一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法及其应用

摘要

本发明提供了一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法及其应用，该方法包括：1)使用冷丙酮沉淀疫苗中的蛋白；2)SDS‑PAGE电泳；3)使用灰度扫描仪对各条带进行灰度扫描；4)结合灰度扫描的结果计算疫苗中蛋白含量和纯度。该方法既解决了油乳剂疫苗中抗原蛋白解离效率低且易变性降解的问题，也解决了成品兽用油乳剂蛋白亚单位疫苗的质检中使用靶动物进行实验的难题，在抗原蛋白含量的定量及纯度的检测中准确率达到90％以上；且不会导致抗原蛋白的变性降解且易重复；同时通过对得到的抗原蛋白进行一次SDS‑PAGE检测就能够获得油乳剂蛋白亚单位疫苗中抗原蛋白的含量和纯度的结果，节约了成本、劳动力和时间。

权利要求

1.一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法，其特征在于，所述油乳剂蛋白亚单位疫苗包括一种抗原蛋白和油佐剂，所述油佐剂为ISA 201 VG、ISA 35 VG或白油；所述检测方法包括以下步骤：

1)使用冷丙酮沉淀所述油乳剂蛋白亚单位疫苗中的蛋白，其中，所述冷丙酮为丙酮置于﹣20℃冰箱预冷处理2h以上获得；所述使用冷丙酮沉淀所述油乳剂蛋白亚单位疫苗中的蛋白包括以下步骤：a)取理论蛋白含量为2～10μg的所述油乳剂蛋白亚单位疫苗于1.5ml EP管中，根据所取所述油乳剂蛋白亚单位疫苗的体积加入冷丙酮，其中冷丙酮与所述油乳剂蛋白亚单位疫苗的体积比为9:1，放入﹣20℃处理至少1h；

b)将a)中样品12,000rpm，4℃，离心20min，去除上层液体，留沉淀，待丙酮挥发干燥之后，加入20μl PBS重悬；

c)重悬后每管加入5μl 5*loading buffer，沸水中蒸煮10min；12,000rpm，4℃离心

5min，待用；

2)SDS-PAGE电泳；

3)将凝胶置于常规成像仪进行拍摄，保存图片；

4)将步骤3)中图片置于常规灰度扫描仪中，使用软件定义标准蛋白条带的灰度为1，由此得到样品蛋白条带相对于标准蛋白条带的灰度比较结果，再将样品蛋白条带相对于标准蛋白条带的灰度比较结果×标准蛋白的含量，从而得到样品蛋白的含量；以及

5)将步骤3)中图片置于常规灰度扫描仪中，使用软件选中样品蛋白条带所在的泳道，再对该泳道的所有条带进行灰度扫描，从而得到样品蛋白条带相对于样品中所有蛋白条带的比值，该比值为样品蛋白纯度。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述标准蛋白的含量为2～10μg。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述SDS-PAGE电泳包括以下步骤：(1)将制备好的聚丙烯酰胺凝胶用电泳夹固定至电泳槽中；

(2)将10×Tris-Glycine Buffer稀释到1×，倒入电泳槽内，电泳缓冲液液面需没过短板，低于长版；

(3)上样：Marker点样量为5μl，对照蛋白点样量为25μl，准备的样品全部加到样品槽中；

(4)点样完毕后，按红/黑颜色指示标志正确盖上盖子，80-100V恒压跑浓缩胶，120-

150V恒压跑分离胶；

(5)待溴酚蓝指示剂跑至电泳板下端5mm时，关掉电源，停止跑胶；

(6)考马斯亮蓝染色：将凝胶从玻璃板中小心剥出，浸入考马斯亮蓝染色液中，液面能覆盖凝胶表面即可，置于摇床染色1h；

(7)脱色：将使用过的染色液倒入专用的回收瓶中，用自来水漂洗凝胶3次；将凝胶浸入适量的脱色液中，置于摇床上脱色至凝胶背景透明，能清晰观察到蛋白条带为止。

4.一种使用如权利要求1-3任意权利要求所述的检测方法在制备油乳剂蛋白亚单位疫苗中抗原含量和纯度的检测中的应用。

说明书

一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法及

其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 疫苗是目前预防传染性疾病最有效的方法之一。除安全性外，评价一个疫苗的另一个重要指标就是其免疫原性。传统的减毒活疫苗和灭活疫苗仍然是目前最为常用的疫苗，因为两种疫苗都保持了良好的病毒颗粒性状和病毒表面蛋白，并且减毒活疫苗还能在体内复制，能够有效地诱导中和抗体产生。尽管这两类疫苗目前都得到了广泛的应用，但是其毒力返强和灭活不完全的安全性问题仍然不容忽视，尤其是对于那些生物安全级别很高的病毒；另外，这两类疫苗生产工艺都较为复杂、成本较高。因此，利用重组技术来研发亚单位疫苗是现代疫苗学的一个新的方向和趋势，这类疫苗不含病毒的基因组，是一类相对安全的疫苗。且对于那些我们目前还不能培养和有效扩增的病毒，或者是培养的生物安全级别要求很高的病毒，亚单位疫苗是首要的选择。

[0003] 基因工程亚单位疫苗(Subunitvaccine)又称重组亚单位疫苗(Recombinant Subunit Vaccines)或生物合成亚单位疫苗，是利用DNA重组技术将编码病原微生物保护性抗原的基因导入受体菌(如大肠杆菌)或细胞(如293T细胞)，使其在受体中高效表达，分泌保护性抗原，分离纯化保护性抗原再加入佐剂即制成基因工程亚单位疫苗。利用基因工程的方法，不仅能够克隆得到编码病毒保护性抗原的基因，而且能够在体外对其进行改造或修饰，并重新转移到异源生物宿主体内或培养细胞中，使病毒蛋白获得大量表达。基因工程亚单位疫苗就是将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，再以这种生物合成的基因产物制成的亚单位疫苗。因此，基因工程亚单位疫苗易于大规模生产，且成本低廉。用蛋白作为抗原建立的诊断方法，可以将免疫动物和自然感染动物鉴别开来，不干扰流行病学调查；对于发病急、病程短的疾病效果较好；因此它将成为近期投入市场品种最多的生物高技术产品之一。

[0004] 在重组蛋白类疫苗的研发中，蛋白抗原与佐剂吸附后的稳定性也是必须的检测指标之一，这就需要准确测定疫苗成品中的抗原含量。而疫苗成品多是抗原蛋白与佐剂吸附后的胶体状复合物，如何采用适当的方法让蛋白抗原与佐剂完全解离且不破坏抗原的性质，是需要重点解决的一个难题。目前的报道中，有采用柠檬酸钠、盐酸胍等方法将蛋白与佐剂解离的方法，但普遍存在解离不完全，解离时间偏长等问题。特别是在油乳剂疫苗中，由于疫苗本身为油状，使用普通方法破乳解离抗原蛋白的得率很低，且容易导致抗原蛋白变性甚至降解。

[0005] 目前在成品疫苗的质检中，特别是兽用疫苗的质检中，一般采用成品疫苗按照规定的免疫程序免疫靶动物，跟踪后续的抗体效价结果或进行免疫攻毒实验，从而验证本批次疫苗是否符合要求，能否投入市场。因此，找到一种替代方法检测成品疫苗中抗原的含量和纯度是目前兽用疫苗的一个研究重点，这不仅能够节约成本和时间，也能够避免使用动物进行实验，从而节约实验动物的使用量。

发明内容

[0006] 鉴于上述存在的油乳剂疫苗中抗原蛋白解离效率低且易变性降解的问题，以及在成品兽用疫苗的质检中使用靶动物进行实验从而导致成本较高、质检时间长，且需要使用很多实验动物的问题，本发明提供了一种快速检测油乳剂亚单位疫苗中抗原含量和纯度的方法。

[0007] 本发明的方法包括以下步骤：1)使用冷丙酮沉淀疫苗中的蛋白；2)SDS-PAGE电泳；3)将凝胶置于成像仪进行拍摄，保存图片；4)将步骤3)中图片置于灰度扫描仪中，使用软件定义标准蛋白条带的灰度为1，由此得到样品蛋白条带相对于标准蛋白条带的灰度比较结果，再将样品蛋白条带相对于标准蛋白条带的灰度比较结果×标准蛋白的含量，从而得到样品蛋白的含量；4)将步骤3)中图片置于常规灰度扫描仪中，使用软件选中样品蛋白条带所在的泳道，再对该泳道的所有条带进行灰度扫描，从而得到样品蛋白条带相对于样品中所有蛋白条带的比值，该比值即为样品蛋白纯度。

[0008] 本发明的技术方案中，优选地所述油佐剂为水包油佐剂、或水包油包水佐剂或、油包水佐剂。更优选地，所述油佐剂为ISA 201 VG、ISA 35 VG或白油。

[0009] 本发明的技术方案中，优选地，所述的冷丙酮为丙酮置于﹣20℃冰箱预冷处理2h以上获得。

[0010] 本发明的技术方案中，优选地，所述的标准蛋白的含量为2～10μg。

[0011] 本发明的技术方案中，优选地，所述的步骤1)中，使用冷丙酮沉淀疫苗中的蛋白包括以下步骤：a)取理论蛋白含量为2～10μg的疫苗于1.5ml EP管中，根据所取疫苗的体积加入冷丙酮，其中冷丙酮与疫苗的体积比为9:1，放入﹣20℃至少处理1h以上；b)将a)中样品12,000rpm，4℃，离心20min，去除上层液体，留沉淀，待丙酮挥发干燥之后，加入20μl PBS重悬；c)重悬后每管加入5μl 5*loading buffer，沸水中蒸煮10min；12,000rpm，4℃离心
5min，待用。

[0012] 本发明的技术方案中，优选地，所述步骤2)中，所述SDS-PAGE电泳包括以下步骤：(1)将制备好的聚丙烯酰胺凝胶用电泳夹固定至电泳槽中；(2)将10×Tris-Glycine Buffer稀释到1×，倒入电泳槽内，电泳缓冲液液面需没过短板，低于长版；(3)上样：Marker点样量为5μl，对照蛋白点样量为25μl，准备的样品全部加到样品槽中；(4)点样完毕后，按红/黑颜色指示标志正确盖上盖子，80-100V恒压跑浓缩胶，120-150V恒压跑分离胶；(5)待溴酚蓝指示剂跑至电泳板下端5mm时，关掉电源，停止跑胶；(6)考马斯亮蓝染色：将凝胶从玻璃板中小心剥出，浸入考马斯亮蓝染色液中，液面能覆盖凝胶表面即可，置于摇床染色
1h；(7)脱色：将使用过的染色液倒入专用的回收瓶中，用自来水漂洗凝胶3次；将凝胶浸入适量的脱色液中，置于摇床上脱色至凝胶背景透明，能清晰观察到蛋白条带为止。

[0013] 通过本方法能够实现从油乳剂蛋白亚单位疫苗中快速且高效率的得到抗原蛋白，且不会导致抗原蛋白的变性降解，且该方法简单易于重复；同时通过对得到的抗原蛋白进行一次SDS-PAGE检测就能够获得油乳剂蛋白亚单位疫苗中抗原蛋白的含量和纯度的结果，节约了成本、劳动力和时间。

[0014] 因此，本发明不仅解决了油乳剂疫苗中抗原蛋白解离效率低且易变性降解的问题，也解决了成品兽用油乳剂蛋白亚单位疫苗的质检中使用靶动物进行实验的难题。且本发明在油乳剂亚单位疫苗的抗原蛋白含量的定量检测及纯度的检测中准确率能够达到90％以上。

附图说明

[0015] 图1表示疫苗1(猪圆环Cap蛋白亚单位疫苗)SDS-PAGE电泳结果：M是Marker，1是7.5μg标准蛋白，2和3是50μl疫苗1的两个平行样品。

[0016] 图2表示疫苗2(猪流行性腹泻S1，蛋白亚单位疫苗)SDS-PAGE电泳结果：4是Marker，3是5μg标准蛋白，1和2是25μl疫苗2的两个平行样品。

[0017] 图3表示疫苗3(猪瘟E2蛋白亚单位疫苗)SDS-PAGE电泳结果：1是Marker，2是3μg标准蛋白，3和4是100μl疫苗3的两个平行样品。

具体实施方式

[0018] 以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

[0019] 所用试剂均为市售产品。

[0020] 白油购自杭州炼油厂。

[0021] ISA 201 VG和ISA 35 VG购自法国赛比克公司。

[0022] 实施例1冷丙酮沉淀蛋白

[0023] (1)丙酮预先置于﹣20℃冰箱预冷处理至少2h。

[0024] (2)根据疫苗中理论蛋白含量取适量制备好的疫苗1(猪圆环Cap蛋白亚单位疫苗)、疫苗2(猪流行性腹泻S1，蛋白亚单位疫苗)、疫苗3(猪瘟E2蛋白亚单位疫苗)分别于1.5ml EP管中(注：所取疫苗理论蛋白含量一般在2-10μg)，根据所取疫苗的体积加入适量的预冷处理好的冷丙酮，其中冷丙酮与疫苗1、疫苗2、疫苗3的体积比均为9:1，放入﹣20℃处理至少1h。

[0025] (3)将处理好的样品12,000rpm，4℃，20min离心，小心去除上层液体，留沉淀；如果液体不易取干净，可12,000rpm，4℃再离心5min，待丙酮挥发干燥之后，加入20μl PBS重悬。

[0026] (4)重悬后每管加入5μl 5*loading buffer，沸水中蒸煮10min；12,000rpm，4℃离心5min，待用。

[0027] 实施例2聚丙烯酰氨凝胶制备

[0028] (1)玻璃板选择(spacer也就是凝胶厚度的选择)：板间隔1.5mm，10孔胶梳规格：最大上样量：40μl，

[0029] (2)凝胶浓度选择：按照表1选择合适的凝胶浓度

[0030] 表1

[0031]

[0032] (3)装板：选择合适的玻璃板，将玻璃板擦拭干净，组装玻璃板。

[0033] (4)按照现有技术配制分离胶：板间隔1.5mm凝胶配置体积：7-8ml/块。例如配制不同体积的10％的分离胶的配方如表2：

[0034] 表2

[0035]

[0036]

[0037] (5)将步骤(4)中配制的分离胶溶液迅速摇匀，沿玻璃胶板的间隙一边迅速灌入分离胶，灌制分离胶后迅速用异丙醇封液面。

[0038] (6)待分离胶凝固后，倒掉上层液，用滤纸将未倒净的吸干。

[0039] (7)按照现有技术配制表3配方的浓缩胶：

[0040] 表3

[0041]

[0042] (8)浓缩胶配置完成后迅速摇匀，沿玻璃板间隙的一边，迅速灌浓缩胶，注意，请勿打入气泡，迅速插入配套的齿梳，静置至浓缩胶完全凝固。

[0043] 实施例3聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)

[0044] (1)将制备好的聚丙烯酰胺凝胶用电泳夹固定至电泳槽中。

[0045] (2)将10×Tris-Glycine Buffer稀释到1×，倒入电泳槽内，电泳缓冲液液面需没过短板，低于长版(一般电泳缓冲液液面需加至短板和长板之间)。

[0046] (3)上样：包括Marker、准备好标准对照蛋白和实施例1中制备的样品，其中Marker点样量为5μl，对照蛋白点样量为25μl，准备的样品全部加到样品槽中(可能不止25μl)。

[0047] (4)点样完毕后，按红/黑颜色指示标志正确盖上盖子，80-100V恒压跑浓缩胶，120-150V恒压跑分离胶。

[0048] (5)待溴酚蓝指示剂跑至电泳板下端5mm时，关掉电源，停止跑胶。

[0049] (6)考马斯亮蓝染色：将凝胶从玻璃板中小心剥出，浸入考马斯亮蓝染色液中，液面能覆盖凝胶表面即可，置于摇床染色1h。

[0050] (7)脱色：将使用过的染色液倒入专用的回收瓶中，用自来水漂洗凝胶3次。将凝胶浸入适量的脱色液中，置于摇床上脱色至凝胶背景透明，能清晰观察到蛋白条带为止。

[0051] (8)将凝胶置于常规成像仪进行拍摄、保存数据。

[0052] (9)将(8)中图片置于常规灰度扫描仪中，使用软件定义标准蛋白条带的灰度为1，由此得到样品蛋白条带相对于标准蛋白条带的灰度比较结果，再将样品蛋白条带相对于标准蛋白条带的灰度比较结果×标准蛋白的含量，从而得到样品蛋白的含量。

[0053] (10)将(8)中图片置于常规灰度扫描仪中，使用软件选中样品蛋白条带所在的泳道，再对该泳道的所有条带进行灰度扫描，从而得到样品蛋白条带相对于样品中所有蛋白条带的比值，该比值即为样品蛋白纯度。

[0054] 实施例4三种疫苗检测结果

[0055] (1)为更好的说明本发明，本实验室按照实施例1、实施例2和实施例3的方法实施了3种疫苗的蛋白含量和纯度检测，具体疫苗信息如表4所示：

[0056] 表4

[0057]

[0058] (2)具体检测结果如图1、图2、图3所示。

[0059] (3)疫苗中蛋白含量灰度比较结果如表5所示：

[0060] 表5

[0061]

[0062] (4)疫苗中蛋白纯度灰度比较结果如表6所示：

[0063] 表6

[0064]

[0065] 本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。