一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取方法

摘要

一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)、乙酸乙酯提取：在酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片中加入乙酸乙酯，室温搅拌5‑18小时，离心处理，弃上清液，保留沉淀碎片，红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片与乙酸乙酯的比例为1g：5‑8ml；(2)、无水乙醇搅洗：往步骤(1)中得到的沉淀碎片加入无水乙醇搅拌均匀，离心处理，弃上清液，保留沉淀碎片；(3)、无水乙醇提取：往步骤(2)中得到的沉淀碎片中加入无水乙醇，室温搅拌5‑18小时，离心处理，弃上清液，得到最终的沉淀碎片，步骤(2)中得到的沉淀碎片与无水乙醇的比例为1g：5‑8ml。

权利要求

1.一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)、乙酸乙酯提取：在酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片中加入乙酸乙酯，室温搅拌5-18小时，离心处理，弃上清液，保留沉淀碎片，红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片与乙酸乙酯的比例为1g：5-8ml；

(2)、无水乙醇搅洗：往步骤(1)中得到的沉淀碎片加入无水乙醇搅拌均匀，离心处理，弃上清液，保留沉淀碎片；

(3)、无水乙醇提取：往步骤(2)中得到的沉淀碎片中加入无水乙醇，室温搅拌5-18小时，离心处理，弃上清液，得到最终的沉淀碎片，步骤(2)中得到的沉淀碎片与无水乙醇的比例为1g：5-8ml；

所述步骤(1)至步骤(3)的每个步骤中的离心处理的参数为：3136～4000g，6-8℃，10-

30min。

2.根据权利要求1所述的一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取方法，其特征在于：还包括往步骤(3)中得到的最终的沉淀碎片加入无水乙醇、然后转入干燥工序进行干燥，制得原粉。

3.根据权利要求2所述的一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取方法，其特征在于：所述最终的沉淀碎片与无水乙醇的比例为1g：2ml。

4.根据权利要求1所述的一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取方法，其特征在于：进行步骤(2)时，步骤(1)中得到的沉淀碎片与无水乙醇的比例为1g：5-8ml。

5.根据权利要求1所述的一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取方法，其特征在于：所述步骤(1)至步骤(3)的每个步骤均重复1-2遍。

说明书

一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取方法

技术领域

[0001] 本发明属于微生物制药技术领域，具体涉及一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取方法。

背景技术

[0002] 红色诺卡氏菌(Nocardia rubra)是具有免疫活性的微生物，经过细胞破碎、去除细胞内容物和蛋白质及脂类等组份物质，得到其细胞壁骨架，这是一种含诺卡氏霉菌酸、中性多糖以及粘肽的活性物质，可刺激细胞免疫功能，并促进多种细胞因子分泌，参与抗肿瘤免疫过程，用于多种肿瘤的治疗或辅助治疗；亦可用于开发新剂型和新适应症如皮肤病变及胃肠道疾病等治疗。

[0003] 现有技术中，溶媒提取工艺为：“乙醇、乙醚、三氯甲烷、甲醇单独或混合分步提取”，此工艺所用甲醇、乙醚和三氯甲烷为有毒有害的有机溶剂，在制品中有可能有微量残留留下隐患，并可能在操作过程中对人员造成伤害和对环境造成破坏，有待进一步改进。

发明内容

[0004] 本发明的目的是克服现有技术的缺点，提供一种可节省提取时间、降低成本、避免在操作过程中对人员造成伤害和对环境造成破坏的红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取方法。

[0005] 本发明采用如下技术方案：

[0006] 一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取方法，包括以下步骤：

[0007] (1)、乙酸乙酯提取：在酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片中加入乙酸乙酯，室温搅拌5-18小时，离心处理，弃上清液，保留沉淀碎片，红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片与乙酸乙酯的比例为1g：5-8ml；

[0008] (2)、无水乙醇搅洗：往步骤(1)中得到的沉淀碎片加入无水乙醇搅拌均匀，离心处理，弃上清液，保留沉淀碎片；

[0009] (3)、无水乙醇提取：往步骤(2)中得到的沉淀碎片中加入无水乙醇，室温搅拌5-18小时，离心处理，弃上清液，得到最终的沉淀碎片，步骤(2)中得到的沉淀碎片与无水乙醇的比例为1g：5-8ml。

[0010] 进一步的，还包括往步骤(3)中得到的最终的沉淀碎片加入无水乙醇、然后转入干燥工序进行干燥，制得原粉。

[0011] 进一步的，所述最终的沉淀碎片与无水乙醇的比例为1-3ml：1g。

[0012] 进一步的，所述步骤(1)至步骤(3)的每个步骤中的离心处理的参数为：3136～4000g，6-8℃，10-30min。

[0013] 进一步的，进行步骤(2)时，步骤(1)中得到的沉淀碎片与无水乙醇的比例为1g：5-8ml。

[0014] 进一步的，所述步骤(1)至步骤(3)的每个步骤均可重复1-2遍。

[0015] 由上述对本发明的描述可知，与现有技术相比，本发明的有益效果是：整个提取过程中先采用乙酸乙酯提取，再用无水乙醇洗涤，最后用无水乙醇提取，在不影响红色诺卡氏菌细胞壁骨架疗效的同时减少有机溶剂种类的使用，减少提取步骤，在降低提取时间、节约成本的同时降低了环境污染和在操作过程中可能对人员造成的伤害；与现有技术中的传统工艺相比，本发明能有效去除细胞壁中的脂类、色素、蛋白质类杂质，同时能有效减低有机溶剂残留，避免了传统工艺中出现的甲醇和三氯甲烷等毒性较高的有机溶剂的残留可能，采用的乙酸乙酯毒性较低，产品中可能残留的无水乙醇属低毒有机溶剂，远低于国家药典标准，由此提高了产品用药安全性，保证了产品质量。

具体实施方式

[0016] 以下通过具体实施方式对本发明作进一步描述。

[0017] 一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取方法，包括以下步骤：

[0018] (1)、乙酸乙酯提取：在酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片中加入乙酸乙酯，室温搅拌5-18小时，离心处理，弃上清液，保留沉淀碎片，红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片与乙酸乙酯的比例为1g：5-8ml，其中，离心处理的参数为：3136～4000g，8℃，20min；

[0019] (2)、重复步骤(1)1-2遍；

[0020] (3)、无水乙醇搅洗：往步骤(2)中得到的沉淀碎片加入无水乙醇搅拌均匀，离心处理，弃上清液，保留沉淀碎片，其中，离心处理的参数为：3136～4000g，8℃，20min；

[0021] (4)、重复步骤(3)1-2遍；

[0022] (5)、无水乙醇提取：往步骤(2)中得到的沉淀碎片中加入无水乙醇，室温搅拌5-18小时，离心处理，弃上清液，得到最终的沉淀碎片，步骤(2)中得到的沉淀碎片与无水乙醇的比例为1g：5-8ml，其中，离心处理的参数为：3136～4000g，8℃，20min；

[0023] (6)、重复步骤(5)1-2遍；

[0024] (7)、往步骤(6)得到的最终的沉淀碎片中加入无水乙醇，转入干燥工序进行干燥，制得原粉，其中无水乙醇与最终的沉淀碎片的比例为2ml：1g。

[0025] 实施例1

[0026] 一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取方法，包括以下步骤：

[0027] (1)、将乙酸乙酯按照乙酸乙酯与红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片为6ml：1g的比例加入酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片中，至常温下、磁力搅拌5小时，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片；

[0028] (2)、将乙酸乙酯加入步骤(1)离心处理得到的沉淀碎片，至常温下、磁力搅拌16小时，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片，其中，乙酸乙酯与步骤(1)得到的沉淀碎片的比例为6ml：1g；

[0029] (3)、将无水乙醇按无水乙醇与步骤(2)中得到的沉淀碎片为6ml：1g的比例加入步骤(2)中得到的沉淀碎片中搅匀、洗涤1次，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片；

[0030] (4)、将无水乙醇按无水乙醇与步骤(3)得到的沉淀碎片为6ml：1g的比例加入步骤(3)离心处理得到的沉淀碎片，至常温下、磁力搅拌5小时，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片；

[0031] (5)、将无水乙醇按无水乙醇与步骤(4)得到的沉淀碎片为6ml：1g的比例加入步骤(4)离心处理得到的沉淀碎片，至常温下、磁力搅拌16小时，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，得最终的沉淀碎片；

[0032] (6)、将无水乙醇按照无水乙醇与步骤(5)中得到的最终的沉淀碎片为2ml：1g的比例加入沉淀碎片中搅匀，转入干燥工序进行干燥，得原粉。

[0033] 实施例2

[0034] 一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取方法，包括以下步骤：

[0035] (1)、将乙酸乙酯按照乙酸乙酯与红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片为5ml：1g的比例加入酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片中，至常温下、磁力搅拌7小时，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片；

[0036] (2)、将乙酸乙酯加入步骤(1)离心处理得到的沉淀碎片，至常温下、磁力搅拌15小时，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片，其中，乙酸乙酯与步骤(1)得到的沉淀碎片的比例为5ml：1g；

[0037] (3)、将无水乙醇按无水乙醇与步骤(2)中得到的沉淀碎片为5ml：1g的比例加入步骤(2)中得到的沉淀碎片中搅匀、洗涤1次，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片；

[0038] (4)、将无水乙醇按无水乙醇与步骤(3)得到的沉淀碎片为5ml：1g的比例加入步骤(3)离心处理得到的沉淀碎片，至常温下、磁力搅拌7小时，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片；

[0039] (5)、将无水乙醇按无水乙醇与步骤(4)得到的沉淀碎片为5ml：1g的比例加入步骤(4)离心处理得到的沉淀碎片，至常温下、磁力搅拌15小时，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，得最终的沉淀碎片；

[0040] (6)、将无水乙醇按照无水乙醇与步骤(5)中得到的最终的沉淀碎片为2ml：1g的比例加入沉淀碎片中搅匀，转入干燥工序进行干燥，得原粉。

[0041] 实施例3

[0042] 一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取方法，包括以下步骤：

[0043] (1)、将乙酸乙酯按照乙酸乙酯与红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片为8ml：1g的比例加入酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片中，至常温下、磁力搅拌6小时，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片；

[0044] (2)、将乙酸乙酯加入步骤(1)离心处理得到的沉淀碎片，至常温下、磁力搅拌18小时，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片，其中，乙酸乙酯与步骤(1)得到的沉淀碎片的比例为8ml：1g；

[0045] (3)、将无水乙醇按无水乙醇与步骤(2)中得到的沉淀碎片为8ml：1g的比例加入步骤(2)中得到的沉淀碎片中搅匀、洗涤1次，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片；

[0046] (4)、将无水乙醇按无水乙醇与步骤(3)得到的沉淀碎片为8ml：1g的比例加入步骤(3)离心处理得到的沉淀碎片，至常温下、磁力搅拌6小时，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片；

[0047] (5)、将无水乙醇按无水乙醇与步骤(4)得到的沉淀碎片为8ml：1g的比例加入步骤(4)离心处理得到的沉淀碎片，至常温下、磁力搅拌18小时，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，得最终的沉淀碎片；

[0048] (6)、将无水乙醇按照无水乙醇与步骤(5)中得到的最终的沉淀碎片为2ml：1g的比例加入沉淀碎片中搅匀，转入干燥工序进行干燥，得原粉。

[0049] 对比例

[0050] 现有技术中一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取方法，包括以下步骤：

[0051] (1)、将无水乙醇加入酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片，至20～24℃恒温下、磁力搅拌7～18h，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片，其中，无水乙醇与红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片的比例为6ml：1g；

[0052] (2)、将无水乙醇加入步骤(1)离心处理得到的沉淀碎片，至20～24℃恒温下、磁力搅拌7～18h，离心处理：3136g，8℃，15min，弃上清液，留沉淀碎片；其中，无水乙醇与红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片的比例为6ml：1g；

[0053] (3)、无水乙醇、无水乙醚按1：1的比例加入步骤(2)中得到沉淀碎片中搅匀，至20～24℃恒温下、磁力搅拌7～18h，离心处理：3136g，-4℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片，其中，乙醇-乙醚混合溶液与红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片的比例为6ml：1g；

[0054] (4)、无水乙醇、无水乙醚按1：1的比例加入步骤(3)中得到的沉淀碎片中搅匀，至20～24℃恒温下、磁力搅拌7～18h，离心处理：3136g，-4℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片，其中，乙醇-乙醚混合溶液与红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片的比例为6ml：1g；

[0055] (5)、将三氯甲烷加入步骤(4)中得到的沉淀碎片中搅匀，至20～24℃恒温下、磁力搅拌7～18h，三氯甲烷与沉淀碎片的比例为3ml：1g，加入甲醇进行离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片，其中，甲醇与沉淀碎片的比例为5ml：1g；

[0056] (6)、将三氯甲烷加入步骤(5)中得到的沉淀碎片中搅匀，至20～24℃恒温下、磁力搅拌7～18h，三氯甲烷与沉淀碎片的比例为3ml：1g，加入甲醇进行离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片，其中，甲醇与沉淀碎片的比例为5ml：1g；

[0057] (7)、将甲醇加入步骤(6)中得到的沉淀碎片中搅匀、洗涤1次，三氯甲烷与沉淀碎片的比例为6ml：1g，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，留沉淀碎片；

[0058] (8)、将无水乙醇加入步骤(7)中得到的沉淀碎片中搅匀，至20～24℃恒温下、磁力搅拌7～18h，离心处理：3136g，8℃，20min，弃上清液，得最终的沉淀碎片，无水乙醇与细胞壁骨架碎片的比例为6ml：1g；

[0059] (9)、往步骤(8)中得到的最终的沉淀碎片再加入无水乙醇，然后转移至干燥容器进行干燥，得原粉，其中，无水乙醇与最终的沉淀碎片的比例为2ml：1g。

[0060] 将实施例1、实施例2、实施例3和对比例中干燥得到的原粉，经原粉鉴定、乳化，乳化液测其阿拉伯糖含量、取样做抑瘤等相关检测，得到如下的实验数据：

[0061]

[0062]

[0063] 通过上述的表格可知：实施例1、实施例2和实施例3相较对比例而言，原粉性状稳定，质量可靠、安全、有效，特别是实施例1，原粉原有相关特性更显著，阿拉伯糖含量、抑瘤率高；创新后的提取工艺不仅满足产品质量要求，又可减少环境污染，保证人员健康指数，而且降低生产成本，缩短生产时间，有效避免工艺操作冗长带来的污染风险，由此工艺生产出来的红色诺卡氏菌细胞壁骨架原粉不仅可用于注射用红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂的生产，还可以用于新型剂型、新适应症产品的开发。

[0064] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能以此限定本发明实施的范围，即依本发明申请专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明专利涵盖的范围内。