一种胱抑素C的检测试剂及方法

摘要

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，特别涉及一种胱抑素C的检测试剂及方法。该检测试剂由试剂1和试剂2组成；试剂1包括氯化铵、聚氧乙烯月桂醚、氯化钠、PEG6000、防腐剂和水；试剂2包括包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球、Tris‑Hcl缓冲液、蔗糖、明胶、NP30、防腐剂和水。本发明试剂的检测结果准确性高、精密度好，线性范围宽，特异性好，稳定性好，抗干扰能力强，方便在全自动生化分析仪上检测，适用范围广，便于推广使用。

权利要求

1.一种胱抑素C的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂由试剂1和试剂2组成；

所述试剂1由氯化铵、聚氧乙烯月桂醚、氯化钠、PEG6000、防腐剂和水组成；

所述试剂2由包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球、Tris-Hcl缓冲液、蔗糖、明胶、NP30、防腐剂和水组成；

所述试剂1中各组分的含量为：

氯化铵：0.2～1.0mmol/L；

聚氧乙烯月桂醚：0.1～1.0wt％；

氯化钠：150mmol/L；

PEG6000：2wt％；

防腐剂：0.01～0.05wt％；

所述试剂1的pH值为7～9；

所述试剂2中各组分的含量为：

包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球：0.05～0.2wt％；

Tris-Hcl缓冲液：20～80mmol/L；

蔗糖：1～5wt％；

明胶：0.2～0.8wt％；

NP30：0.05～0.2wt％；

防腐剂：0.3wt％；

所述试剂2的pH值为6～8。

2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述试剂1中防腐剂为叠氮钠，所述试剂2中防腐剂为Proclin300。

3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球是由胱抑素C单克隆抗体和胶乳微球采用化学交联法得到。

4.根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述胱抑素C单克隆抗体为鼠抗人胱抑素C单克隆抗体。

5.根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述胶乳微球为疏水微球，所述疏水微球为带磺酸基基团、羧基基团或醛基基团的一种或两种以上的胶乳微球。

6.根据权利要求3或5所述的检测试剂，其特征在于，所述胶乳微球的平均粒径为80～

120nm。

7.根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述胱抑素C单克隆抗体与所述胶乳微球的质量比为(0.1～1)：100。

说明书

一种胱抑素C的检测试剂及方法

技术领域

[0001] 本发明涉及体外诊断试剂技术领域，特别涉及一种胱抑素C的检测试剂及方法。

背景技术

[0002] 胱抑素C是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，分子量为13.3KD，由122个氨基酸残基组成，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的内源性标志物，并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代谢分解，不返回血液，因此，其血中浓度由肾小球滤过决定，而不依赖任何外来因素，如性别、年龄、饮食的影响，是一种反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物。它是新近发展起来的评估肾功能的一种敏感性好、特异性高的指标。

[0003] 目前，胱抑素C的检测方法有：放射免疫法、ELISA法、免疫荧光法和胶乳免疫比浊法等，其中放射免疫法因其存在放射性污染，操作复杂，检测时间长已渐被市场淘汰；酶联免疫法受人为因素影响较大，且不适合急诊样本的检测；免疫荧光法灵敏度好，特异性强，结果快速、准确，但此方法需要昂贵的仪器，测定成本高，临床难以普及。其中免疫比浊法，快速简便、精密度高、易于自动化、适于大批量标本的同时检测，便于推广，适合临床检测。但需要的抗体用量大，对抗体要求高(应具有高特异性、高滴度和高亲和力)，颗粒大小不同的胱抑素C会产生不一致的光散射与光吸收，而且受标本中的基质的影响较明显，容易受到类风湿因子的干扰，所以研发一种成本低、特异性好、偏差小的检测方法是目前的市场需求。

[0004] 公开号为CN104360081A中公开了一种胱抑素C的检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，试剂R1主要由缓冲液1、稳定剂1、防腐剂1、EDTA、增凝剂和保护剂1组成，试剂R2主要由交联胱抑素C抗体的聚苯乙烯胶乳微球、缓冲液2、稳定剂2、防腐剂2、保护剂2组成。但实施例中公开的试剂盒在抗干扰能力方面还存在一定的欠缺。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种胱抑素C的检测试剂及方法。该检测试剂抗干扰能力强、特异性高、准确度高、稳定性好。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明提供了一种胱抑素C的检测试剂，检测试剂由试剂1和试剂2组成；

[0008] 试剂1包括氯化铵、聚氧乙烯月桂醚、氯化钠、PEG6000、防腐剂和水；

[0009] 试剂2包括包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球、Tris-Hcl缓冲液、蔗糖、明胶、NP30、防腐剂和水。

[0010] 作为优选，试剂1中各组分的含量为：

[0011] 氯化铵：0.2～1.0mmol/L；

[0012] 聚氧乙烯月桂醚：0.1～1.0wt％；

[0013] 氯化钠：150mmol/L；

[0014] PEG6000：2wt％；

[0015] 防腐剂：0.01～0.05wt％；

[0016] 试剂1的pH值为7～9。

[0017] 优选地，试剂1中各组分的含量为：

[0018] 氯化铵：0.2mmol/L；

[0019] 聚氧乙烯月桂醚：0.3wt％；

[0020] 氯化钠：150mmol/L；

[0021] PEG6000：2wt％；

[0022] 防腐剂：0.05wt％；

[0023] 试剂1的pH值为7.5。

[0024] 作为优选，试剂2中各组分的含量为：

[0025] 包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球：0.05～0.2wt％；

[0026] Tris-Hcl缓冲液：20～80mmol/L；

[0027] 蔗糖：1～5wt％；

[0028] 明胶：0.2～0.8wt％；

[0029] NP30：0.05～0.2wt％；

[0030] 防腐剂：0.3wt％；

[0031] 试剂2的pH值为6～8。

[0032] 优选地，试剂2中各组分的含量为：

[0033] 包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球：0.1wt％；

[0034] Tris-Hcl缓冲液：50mmol/L；

[0035] 蔗糖：3wt％；

[0036] 明胶：0.5wt％；

[0037] NP30：0.1wt％；

[0038] 防腐剂：0.3wt％；

[0039] 试剂2的pH值为7。

[0040] 作为优选，试剂1中防腐剂为叠氮钠。

[0041] 作为优选，试剂2中防腐剂为Proclin300。

[0042] 在本发明提供的实施例中，包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球是由胱抑素C单克隆抗体和胶乳微球采用化学交联法得到。

[0043] 作为优选，抗体包被胶乳的化学交联剂为乙二胺(EDA)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。

[0044] 作为优选，抗体包被胶乳的封闭剂为甘氨酸缓冲液。

[0045] 作为优选，甘氨酸缓冲液的质量浓度为1％～5％，pH值6.5～8.5。

[0046] 作为优选，胱抑素C单克隆抗体为鼠抗人载胱抑素C单克隆抗体。

[0047] 作为优选，胶乳微球为疏水微球，所述疏水微球为带磺酸基基团、羧基基团或醛基基团的一种或两种以上的胶乳微球。

[0048] 作为优选，胶乳微球的平均粒径为80～120nm。

[0049] 在本发明提供的实施例中，胶乳微球的平均粒径为99nm。

[0050] 作为优选，胱抑素C单克隆抗体与胶乳微球的质量比为(0.1～1)：100。

[0051] 本发明还一种检测胱抑素C含量的方法，包括：待测样本加入试剂1中，孵育5～10min；再加入试剂2，孵育5～10min，在550nm波长下测定吸光度，通过胱抑素C的标准曲线得到待测样本中胱抑素C的含量；

[0052] 试剂1包括氯化铵、聚氧乙烯月桂醚、氯化钠、PEG6000、防腐剂和水；

[0053] 试剂2包括包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球、Tris-Hcl缓冲液、蔗糖、明胶、NP30、防腐剂和水。

[0054] 作为优选，孵育的温度为37℃。

[0055] 作为优选，孵育的时间为5分钟。

[0056] 本发明提供了一种胱抑素C的检测试剂及方法。该检测试剂由试剂1和试剂2组成；试剂1包括氯化铵、聚氧乙烯月桂醚、氯化钠、PEG6000、防腐剂和水；试剂2包括包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球、Tris-Hcl缓冲液、蔗糖、明胶、NP30、防腐剂和水。本发明至少具有如下优势之一：

[0057] (1)本发明试剂的操作过程简单，相较于传统双试剂胶乳免疫比浊法，工作试剂无需配制，可直接在各种自动分析仪上使用。

[0058] (2)采用化学偶联的方法在胶乳微球上包被抗体，试剂稳定性良好。

[0059] (3)类风湿因子、溶血、黄疸和脂浊样本对测定结果没有明显干扰。

[0060] (4)本发明试剂的检测结果准确性高、灵敏度好，精密度好，重复性好，线性范围宽，特异性好，稳定性好，保存期长，方便在全自动生化分析仪上检测，适用范围广，便于推广使用。可很大程度上降低医院检测人员的工作强度，提高其工作效率，可广泛应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定人血清中胱抑素C的含量。

具体实施方式

[0061] 本发明公开了一种胱抑素C的检测试剂及方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0062] 中英文对照：

[0063] Brij-35：聚氧乙烯月桂醚；

[0064] PEG：聚乙二醇；

[0065] NP30：壬基酚聚氧乙烯(30)醚。

[0066] 本发明提供的胱抑素C的检测试剂及方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。

[0067] 以下实施例中市售国产胱抑素C试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)的配方如下：

[0068] 试剂1：50mmol/L含1.0％NaN3的甘氨酸缓冲液

[0069] 试剂2：抗人Cys-C-IgG的致敏乳胶颗粒悬液

[0070] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0071] 实施例1：本发明检测胱抑素C的试剂及方法

[0072] 本实施例检测胱抑素C的试剂包括：

[0073] 试剂1：氯化铵0.2mol/L，叠氮钠0.05％，Brij-35 0.3％，氯化钠150mmol/L，PEG6000 2％，用氨水调pH值，pH 7.5；

[0074] 试剂2：抗体包被的胶乳微粒(0.1％浓度)，Tris-Hcl缓冲液50mmol/L，蔗糖3％，明胶0.5％，NP30 0.1％，Proclin300 0.3％，pH7.0。

[0075] 其中，抗体包被的胶乳微粒的制备方法为：

[0076] (1)取1ml(10mg/mL)洗涤处理后的乳胶颗粒，加入到50mL的乙二胺(EDA，1mol/L，pH4.75)中，孵育90min。

[0077] (2)加入固体的EDC至终浓度10mM，缓慢搅拌90min。

[0078] (3)用纯净水充分洗涤，最后一次重悬于pH7.5的磷酸盐buffer中。

[0079] (4)抗体浓度大约7.5mg/ml10％的乳胶颗粒(直径99nm)，加入到0.05mol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCl的缓冲液中(pH7.5)，反应6小时。

[0080] (5)加入终止液终止反应。终止液：甘氨酸1％，pH7.5，充分混匀2小时。

[0081] 检测方法：由全自动生化分析仪加入3μL样本，180μL试剂1，37℃反应5分钟，再加入60μL试剂2，37℃反应5分钟，测定550nm的吸光度值，根据标准曲线计算样品中胱抑素C的百分含量。

[0082] 实施例2：本发明试剂及方法的准确度分析

[0083] 试验仪器：日立7080全自动生化分析仪

[0084] 检测样品：20名体检者血样；

[0085] 对比方法试剂盒：市售国产胱抑素C试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)；

[0086] 用实施例1的检测方法和对比方法分别测定20例样品，检测结果见表1。

[0087] 表1分析结果

[0088]

[0089] 结果显示，根据检测结果计算出的R2值为0.988，大于0.95，表明本发明所述方法检测结果与对比试剂盒检测结果无明显差异，具有较高准确度(符合度)。

[0090] 实施例3：本发明试剂及方法的精密度分析

[0091] 试验仪器：日立7080全自动生化分析仪；

[0092] 检测样品：任意一血清样品：

[0093] 采用实施例1的检测方法和对比专利(CN201410735830.9-一种改良的胱抑素C检测试剂盒)实施例3的检测方法对同一待测样品重复检测10次，检测结果见表2。

[0094] 表2检测样品胱抑素C浓度(10次)及标准差率(变异系数)

[0095]

[0096] 结果显示，本发明标准差率为2.4％，小于标准要求的10％，小于对比专利方法的3.81％，表明本发明所述方法具有较高的精密度。

[0097] 实施例4：本发明试剂及方法的线性分析

[0098] 试验仪器：日立7080全自动生化分析仪；

[0099] 检测样品：高胱抑素C血清样品(8mg/L)；

[0100] 将胱抑素C血清样品稀释成6个不同的浓度，依次为0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、8.0mg/L，采用实施例1的检测方法对上述样品的每个浓度进行2次检测，计算相关系数R值，其中，实施例1的检测结果见表3。

[0101] 表3线性试验结果

[0102]

[0103] 结果显示，根据实施例1检测结果计算出的R值为0.9966，接近于1，表明本发明方法在0.0mg/L-8.0mg/L的范围内具有良好的线性度。

[0104] 实施例5：本发明检测胱抑素C的试剂盒

[0105] 本实施例检测胱抑素C的试剂包括：

[0106] 试剂1：氯化铵0.5mol/L，叠氮钠0.03％，Brij-35 0.1％，氯化钠150m mol/L，PEG6000 2％，用氨水调pH值，pH 7.0；

[0107] 试剂2：抗体包被的胶乳微粒(0.05％浓度)，Tris-Hcl缓冲液80mmol/L，蔗糖1％，明胶0.8％，NP30 0.05％，Proclin300 0.3％，pH6.0。

[0108] 其中，抗体包被的胶乳微粒的制备方法为：

[0109] (1)取1ml(10mg/mL)洗涤处理后的乳胶颗粒，加入到50mL的乙二胺(EDA，1mol/L，pH4.75)中，孵育90min。

[0110] (2)加入固体的EDC至终浓度10mM，缓慢搅拌90min。

[0111] (3)用纯净水充分洗涤，最后一次重悬于pH7.5的磷酸盐buffer中。

[0112] (4)抗体浓度大约7.5mg/ml 10％的乳胶颗粒(直径99nm)，加入到0.05mol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCl的缓冲液中(pH7.5)，反应6小时。

[0113] (5)加入终止液终止反应。终止液：甘氨酸1％，pH7.5，充分混匀2小时。

[0114] 检测方法：由全自动生化分析仪加入3μL样本，180μL试剂1，37℃反应5分钟，再加入60μL试剂2，37℃反应5分钟，测定550nm的吸光度值，根据标准曲线计算样品中胱抑素C的百分含量。

[0115] 实施例6：本发明检测胱抑素C的试剂盒

[0116] 本实施例检测胱抑素C的试剂包括：

[0117] 试剂1：氯化铵1.0mol/L，叠氮钠0.01％，Brij-35 1.0％，氯化钠150m mol/L，PEG6000 2％，用氨水调pH值，pH 9；

[0118] 试剂2：抗体包被的胶乳微粒(0.2％浓度)，Tris-Hcl缓冲液20mmol/L，蔗糖5％，明胶0.2％，NP30 0.2％，Proclin300 0.3％，pH8.0。

[0119] 其中，抗体包被的胶乳微粒的制备方法为：

[0120] (1)取1ml(10mg/mL)洗涤处理后的乳胶颗粒，加入到50mL的乙二胺(EDA，1mol/L，pH4.75)中，孵育90min。

[0121] (2)加入固体的EDC至终浓度10mM，缓慢搅拌90min。

[0122] (3)用纯净水充分洗涤，最后一次重悬于pH7.5的磷酸盐buffer中。

[0123] (4)抗体浓度大约7.5mg/ml10％的乳胶颗粒(直径99nm)，加入到0.05mol/L磷酸盐，0.15mol/L NaCl的缓冲液中(pH7.5)，反应6小时。

[0124] (5)加入终止液终止反应。终止液：甘氨酸1％，pH7.5，充分混匀2小时。

[0125] 检测方法：由全自动生化分析仪加入3μL样本，180μL试剂1，37℃反应5分钟，再加入60μL试剂2，37℃反应5分钟，测定550nm的吸光度值，根据标准曲线计算样品中胱抑素C的百分含量。

[0126] 实施例7：本发明试剂的抗干扰性分析

[0127] 在同一份血清样本中加入不同浓度的类风湿因子(50，150，250，500、800IU/mL)；血红蛋白(0，1.25，2.5，5，10g/L)；胆红素(0，128，256，512，1024μmol/L)；甘油三酯(0，10，
20，40，80mmol/L)采用实施例1、5、6的检测方法和对比专利(CN201410735830.9-一种改良的胱抑素C检测试剂盒)实施例3的检测方法与未加入类风湿因子，血红蛋白，胆红素，甘油三酯的血清做对比，计算样品胱抑素C浓度的平均值和偏差，其检测结果见表4-7。

[0128] 表4抗类风湿因子干扰实验结果

[0129]

[0130] 表5抗溶血干扰结果

[0131]

[0132] 表6抗黄疸干扰实验结果

[0133]

[0134]

[0135] 表7抗黄疸干扰实验结果

[0136]

[0137]

[0138] 结果显示，本发明实施例1、5、6的试剂类风湿因子≤800IU/mL，血红蛋白≤10g/L，胆红素≤1024μmol/L，甘油三酯≤80mmol/L对测值没有影响，而对比专利仅在类风湿因子<300IU/mL，血红蛋白≤5g/L，胆红素≤512μmol/L，甘油三酯≤80mmol/L对测值没有影响；可见本申请的抗干扰能力好于对比专利。

[0139] 实施例8：本发明试剂的稳定性

[0140] 取本发明实施例6的检测试剂和本发明实施例6配方中不添加蔗糖的试剂进行常规贮存稳定性试验，2-8℃放置分别按实例6的检测方法，2，5，8，10，12个月进行检测，检测低值质控和中值质控的标准偏差，其检测结果见表8。

[0141] 表8稳定性实验结果

[0142]

[0143] 结果显示，添加蔗糖的本发明试剂稳定性好于不添加蔗糖的本发明试剂，可见，蔗糖的添加起到了增强本发明试剂稳定性的效果。

[0144] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。