根系长度相似。
[0032] 图3为不同浓度SLs处理后油菜地上和地下部分干鲜重示意图。
[0033] 图3a是不同浓度下地下部干重；图3b是地上部干重；图3c为根冠比。各指标干重都随着独脚金内酯浓度增加而增加，在0.018－1.8μM范围内达到显著水平，根冠比显著增加表明独脚金内酯对根系的影响大于地上部。
[0034] 图4为油菜自然群体材料苗期试验生长情况示意图。
具体实施方式
[0035] 本发明所用独脚金内酯为GR24，是一种以在独脚金内酯Strigol为框架的基础上人工合成的化学物质，独脚金内酯类似物中最有效的一个产品。本发明建立了水培方法研究外源植物激素调控油菜生长的实验技术，阐明了独脚金内酯对油菜根系生长的影响，优化了最适浓度，通过对油菜自然群体进行处理，筛选到不同遗传背景下根系生长对独脚金内酯敏感性具有差异的材料。
[0036] 实施例1：
[0037] 一种研究独脚金内酯调控油菜根系生长的方法，其步骤是：
[0038] (1)水培条件和独脚金内酯浓度优化：
[0039] A：选用中双11和中油杂12油菜种子，在70％(体积比)乙醇中浸泡10分钟后用蒸馏水冲洗6次；
[0040] B：种子均匀摆放在铺有3层湿滤纸的培养皿上，于22℃恒温生长箱中催芽2或3天，设置16小时光照，8小时黑暗处理，保持滤纸湿润；
[0041] C：取若干个直径约10厘米的塑料杯装满蒸馏水，杯口覆盖、固定纱布并浸湿在水中，在纱布上均匀摆放催芽后的油菜籽，3天后当下胚轴长约2厘米时，取生长整齐的菜苗固定在泡沫板上，每板24株苗，种植3盆即3次重复，于1/2霍格兰营养液中培养15天左右，每5或6或7天更换一次营养液；
[0042] D：配制0和0.00018μM和0.0018μM和0.018μM和0.18μM和1.8μM和18μM，共7个浓度独脚金内酯溶液，0表示常规1/2霍格兰营养液处理。油菜处理7天，每天取3株样品测定植株干鲜重，用根系扫描仪扫描根系生长指标，如侧根数目，侧根长度、根系表面积和体积,扫描仪型号为WinRHIZO 2009software(Regent Company,Canada)(图1-图3)；本发明中获得了对根系生长影响最大的浓度0.18μM。
[0043] (2)根系生长对独脚金内酯不敏感材料筛选：
[0044] A：300份油菜自然群体材料种子分别消毒、催芽，3天后每份材料种植6盆，每盆24株，在1/2霍格兰营养液中培养15天；
[0045] B：配制浓度为0.1μM或0.2μM独脚金内酯溶液，每份材料均在0μM和0.2μM独脚金内酯中生长，6盆材料分为2组，每组3盆(3个重复)；
[0046] C：由于生长7天后植株形态差异最大，每个重复取10株，测定根系形态指标，地上部和根系干鲜重，根据0.1或0.2μM独脚金内酯和0μM(对照)处理组指标的差值确定对独脚金内酯敏感植株(图4)。
[0047] (3)根系生长差异材料的验证：
[0048] 选取两种处理下根系差异最明显和无差异材料各5份或8份或10份，用相同的处理进一步验证，选取极端材料。配制F1组合和F2群体，进行遗传学和育种学研究。
[0049] 本发明与土壤培养相比，能实现植株生长的实时监控和观察，特别是结合根系扫描技术，获得油菜根系形态指标数据；采用该技术植株生长整齐，减少试验误差，准确筛选到根系生长差异材料。