一种植物乳杆菌及其在中式猪肉发酵香肠制备中的应用转让专利
申请号 : CN201710498700.1
文献号 : CN107217019B
文献日 : 2020-08-28
发明人 : 张万刚 , 葛庆丰 , 顾于滨 , 周光宏
申请人 : 南京农业大学
摘要 :
一种植物乳杆菌及其在中式猪肉发酵香肠制备中的应用。提供了一种植物乳杆菌及其在中式猪肉发酵香肠制备中的应用，将从食品中筛选出来的新菌种植物乳杆菌应用到香肠生产中，缩短香肠的发酵周期，降低脂肪和蛋白质的氧化程度。一种植物乳杆菌NJAU‑01(Lactobacillus plantarum NJAU‑01)，保藏号为：CGMCC No.14194。本发明发酵菌株抗氧化活性强，生产的猪肉发酵香肠品质及抗氧化性均优于传统发酵香肠，且发酵周期短，脂肪氧化程度低，蛋白氧化程度显著降低。另外，添加了发酵剂的发酵香肠pH低于传统发酵香肠，有效抑制有害菌生长繁殖，可在一定程度上抑制香肠腐败和霉变，延长了中式发酵香肠的保质期，为企业减少了因产品快速变质带来的经济损失。
权利要求 :
1.一种植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)，其特征在于，保藏号为：CGMCC No.14194。
2.一种权利要求1所述植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)在中式猪肉发酵香肠制备中的应用，所述植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)的保藏号为：CGMCC No.14194。
3.一种中式猪肉发酵香肠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)、植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)种子液制备：植物乳杆菌菌株用MRS肉汤在37℃下培养18h，4℃下6000g离心机中离心10min后用去离子水洗涤两次并重新悬浮于去离子水中制得菌悬液，菌悬液细胞沉淀的细菌计数调节至105-109cfu/ml，所述植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)的保藏号为：CGMCC No.14194；
2)、香肠制备：
2.1)、将新鲜猪肉，肥瘦分离，分割成块，3-10℃水中清洗，去掉血块及猪皮，肥肉重量占肉总重的30％，绞碎备用；
2.2)、按照总肉重量100份称取如下配料：白糖6-7份、盐3-4份、味精0.1-0.2份、五香粉
0.1-0.2份、生姜0.1-0.2份、大曲10-20ml/kg，再加入肉和前述配料总重量9-12％的水；
2.3)、接种步骤1)中制得的菌悬液至腌制肉糜中混匀，接种量为109cfu/g，然后灌制香肠；
2.4)、30±0.5℃，RH 90％-95％条件下发酵1天；
2.5)、16±0.5℃，RH 85％-90％条件下放置6天，然后在12±0.5℃，RH 75％-80％条件下放置14天使香肠发酵成熟；
2.6)、将发酵成熟的香肠修剪整齐，真空包装，即得成品发酵香肠。
4.根据权利要求3所述的一种中式猪肉发酵香肠的制备方法，其特征在于，所述步骤
2.2)中猪肉与配料混合后，常温下腌制1-2h。
5.根据权利要求3所述的一种中式猪肉发酵香肠的制备方法，其特征在于，所述步骤
2.4)中发酵期内除霉。
说明书 :
一种植物乳杆菌及其在中式猪肉发酵香肠制备中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌及其在中式猪肉发酵香肠制备中的应用。
背景技术
[0002] 我国肉制品加工业正处于传统到精加工的过渡期。传统发酵香肠是依赖于环境中微生物的自然发酵，发酵时间长，产品单一，而且产品的抗氧化程度较低，尤其是脂肪的氧化会生成很多对人体有害的物质，食用后不利于身体健康。生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种自由基，这些自由基能攻击多不饱和脂肪酸，触发脂质过氧化，造成机体损伤。目前为了降低氧化程度，在制作过程中通常添加化学合成的抗氧化剂，但存在安全性问题，因此寻求天然的抗氧化剂是解决此类问题的有效途径之一。乳酸菌能降低ROS的生成，清除体内自由基，有研究表明乳酸菌细胞和无细胞提取物在体外有类似的抗氧化剂活性。从肉制品中筛选具有优良抗氧化性能的菌株应用于发酵香肠，为功能性发酵香肠的开发奠定基础。
发明内容
[0003] 本发明针对以上问题，提供了一种植物乳杆菌及其在中式猪肉发酵香肠制备中的应用，将从食品中筛选出来的新菌种植物乳杆菌应用到香肠生产中，缩短香肠的发酵周期，降低脂肪和蛋白质的氧化程度。
[0004] 本发明的技术方案是：一种植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)，保藏号为：CGMCC No.14194。
[0005] 一种植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)在中式香肠制备中的应用，所述植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)的保藏号为：CGMCC No.14194。
[0006] 一种中式猪肉发酵香肠的制备方法，包括如下步骤：
[0007] 1)、植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)种子液制备：植物乳杆菌菌株用MRS肉汤在37℃下培养18h，4℃下6000g离心机中离心10min后用去离子水洗涤两次并重新悬浮于去离子水中制得菌悬液，菌悬液细胞沉淀的细菌计数调节至105-109cfu/ml，所述植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)的保藏号为：
CGMCC No.14194；
CGMCC No.14194；
[0008] 2)、香肠制备：
[0009] 2.1)、将新鲜猪肉，肥瘦分离，分割成块，3-10℃水中清洗，去掉血块及猪皮，肥肉重量占肉总重的30％，绞碎备用；
[0010] 2.2)、按照总肉重量100份称取如下配料：白糖6-7份、盐3-4份、味精0.1-0.2份、五香粉0.1-0.2份、生姜0.1-0.2份、大曲10-20ml/kg，再加入肉和前述配料总重量9-12％的水；
[0011] 2.3)、接种步骤1)中制得的菌悬液至腌制肉糜中混匀，接种量为109cfu/g，然后灌制香肠；
[0012] 2.4)、30±0.5℃，RH 90％-95％条件下发酵1天；
[0013] 2.5)、16±0.5℃，RH 85％-90％条件下放置6天，然后在12±0.5℃，RH 75％-80％条件下放置14天使香肠发酵成熟；
[0014] 2.6)、将发酵成熟的香肠修剪整齐，真空包装，即得成品发酵香肠。
[0015] 所述步骤2.2)中猪肉与配料混合后，常温下腌制1-2h。
[0016] 所述步骤2.4)中发酵期内除霉。
[0017] 本发明的有益效果是：本发明发酵菌株抗氧化活性强，生产的猪肉发酵香肠品质及抗氧化性均优于传统发酵香肠，且发酵周期短，脂肪氧化程度低，蛋白氧化程度显著降低。另外，添加了发酵剂的发酵香肠pH低于传统发酵香肠，有效抑制有害菌生长繁殖，可在一定程度上抑制香肠腐败和霉变，延长了中式发酵香肠的保质期，为企业减少了因产品快速变质带来的经济损失，具体体现在以下方面：
[0018] (1)产品的发酵周期为21天，传统发酵香肠发酵周期为28-45天，缩短发酵周期。
[0019] (2)产品的呈色迅速，产品的质地比较紧密，切面比较平整细腻，呈枣红色，脂白色、有光泽，咸淡适中，硬度，咀嚼性和弹性明显增强。
[0020] (3)脂肪氧化程度，以TBA值为代表，接菌组脂肪氧化程度较低，接种量为109cfu/g组丙二醛含量显著低于对照组1.46×10-5mg MDA/kg；有效抑制脂质的氧化，提高产品的口味和营养安全性。
[0021] (4)产品的蛋白抗氧化性，以羰基值为代表，接种量为109cfu/g组羰基含量低于对照组0.12nmol羰基/mg蛋白。
[0022] (5)产品的蛋白抗氧化性，以巯基值为代表，接种量为109cfu/g组巯基含量高于对照组2.57nmol巯基/mg蛋白。
[0023] (6)与传统发酵香肠相比，产品pH值较低，减缓了香肠因金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等有害微生物作用引起的腐败和霉变，延长产品货架期，保证产品的安全性。
[0024] 本发明筛选的植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)于2017年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(C G M C C)，分类命名：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏号：CGMCC No.14194。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所；邮编：100101。
附图说明
[0025] 图1是DPPH清除率对比图；
[0026] 图2是羰基值对比图；
[0027] 图3是总巯基对比图。
具体实施方式
[0028] 下面结合实施例对本发明作具体说明。
[0029] 一、菌种的筛选与抗氧化活性研究
[0030] 实施例1菌种的筛选
[0031] (1)分离、纯化：随机选取金华火腿，在签点肌肉和股二头肌上随机确定4个点，用无菌的剪子和手术刀在其表面切除约0.5cm厚、边长为4cm左右的部分，弃用；在深处切出厚度约为2cm左右，大小相似的肉块取出；先将肉块在酒精灯上进行表面消毒，然后放入已灭菌的塑料瓶中，进行无菌操作，用无菌剪子从肉样上剪取约2.0g深层肌肉，放入灭菌乳钵内粉碎，然后加灭菌海沙研磨，磨碎后加入灭菌水混匀后稀释成1:10稀释液，再按10倍递增稀释。涂布于MRS培养基，分别于37℃生化培养箱培养18-24h，挑取单菌落反复划线分离纯化，直至获得单一菌株。
[0032] (2)筛选：以革兰氏阳性、不产粘液、耐NaCl(8％)、非产气性、非产H2S，非产H2O2，不具氨基酸脱羧酶作为初筛指标；以产酸速度、产酸能力和产香性作为乳酸菌复筛指标，筛选出适合接种于发酵香肠的菌株。
[0033] (3)鉴定：根据菌落的表型特征和生理生化特性，结合16S测序确定菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
[0034] (4)保藏：将菌液和甘油按1：1混合置于-70℃保藏。
[0035] 上述菌株于2017年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)(保藏号CGMCC No.14194)。
[0036] 实施例2植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)抗氧化活性研究
[0037] 实施例1中得到的菌株细胞通过离心(6000g，10min，4℃)，用去离子水洗涤两次并重新悬浮于去离子水。细胞沉淀的细菌计数调节至107、108、109cfu/ml得样品溶液。
[0038] (1)DPPH清除率测定：2mL样品溶液，0.2mmol/L DPPH-无水乙醇溶液1mL，混匀暗处理30min，6000转离心10min，取上清液(以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液调零，517nm处)测吸光值A1，以等体积无水乙醇代替DPPH以同样方法测吸光值A0，以等体积蒸馏水代替样品溶液以同样方法测吸光值A2。DPPH清除率＝[1-(A1-A0)/A2]×100％。Vc作为对照，结果如图1所示，对照组Vc的DPPH自由基清除率最高，达到57.36％。其次是植物乳杆菌浓度109cfu/ml的细胞内无细胞提取物的DPPH自由基清除率较高，清除率达到为42.62％，显著高于菌株浓度108cfu/ml和107cfu/ml的DPPH自由基清除率(p<0.05)，本发明的植物乳杆菌有良好的清除DPPH自由基的能力。
[0039] (2)过氧化氢耐受试验：植物乳杆菌菌株的过夜培养物接种1％(V/V)到MRS肉汤，MRS肉汤含有0.4、0.7、1.0mM H2O2(30％)，Vc作为对照，37℃培养8h。用分光光度计于波长为600nm处测OD值。结果如表1所示，结果表明：植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)菌株能够耐受一定浓度的过氧化氢(H2O2)，菌株对过氧化氢的耐受呈浓度依赖型关系。
[0040] 表1植物乳杆菌对过氧化氢的耐受能力
[0041]
[0042] 二、香肠的制备
[0043] 实施例3
[0044] 1)、植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)种子液制备：植物乳杆菌菌株用MRS肉汤在37℃下培养18h，4℃下6000g离心机中离心10min后用去离子水洗涤两次并重新悬浮于去离子水中制得菌悬液，菌悬液细胞沉淀的细菌计数调节至105cfu/ml，所述植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)的保藏号为：CGMCC No.14194；
[0045] 2)、香肠制备：
[0046] 2.1)、将新鲜猪肉，肥瘦分离，分割成块，3℃水中清洗，去掉血块及猪皮，肥肉重量占肉总重的30％，绞碎备用；
[0047] 2.2)、按照总肉重量100份称取如下配料：白糖6份、盐3份、味精0.1份、五香粉0.1份、生姜0.1份、大曲10ml/kg，，再加入肉和前述配料总重量9％的水，猪肉与配料混合后，常温下腌制1h；
[0048] 2.3)、接种步骤1)中制得的菌悬液至腌制肉糜中混匀，接种量为105cfu/g，然后灌制香肠；
[0049] 2.4)、29.5℃，RH 90％条件下发酵1天，发酵期内除霉；
[0050] 2.5)、15.5℃，RH 85％条件下放置6天，然后在11.5℃，RH 75％条件下放置14天使香肠发酵成熟；
[0051] 2.6)、将发酵成熟的香肠修剪整齐，真空包装，即得成品发酵香肠。
[0052] 实施例4
[0053] 1)、植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)种子液制备：植物乳杆菌菌株用MRS肉汤在37℃下培养18h，4℃下6000g离心机中离心10min后用去离子水洗涤两次并重新悬浮于去离子水中制得菌悬液，菌悬液细胞沉淀的细菌计数调节至107cfu/ml，所述植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)的保藏号为：CGMCC No.14194；
[0054] 2)、香肠制备：
[0055] 2.1)、将新鲜猪肉，肥瘦分离，分割成块，10℃水中清洗，去掉血块及猪皮，肥肉重量占肉总重的30％，绞碎备用；
[0056] 2.2)、按照总肉重量100份称取如下配料：白糖7份、盐4份、味精0.2份、五香粉0.2份、生姜0.2份、大曲20ml/kg，，再加入肉和前述配料总重量12％的水，猪肉与配料混合后，常温下腌制2h；
[0057] 2.3)、接种步骤1)中制得的菌悬液至腌制肉糜中混匀，接种量为107cfu/g，然后灌制香肠；
[0058] 2.4)、30.5℃，RH 95％条件下发酵1天，发酵期内除霉；
[0059] 2.5)、16.5℃，RH 90％条件下放置6天，然后在12.5℃，RH 80％条件下放置14天使香肠发酵成熟；
[0060] 2.6)、将发酵成熟的香肠修剪整齐，真空包装，即得成品发酵香肠。
[0061] 实施例5
[0062] 1)、植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)种子液制备：植物乳杆菌菌株用MRS肉汤在37℃下培养18h，4℃下6000g离心机中离心10min后用去离子水洗涤两次并重新悬浮于去离子水中制得菌悬液，菌悬液细胞沉淀的细菌计数调节至109cfu/ml，所述植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)的保藏号为：CGMCC No.14194；
[0063] 2)、香肠制备：
[0064] 2.1)、将新鲜猪肉，肥瘦分离，分割成块，6℃水中清洗，去掉血块及猪皮，肥肉重量占肉总重的30％，绞碎备用；
[0065] 2.2)、按照总肉重量100份称取如下配料：白糖6.5份、盐3.5份、味精0.15份、五香粉0.15份、生姜0.15份、大曲15ml/kg，再加入肉和前述配料总重量10％的水，猪肉与配料混合后，常温下腌制1.5h；
[0066] 2.3)、接种步骤1)中制得的菌悬液至腌制肉糜中混匀，接种量为109cfu/g，然后灌制香肠；
[0067] 2.4)、30℃，RH 92％条件下发酵1天，发酵期内除霉；
[0068] 2.5)、16℃，RH 88％条件下放置6天，然后在12℃，RH 78％条件下放置14天使香肠发酵成熟；
[0069] 2.6)、将发酵成熟的香肠修剪整齐，真空包装，即得成品发酵香肠。
[0070] 实施例6对照组(CK)
[0071] 2.1)、将新鲜猪肉，肥瘦分离，分割成块，6℃水中清洗，去掉血块及猪皮，肥肉重量占肉总重的30％，绞碎备用；
[0072] 2.2)、按照总肉重量100份称取如下配料：白糖6.5份、盐3.5份、味精0.15份、五香粉0.15份、生姜0.15份、大曲15ml/kg，再加入肉和前述配料总重量10％的水，猪肉与配料混合后，常温下腌制1.5h；
[0073] 2.3)、30℃，RH 92％条件下发酵1天，发酵期内除霉；
[0074] 2.4)、16℃，RH 88％条件下放置6天，然后在12℃，RH 78％条件下放置14天使香肠发酵成熟；
[0075] 2.5)、将发酵成熟的香肠修剪整齐，真空包装，即得成品发酵香肠。
[0076] 三、性能检测
[0077] 实施例7pH值
[0078] 称取10g样品，加入90mL蒸馏水，均浆，用酸度计测定pH值。结果如表2所示，从表2中可以看出，添加植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum NJAU-01)明显降低了发酵香肠的pH，低pH值可有效抑制有害菌生长繁殖，在一定程度上抑制香肠腐败和霉变，延长中式发酵香肠的保质期。
[0079] 表2各实施例的pH值
[0080] 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6(CK)
pH值 5.07±0.068 4.99±0.064 4.53±0.015 5.27±0.027
pH值 5.07±0.068 4.99±0.064 4.53±0.015 5.27±0.027
[0081] 实施例8TBA值
[0082] 1g肉充分搅碎(5000rpm，5s,两次)，加10ml蒸馏水，12000rpm匀浆2次，每次30s。取0.2ml匀浆液加入0.2ml 8.1％的SDS溶液和1.5ml pH 3.5的20％醋酸缓冲液，1.5ml 0.8％的TBA溶液，0.6ml蒸馏水，振荡混匀，95℃水浴60min，流水冷却10min。然后试管中加1ml蒸馏水和4ml吡啶与正丁醇混合物(1：15)，混匀涡旋后4000rpm离心10min，取上层液与532nm处测定吸光度。
[0083] 标准曲线，取1μg/ml TEP标准溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6ml，加入试管中，再加入0.2ml 8.1％SDS溶液，1.5ml 20％醋酸缓冲液(pH 3.5)和0.8％TBA溶液1.5ml，定容至4ml，使得体系内TEP的量分别为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mg，95℃水浴60min，流水冷却10min，加1ml蒸馏水和4ml吡啶与正丁醇混合物(1：15)，混匀涡旋后4000rpm离心10min，532nm处测定吸光度。
[0084] 结果如表3所示，接菌组中丙二醛(MDA)含量显著低于空白组，有效抑制产品脂质氧化，MDA含量随着发酵时间延长呈增加的趋势，在发酵后期MDA增加趋势减缓。
[0085] 表3各实施例中的TBA值
[0086]
[0087] 实施例9羰基值
[0088] 称取1.5g肉样于50mL离心管中(只取瘦肉、肉搅拌)，加入15mL焦磷酸盐缓冲液，取匀浆液于离心管中(每管3mL)，分对照组和实验组，加入3mL 20％TCA振荡混匀，离心12000g，5min，取沉淀，加入3mL 10％TCA，振荡混匀，离心(12000g，5min)，取沉淀。对照组加
3mL 2M HCl，实验组加3mL DNPH，暗处放30min，每10min振荡一次，每次10s，加20％TCA振荡混匀，离心(12000g，5min)，取沉淀。加7.5mL乙醇/乙酸乙酯混合液，混匀，离心(12000g，
5min)，取沉淀，重复3次。加3mL盐酸胍，4℃保存过夜后离心(12000g，5min)，取上清液，测吸光值(370nm)。
3mL 2M HCl，实验组加3mL DNPH，暗处放30min，每10min振荡一次，每次10s，加20％TCA振荡混匀，离心(12000g，5min)，取沉淀。加7.5mL乙醇/乙酸乙酯混合液，混匀，离心(12000g，
5min)，取沉淀，重复3次。加3mL盐酸胍，4℃保存过夜后离心(12000g，5min)，取上清液，测吸光值(370nm)。
[0089] 结果如图2所示，从图2中可以看出，本发明制得的产品蛋白氧化程度(以羰基值为代表)，明显低于对照组，说明植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarumNJAU-01)有效降低了羰基的产生，抑制了蛋白质的氧化。
[0090] 实施例10巯基值
[0091] 取0.2ml 2mg/ml蛋白液，加1.8ml脲缓冲液和80μL DTNB，40℃水浴反应25min取出冷却后反应液于412nm测定吸光度值，其摩尔吸光系数为13,600M-1/cm-1。总巯基单位用纳摩尔巯基每毫克蛋白表示。
[0092] 结果如图3所示，从图3中可以看出，本发明制得的产品蛋白氧化程度(以巯基值为代表)，明显高于对照组，说明植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)有效抑制了巯基的氧化，即抑制了蛋白质的氧化。
[0093] 实施例11感官品质
[0094] 用双面刀将样品切成1cm厚的圆柱体，“T”型金属压头连在材料仪上，感应源1000N，初始力0.3N，压头直径4l mm，压缩比50％，测定速度：50mm/min，两次循环，测定项目：硬度(N)；弹性(mm)；咀嚼性(mJ)；黏聚性。
[0095] 质构分析如表4所示，色差分析如表5所示，
[0096] 表4各实施例中的质构分析
[0097]
[0098] 表5各实施例中的色差分析
[0099] 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6(CK)L* 46.73±1.11 49.49±0.45 49.51±0.83 42.98±2.66
a* 13.57±0.94 11.47±0.33 9.85±0.27 12.36±0.04
b* 10.43±0.77 8.95±0.36 10.26±0.18 9.01±1.19
a* 13.57±0.94 11.47±0.33 9.85±0.27 12.36±0.04
b* 10.43±0.77 8.95±0.36 10.26±0.18 9.01±1.19
[0100] L*：代表明暗度(黑白)，a*：代表红绿色，b*：代表黄蓝色
[0101] 由表4、表5可知，添加植物乳杆菌NJAU-01(Lactobacillus plantarum NJAU-01)的猪肉发酵香肠肌肉质地比较紧密，切面比较平整细腻，呈红色，咸淡适中，具有浓郁的发酵风味。由于本发明所使用的菌种均分离自金华干腌火腿，并经过安全性分析，因此使用安全可靠。