本发明提供了一种三维多孔道骨组织工程支架材料人工牙的制备方法，包括聚醚醚酮悬浮液的配制、羟基磷灰石晶须悬浮液的配制、聚乳酸悬浮液的配制、三维多孔道骨组织工程支架材料复合棒材的制备、人工牙加工、人工牙表面酸处理、人工牙表面的三维多孔道内填充PLLA/nHA多孔复合物、人工牙表面三维多孔道内PLLA/nHA多孔复合物的降解处理、人工牙表面喷附生长因子等九个步骤。本发明使用羟基磷灰石、聚醚醚酮、左旋聚乳酸为主要原料制备一种骨组织工程支架材料，然后以特殊的工艺将其用于制备人工牙，得到的人工牙具有良好的生物相容性、细胞亲和性和骨传导性，并具有三维立体多孔道结构，使人工牙具有良好的生物降解性和骨诱导性。
1.一种三维多孔道骨组织工程支架材料人工牙的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）、聚醚醚酮悬浮液的配制
取医用级聚醚醚酮粉剂与甘油和乙醇混合，甘油作为分散剂，乙醇作为溶剂，按10g聚醚醚酮配45ml甘油和45ml乙醇的配比混合成10%的聚醚醚酮混悬液，再经高速打磨机研磨成聚醚醚酮悬浮液备用；
取长径比为300～700的羟基磷灰石长晶须与甘油和乙醇混合，甘油作为分散剂，乙醇作为溶剂，按10g羟基磷灰石晶须配45ml甘油和45ml乙醇的配比混合成10%的羟基磷灰石晶须混悬液，再经高速打磨机研磨成羟基磷灰石晶须悬浮液备用；
取直径为φ8～10μm的L型左旋聚乳酸（PLLA）纤维切断为1000～1500μm长的微丝，用微丝与甘油和乙醇混合，甘油作为分散剂，乙醇作为溶剂，按10g的L型左旋聚乳酸（PLLA）纤维微丝配45ml甘油和45ml乙醇的配比混合成10%的聚乳酸混悬液，再经超声波振荡配成聚乳酸悬浮液备用；
（4）、三维多孔道骨组织工程支架材料复合棒材的制备
取上述步骤得到的聚醚醚酮悬浮液、羟基磷灰石晶须悬浮液和聚乳酸悬浮液按50：30：
20的体积配比混合，经超声波振荡配成混合液，再将混合液中的甘油和乙醇抽滤出来，并在
50℃下干燥，得到的干燥复合物放入钢模中以0.5MPa的压力进行压模成型，然后加压至2～
5MPa并继续保持密封叩紧，再加热至350～380℃并保持15分钟，使PLLA分解，然后自然降温待羟基磷灰石晶须和PEEK复合材料定型后脱模，得到内部具有三维多孔道的骨组织工程支架材料复合棒材；
将步骤（4）得到的复合棒材用数控机床加工成种植牙的形态，并对种植牙根部车削种植螺纹；
将步骤（5）加工好的种植牙的根部带有种植螺纹的部分经丙酮去韧和大颗粒喷砂处理后，再浸入浓硫酸中进行表面酸处理20～180秒，使切削螺纹时表面暴露出来的三维孔道扩大成喇叭口，且表面的羟基磷灰石晶须的晶须端头露出，然后取出用水洗净，干燥；
（7）人工牙表面的三维多孔道内填充PLLA/nHA多孔复合物
取L型左旋聚乳酸（PLLA）10～30g和四氢呋喃70～90ml在60℃条件下搅拌至充分溶解后，再加入直径为20nm且长为60～100nm的针状纳米羟基磷灰石（nHA）10～20g继续搅拌至nHA完全分散在溶液中形成PLLA/nHA悬浮液，再取步骤（6）得到的人工牙将其密封在一个真空容器中，在-1～-5个大气压的负压下将配好的PLLA/nHA悬浮液吸入真空容器中对人工牙形成浸泡，真空浸泡12小时后，再在-18℃的温度下冷冻12小时，待PLLA/nHA悬浮液形成凝胶后，从真空容器中取出人工牙并转入4℃条件下的去离子水中浸泡，用去离子水将其中的四氢呋喃置换出来，置换2天后将人工牙取出，得到表面附着有PLLA/nHA凝胶的人工牙，擦去人工牙表面三维孔道外的凝胶，并保留填充在三维孔道内的凝胶，再将人工牙放入真空冻干机中1周以冻干水分，然后在50℃条件下干燥，从而达到在人工牙表面的三维多孔道内填充PLLA/nHA多孔复合物；
（8）、人工牙表面三维多孔道内PLLA/nHA多孔复合物的降解处理
将步骤（7）得到的人工牙放入生理盐水中浸泡2～5周，让人工牙表面三维多孔道内的PLLA/nHA多孔复合物的PLLA部分降解，使部分nHA裸露在三维多孔道的表面；
在进行种植前还需在人工牙的植入部分表面露出的三维孔道和晶须端头上喷附一层生长因子。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述步骤（2）中，混合时还加入1～5%重量比的硫酸钡粉。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述步骤（2）中使用的羟基磷灰石晶须采用水热合成法进行制备并用漂浮法筛选出长径比合适的晶须。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述步骤（3）中使用的L型左旋聚乳酸（PLLA）纤维采用熔融挤出拉丝分离法制备。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：当步骤（5）用于加工直径为φ5～φ6mm的大种植牙时，步骤（3）使用的L型左旋聚乳酸（PLLA）纤维中还需按配比加入2%的直径为φ
200μm，纤维长度为1000～1500μm的粗L型左旋聚乳酸（PLLA）纤维用于营造φ200μm营养管。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述步骤（5）中，当种植牙为二段式种植牙时，先加工种植牙的中心连接孔，然后用磷酸钙根管充填剂或者光固剂堵塞中心连接孔的三维孔道，并用钢代模插入中心连接孔中，然后再车削种植螺纹。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述步骤（6）中，对于直径在φ5mm以下的小种植牙，表面酸处理的时间为20～120秒，使表面暴露出来的三维孔道由φ8～10μm扩大成外径为30～60μm的喇叭口；对于直径在φ5～φ6mm的大种植牙，表面酸处理的时间为
120～180秒，使表面暴露出来的三维孔道由φ200μm扩大成外径为200～250μm的喇叭口。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述步骤（9）中，所述生长因子采用骨形态发生蛋白BMP2。
三维多孔道骨组织工程支架材料人工牙的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种人工牙的制备方法，具体是一种三维多孔道骨组织工程支架材料人工牙的制备方法，属于牙科医用材料技术领域。
背景技术
[0002] 骨组织工程是利用细胞生物学和工程学原理来研究开发修复和改善损伤骨组织形态和功能的生物替代物的一门科学。骨组织工程的三大要素包括种子细胞、支架材料和生长因子，其中支架材料一方面作为种子细胞和生长因子的载体将其运送至缺损部位，另一方面还给新骨生长提供支撑的作用，因此支架材料是骨组织工程的关键。理想的骨组织工程支架材料具有以下特点：良好的生物相容性、细胞亲和性和骨传导性；具有三维立体多孔结构，孔隙率大小利于细胞黏附增殖和血管长入；良好的生物力学性能，利于塑形等。
[0003] 基于骨组织工程支架材料的上述特点与人工牙所需具备的特性具有高度一致性，因此我们希望能开发一种骨组织工程支架材料，将其引入牙科医用材料领域，用于制备一种新型材料的人工牙。
[0004] 天然骨是由60%的羟基磷灰石（HA）、10%的水和30%的胶原蛋白构成的，在众多的生物材料中只有纳米羟基磷灰石（nHA）的形貌、成份晶形和晶度与天然骨中羟基磷灰石的非常相似，而羟基磷灰石晶须是一种以同样方法合成的亚纳米羟基磷灰石，只是合成的时间多一点，生长长一点，两者的化学结构完全一样，因此羟基磷灰石晶须是一种理想的骨组织工程支架材料。
[0005] 晶须是一种以单晶形式生长成的针状微晶体，其强度接近于完整晶体的理论值。对于同一物质，晶须的力学强度要比多晶大1000倍，而且晶须能像纤维一样依靠桥接、裂纹偏转和拨出效应吸收能量。由于晶须的强度远高于其他短切纤维，因此其主要用作复合材料的增强体，用于制造高强度复合材料。经羟基磷灰石晶须增强后的生物陶瓷，不论是普通生物陶瓷还是多孔生物陶瓷，其强度都能增加40%，而且晶须复合体在普通X光下可以显影，便于临床观察。晶须的制备方法有高温高压合成法和水热合成法等，对于羟基磷灰石晶须来说，高温高压合成法设备复杂价格昂贵，制备成本高，且高温高压会使羟基磷灰石失去生物活性羟基，因此更适于采用水热合成法来制备。水热合成法设备简单造价低廉，产量大，而且采用水热合成法制备的羟基磷灰石晶须能保持生物活性，没有毒性，可充分发挥磷酸钙盐、单晶体和纤维的综合优势。2013年昆明理工大学陈庆华教授发明一种水热均相沉淀法，能够制备出长度达800甚至1500μm长的晶须，长径比为100～500，甚至达700。其制备方法简单，产量高，长径比更好，而且价格低廉。利用漂浮法可以筛选分成100～400μm的短晶须和500～800μm的长晶须以及800～1500μm的特长晶须。
[0006] 聚醚醚酮（PEEK）是一种具有高强度、高断裂韧性的塑料，其耐疲劳性可与合金媲美。医用级PEEK具有很好的生物相容性、无细胞毒性、无诱变性、无致癌性，不引起过敏，还具有极强的耐腐蚀、耐水解和耐化学性，而且其具有良好的机械性能，是目前研究得较为广泛的人工骨材料之一。PEEK和羟基磷灰石晶须做成的复合材料，长或特长晶须经PEEK胶合成立体晶须网层，其力学性能不亚于皮质骨。唯一能溶解PEEK的溶剂是浓硫酸，丙酮能让PEEK表面韧性降低，在丙酮的作下进行PEEK表面大颗粒喷砂，再用浓硫酸进行表面处理，可以在表面形成喇叭状凹凸不平表面。
[0007] D型聚乳酸（PLA）是一种新型生物降解材料，其具有优良的生物相容性、生物可降解性和较好的力学性能，美国食品药品监督管理局FDA批准用于医用手术缝合线等，聚乳酸与羟基磷灰石复合后可形成一种三维多孔复合材料，骨细胞可以进入到三维孔隙或沟槽中，因此其具有良好的生物降解性和骨诱导性的双重优点。L型左旋聚乳酸（PLLA）的熔点比D型聚乳酸高，达到175～185℃，而L型左旋聚乳酸的降解速度比D型聚乳酸慢。将左旋聚乳酸与纳米羟基磷灰石复合后形成的三维多孔复合材料还具有生物降解性和骨诱导性，可作为优良的支架材料，是组织工程研究的重点。
[0008] 因此，我们以羟基磷灰石、聚醚醚酮、左旋聚乳酸为主要原料来合成一种具有高强度和高生物活性的骨组织工程支架材料，用于制备一种新型材料的人工牙。
发明内容
[0009] 本发明的目的是提供一种三维多孔道骨组织工程支架材料人工牙的制备方法，用于制备一种各方面性能更优秀的人工牙。
[0010] 本发明的具体技术方案如下：
[0011] 一种三维多孔道骨组织工程支架材料人工牙的制备方法，包括以下步骤：
[0012] （1）、聚醚醚酮悬浮液的配制
[0013] 取医用级聚醚醚酮粉剂与甘油和乙醇混合，甘油作为分散剂，乙醇作为溶剂，按10g聚醚醚酮配45ml甘油和45ml乙醇的配比混合成10%的聚醚醚酮混悬液，再经高速打磨机研磨成聚醚醚酮悬浮液备用。
[0014] （2）、羟基磷灰石晶须悬浮液的配制
[0015] 取长径比为300～700的羟基磷灰石长晶须与甘油和乙醇混合，甘油作为分散剂，乙醇作为溶剂，按10g羟基磷灰石晶须配45ml甘油和45ml乙醇的配比混合成10%的羟基磷灰石晶须混悬液，再经高速打磨机研磨成羟基磷灰石晶须悬浮液备用。
[0016] （3）、聚乳酸悬浮液的配制
[0017] 取直径为φ8～10μm的L型左旋聚乳酸（PLLA）纤维切断为1000～1500μm长的微丝，用微丝与甘油和乙醇混合，甘油作为分散剂，乙醇作为溶剂，按10g的L型左旋聚乳酸（PLLA）纤维微丝配45ml甘油和45ml乙醇的配比混合成10%的聚乳酸混悬液，再经超声波振荡配成聚乳酸悬浮液备用。
[0018] （4）、三维多孔道骨组织工程支架材料复合棒材的制备
[0019] 取上述步骤得到的聚醚醚酮悬浮液、羟基磷灰石晶须悬浮液和聚乳酸悬浮液按50：30：20的体积配比混合，经超声波振荡配成混合液，再将混合液中的甘油和乙醇抽滤出来，并在50℃下干燥，得到的干燥复合物放入钢模中以0.5MPa的压力进行压模成型，然后加压至2～5MPa并继续保持密封叩紧，再加热至350～380℃并保持15分钟，使PLLA分解，然后自然降温待羟基磷灰石晶须和PEEK复合材料定型后脱模，得到内部具有三维多孔道的骨组织工程支架材料复合棒材。
[0020] （5）、人工牙加工
[0021] 将步骤（4）得到的复合棒材用数控机床加工成种植牙的形态，并对种植牙根部车削种植螺纹。
[0022] （6）、人工牙表面酸处理
[0023] 将步骤（5）加工好的种植牙的根部带有种植螺纹的部分经丙酮去韧和大颗粒喷砂处理后，再浸入浓硫酸中进行表面酸处理20～180秒，使切削螺纹时表面暴露出来的三维孔道扩大成喇叭口，且表面的羟基磷灰石晶须的晶须端头露出，然后取出用水洗净，干燥。
[0024] （7）人工牙表面的三维多孔道内填充PLLA/nHA多孔复合物
[0025] 取L型左旋聚乳酸（PLLA）10～30g和四氢呋喃70～90ml在60℃条件下搅拌至充分溶解后，再加入直径为20nm且长为60～100nm的针状纳米羟基磷灰石（nHA）10～20g继续搅拌至nHA完全分散在溶液中形成PLLA/nHA悬浮液，再取步骤（6）得到的人工牙将其密封在一个真空容器中，在-1～-5个大气压的负压下将配好的PLLA/nHA悬浮液吸入真空容器中对人工牙形成浸泡，真空浸泡12小时后，再在-18℃的温度下冷冻12小时，待PLLA/nHA悬浮液形成凝胶后，从真空容器中取出人工牙并转入4℃条件下的去离子水中浸泡，用去离子水将其中的四氢呋喃置换出来，置换2天后将将人工牙取出，得到表面附着有PLLA/nHA凝胶的人工牙，擦去人工牙表面三维孔道外的凝胶，并保留填充在三维孔道内的凝胶，再将人工牙放入真空冻干机中1周以冻干水分，然后在50℃条件下干燥，从而达到在人工牙表面的三维多孔道内填充PLLA/nHA多孔复合物。
[0026] （8）、人工牙表面三维多孔道内PLLA/nHA多孔复合物的降解处理[0027] 将步骤（7）得到的人工牙放入生理盐水中浸泡2～5周，让人工牙表面三维多孔道内的PLLA/nHA多孔复合物的PLLA部分降解，使部分nHA裸露在三维多孔道的表面。
[0028] （9）、人工牙表面喷附生长因子
[0029] 在进行种植前还需在人工牙的植入部分表面露出的三维孔道和晶须端头上喷附一层生长因子。
[0030] 本发明提供一种三维多孔道骨组织工程支架材料人工牙的制备方法，其使用羟基磷灰石、聚醚醚酮、左旋聚乳酸为主要原料制备一种骨组织工程支架材料，然后以特殊的工艺将其用于制备人工牙，从原料选取到加工工艺的制定都非常巧妙。此方法制备的人工牙具有良好的生物相容性、细胞亲和性和骨传导性，并具有三维立体多孔道结构，表面的小孔道对骨生长前软骨形成有利，大孔道则会促进骨生成的血管化，孔道内还填充有PLLA/nHA多孔材料，使人工牙具有良好的生物降解性和骨诱导性。
具体实施方式
[0031] 本发明的三维多孔道骨组织工程支架材料人工牙的制备方法，包括以下步骤：
[0032] （1）、聚醚醚酮悬浮液的配制
[0033] 取医用级聚醚醚酮粉剂与甘油和乙醇混合，甘油作为分散剂，乙醇作为溶剂，按10g聚醚醚酮配45ml甘油和45ml乙醇的配比混合成10%的聚醚醚酮混悬液，再经高速打磨机研磨成聚醚醚酮悬浮液备用。
[0034] （2）、羟基磷灰石晶须悬浮液的配制
[0035] 取长径比为300～700的羟基磷灰石长晶须与甘油和乙醇混合，甘油作为分散剂，乙醇作为溶剂，按10g羟基磷灰石晶须配45ml甘油和45ml乙醇的配比混合成10%的羟基磷灰石晶须混悬液，再经高速打磨机研磨成羟基磷灰石晶须悬浮液备用。
[0036] 在本步骤中，如需使显影性更好，混合时还可加入1～5%重量比的硫酸钡粉。本步骤使用的羟基磷灰石晶须采用水热合成法进行制备并用漂浮法筛选出长径比合适的晶须。
[0037] （3）、聚乳酸悬浮液的配制
[0038] 取直径为φ8～10μm的L型左旋聚乳酸（PLLA）纤维切断为1000～1500μm长的微丝，用微丝与甘油和乙醇混合，甘油作为分散剂，乙醇作为溶剂，按10g的L型左旋聚乳酸（PLLA）纤维微丝配45ml甘油和45ml乙醇的配比混合成10%的聚乳酸混悬液，再经超声波振荡配成聚乳酸悬浮液备用。
[0039] 本步骤中，所述L型左旋聚乳酸（PLLA）纤维采用熔融挤出拉丝分离法制备。
[0040] 当步骤（5）用于加工直径为φ5～φ6mm的大种植牙时，本步骤使用的L型左旋聚乳酸（PLLA）纤维中还需按配比加入2%的直径为φ200μm，纤维长度为1000～1500μm的粗L型左旋聚乳酸（PLLA）纤维用于营造φ200μm营养管。
[0041] （4）、三维多孔道骨组织工程支架材料复合棒材的制备
[0042] 取上述步骤得到的聚醚醚酮悬浮液、羟基磷灰石晶须悬浮液和聚乳酸悬浮液按50：30：20的体积配比混合，经超声波振荡配成混合液，再将混合液中的甘油和乙醇抽滤出来，并在50℃下干燥，得到的干燥复合物放入钢模中以0.5MPa的压力进行压模成型，然后加压至2～5MPa并继续保持密封叩紧，再加热至350～380℃并保持15分钟，使PLLA分解，然后自然降温待羟基磷灰石晶须和PEEK复合材料定型后脱模，得到内部具有三维多孔道的骨组织工程支架材料复合棒材。
[0043] 在本步骤中，因为聚乳酸在200℃以上温度时会完全分解为二氧化碳和水，而羟基磷灰石晶须和PEEK不会分解，因此定型脱模后的复合棒材只包含有羟基磷灰石长晶须和PEEK，羟基磷灰石晶须和PEEK复合交织成晶须网，其力学性能不亚于骨皮质，且韧性更好，其内的左旋聚乳酸纤维会分解并在其对应的位置形成三维孔道。晶须网间已形成了晶须立体工字梁交织结构，因此三维孔道不会明显降低其力学性能。
[0044] （5）、人工牙加工
[0045] 将步骤（4）得到的复合棒材用数控机床加工成种植牙的形态，并对种植牙根部车削种植螺纹。
[0046] 在本步骤中，当种植牙为二段式种植牙时，先加工种植牙的中心连接孔，然后用磷酸钙根管充填剂或者光固剂堵塞中心连接孔的三维孔道，并用钢代模插入中心连接孔中，然后再车削种植螺纹。
[0047] （6）、人工牙表面酸处理
[0048] 将步骤（5）加工好的种植牙的根部带有种植螺纹的部分经丙酮去韧和大颗粒喷砂处理后，再浸入浓硫酸中进行表面酸处理20～180秒，使切削螺纹时表面暴露出来的三维孔道扩大成喇叭口，且表面的羟基磷灰石晶须的晶须端头露出，然后取出用水洗净，干燥。
[0049] 在本步骤中，对于直径在φ5mm以下的小种植牙，表面酸处理的时间为20～120秒，使表面暴露出来的三维孔道由φ8～10μm扩大成外径为30～60μm的喇叭口；对于直径在φ5～φ6mm的大种植牙，表面酸处理的时间为120～180秒，使表面暴露出来的三维孔道由φ200μm扩大成外径为200～250μm的喇叭口。
[0050] 在本步骤中，对种植螺纹进行表面酸处理的目的有两个：
[0051] a）、经过浓硫酸溶解后，将切削螺纹时暴露出来的三维孔道由微孔扩大为喇叭口。在种植时螺纹旋转挤压会把种植孔边缘的牙槽骨成骨细胞刮入喇叭口内，成为自动接种种子骨细胞，移行到羟基磷灰石晶须支架内的成种子骨细胞，如果不是过份挤压到骨细胞坏死，很快就成为新的成骨细胞。
[0052] b）、由于羟基磷灰石晶须属于磷酸钙盐，其与硫酸的反应的速度远小于聚醚醚酮被溶解的速度，因此在种植牙的根部种植螺纹表面的聚醚醚酮会先被浓硫酸溶解掉，使羟基磷灰石晶须的晶须端头能裸露出来，可充分发挥磷酸盐、单晶体和纤维的综合优势，从而增加了种植牙的生物活性，有利初始细胞的附着和增殖分化，有利于周围骨组织的生长。
[0053] （7）人工牙表面的三维多孔道内填充PLLA/nHA多孔复合物
[0054] 取L型左旋聚乳酸（PLLA）10～30g和四氢呋喃70～90ml在60℃条件下搅拌至充分溶解后，再加入直径为20nm且长为60～100nm的针状纳米羟基磷灰石（nHA）10～20g继续搅拌至nHA完全分散在溶液中形成PLLA/nHA悬浮液，再取步骤（6）得到的人工牙将其密封在一个真空容器中，在-1～-5个大气压的负压下将配好的PLLA/nHA悬浮液吸入真空容器中对人工牙形成浸泡，真空浸泡12小时后，再在-18℃的温度下冷冻12小时，待PLLA/nHA悬浮液形成凝胶后，从真空容器中取出人工牙并转入4℃条件下的去离子水中浸泡，用去离子水将其中的四氢呋喃置换出来，置换2天后将将人工牙取出，得到表面附着有PLLA/nHA凝胶的人工牙，擦去人工牙表面三维孔道外的凝胶，并保留填充在三维孔道内的凝胶，再将人工牙放入真空冻干机中1周以冻干水分，然后在50℃条件下干燥，从而达到在人工牙表面的三维多孔道内填充PLLA/nHA多孔复合物。
[0055] （8）、人工牙表面三维多孔道内PLLA/nHA多孔复合物的降解处理[0056] 将步骤（7）得到的人工牙放入生理盐水中浸泡2～5周，让人工牙表面三维多孔道内的PLLA/nHA多孔复合物的PLLA部分降解，使部分nHA裸露在三维多孔道的表面。
[0057] （9）、人工牙表面喷附生长因子
[0058] 在进行种植前还需在人工牙的植入部分表面露出的三维孔道和晶须端头上喷附一层生长因子。
[0059] 本步骤中，植入前在人工牙的植入部分表面露出的三维孔道和晶须端头上喷附一层生长因子可以在短期内获得更高的生物活性，所述生长因子可以采用骨形态发生蛋白BMP2。
