2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶及其提取方法和应用

摘要

本发明提供了一种名称为2‑甲基‑5‑(3,4‑二羟基苯基)吡啶的化合物。该化合物具有清除氧自由基的能力，在治疗与人体自由基破坏细胞功能有关的疾病方面有广阔的应用前景。本发明还提供了2‑甲基‑5‑(3,4‑二羟基苯基)吡啶的提取方法，首先使用醇溶液对喙尾琵琶甲粉体进行冷浸提取，得到提取液，再通过萃取、第一硅胶柱层析分离、第二硅胶柱层析分离、ODS反相柱层析分离、第三硅胶柱层析分离和凝胶柱层析分离得到2‑甲基‑5‑(3,4‑二羟基苯基)吡啶。本发明提供的提取方法步骤简单，成本低，且原料来源广泛，容易进行产业化生产。

权利要求

1.2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶；所述2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶从喙尾琵琶甲中提取得到。

2.2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶的提取方法，包括以下步骤：使用醇溶液对喙尾琵琶甲粉体进行冷浸提取，得到提取液；

将所述提取液依次进行石油醚萃取、氯代甲烷萃取和乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；

将所述乙酸乙酯萃取物进行第一硅胶柱层析分离，得到含第一粗产物的流分；所述第一硅胶柱层析分离的洗脱剂为石油醚-丙酮体系或石油醚-氯仿体系；

将所述含第一粗产物的流分进行第二硅胶柱层析分离，得到含第二粗产物的流分；所述第二硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇体系；

将所述含第二粗产物的流份依次进行ODS反相柱层析分离、第三硅胶柱层析分离和凝胶柱层析分离，得到2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述喙尾琵琶甲粉体的粒径为10～40目。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述醇溶液中的醇为碳原子数为1～3的醇中的一种或几种的混合物；

所述醇溶液和喙尾琵琶甲粉体的质量比为3～5:1。

5.根据权利要求2或4所述的提取方法，其特征在于，所述冷浸提取的次数为2～5次；

所述单次冷浸提取的时间独立地为12～48h。

6.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述石油醚萃取的相比为0.5～1.5:

1；

所述氯代甲烷萃取的相比为0.5～1.5:1；

所述乙酸乙酯萃取的相比为0.5～1.5:1。

7.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述第一硅胶柱层析分离的洗脱方式为梯度洗脱；所述各梯度洗脱剂中石油醚和丙酮或石油醚和氯仿的体积比依次为10:0、9:

1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10。

8.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述第二硅胶柱层析分离的洗脱方式为梯度洗脱；所述各梯度洗脱剂中氯仿和甲醇的体积比依次为100:1、50:1、25:1、12.5:1、

10:1、5:1、4:1、3:1。

9.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述ODS反相柱层析分离的洗脱方式为等度洗脱；所述ODS反相柱层析分离的洗脱剂为甲醇-水体系；

所述第三硅胶柱层析分离的洗脱方式为等度洗脱；所述第三硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇体系；

所述凝胶柱层析分离的洗脱方式为等度洗脱；所述凝胶柱层析分离的洗脱剂为甲醇。

10.权利要求1所述的2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶或权利要求2～9所述提取方法得到的2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶在制备清除氧自由基药物中的应用。

说明书

2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶及其提取方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及药用化合物的技术领域，特别涉及一种2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶及其提取方法和应用。

背景技术

[0002] 喙尾琵琶甲(Blaps rynchopeteraFairmaire)俗称臭壳子、小黑虫、臭屁虫、高脚虫、高脚臭虫、打屁虫，臭虫等，成虫能分泌具有药用价值的防御液(即臭屁)。喙尾琵琶甲是云南彝族长期广泛使用的昆虫药物(彝族药名音译为“寒斋”)，用于热证发烧、饮食积滞、小儿疳积、夜惊、乳癖、乳痰、疮痒肿毒、湿疹、皮肤瘙痒等。据调查，彝族民间医生在治疗肿瘤、心血管等疑难病症的处方中，80％以上都含有该昆虫药。因此，喙尾琵琶甲是一种极具开发和利用价值的民族民间药用昆虫。

[0003] 目前本领域对喙尾琵琶甲的药学和临床应用方面的研究报道非常少，尚未见关于喙尾琵琶甲提取物及其用途的报道。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明目的在于提供2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶及其提取方法和应用。本发明从喙尾琵琶甲中提取得到一种新化合物，2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶，该化合物具有优异的抗氧化性，具有广阔应用的前景。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种名称为2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶的化合物。

[0007] 本发明提供了上述方案所述2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶的提取方法，包括以下步骤：

[0008] 使用醇溶液对喙尾琵琶甲粉体进行冷浸提取，得到提取液；

[0009] 将所述提取液依次进行石油醚萃取、氯代甲烷萃取和乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；

[0010] 将所述乙酸乙酯萃取物进行第一硅胶柱层析分离，得到含第一粗产物的流分；所述第一硅胶柱层析分离的洗脱剂为石油醚-丙酮体系或石油醚-氯仿体系；

[0011] 将所述含第一粗产物的流分进行第二硅胶柱层析分离，得到含第二粗产物的流分；所述第二硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇体系；

[0012] 将所述含第二粗产物的流份依次进行ODS反相柱层析分离、第三硅胶柱层析分离和凝胶柱层析分离，得到2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶。

[0013] 优选的，所述喙尾琵琶甲粉体的粒径为10～40目。

[0014] 优选的，所述醇溶液中的醇为碳原子数为1～3的醇中的一种或几种的混合物；

[0015] 所述醇溶液的体积和喙尾琵琶甲粉体的质量比为3～5:1；

[0016] 优选的，所述冷浸提取的次数为2～5次；

[0017] 所述单次冷浸提取的时间独立地为12～48h。

[0018] 优选的，所述石油醚萃取的相比为0.5～1.5:1；

[0019] 所述氯代甲烷萃取的相比为0.5～1.5:1；

[0020] 所述乙酸乙酯萃取的相比为0.5～1.5:1。

[0021] 优选的，所述第一硅胶柱层析分离的洗脱方式为梯度洗脱；所述各梯度洗脱剂中石油醚和丙酮或石油醚和氯仿的体积比依次为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10。

[0022] 优选的，所述第二硅胶柱层析分离的洗脱方式为梯度洗脱；所述各梯度洗脱剂中氯仿和甲醇的体积比依次为100:1、50:1、25:1、12.5:1、10:1、5:1、4:1、3:1。

[0023] 优选的，所述ODS反相柱层析分离的洗脱方式为等度洗脱；所述ODS反相柱层析分离的洗脱剂为甲醇-水体系；

[0024] 所述第三硅胶柱层析分离的洗脱方式为等度洗脱；所述第三硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇体系；

[0025] 所述凝胶柱层析分离的洗脱方式为等度洗脱；所述凝胶柱层析分离的洗脱剂为甲醇。

[0026] 本发明提供了上述方案所述的2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶或上述方案所述提取方法得到的2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶在制备清除氧自由基药物中的应用。

[0027] 本发明提供了一种名称为2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶的化合物。本发明提供的2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶是一种新型的化合物，具有清除氧自由基的能力，因而具有优异的抗氧化活性，在开发成为抗氧化剂方面有广阔的应用前景。

[0028] 本发明提供的2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶的提取方法，首先使用醇溶液对喙尾琵琶甲粉体进行冷浸提取，得到提取液，再通过萃取、第一硅胶柱层析分离、第二硅胶柱层析分离、ODS反相柱层析分离、第三硅胶柱层析分离和凝胶柱层析分离得到2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶。本发明提供的提取方法步骤简单，成本低，且原料来源广泛，容易进行产业化生产。

附图说明

[0029] 图1为本发明实施例1所得产物的H1-H1COSY 和HMBC 相关图。

具体实施方式

[0030] 本发明提供了一种名称为2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶的化合物；具有式I所示结构：

[0031]

[0032] 本发明提供的2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶是一种新型的化合物，具有清除氧自由基的能力，在抗氧化过程中可以释放出氢原子与过氧化物或活泼氧自由基结合，从而中断连锁反应，阻止氧化过程继续进行；本发明提供的2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶具有优异的消除氧自由基的活性，可以保护细胞组织免受氧化作用的损害；本发明提供的2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶在治疗与人体自由基破坏细胞功能有关的疾病方面有广阔的应用前景。

[0033] 本发明还提供了所述2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶的提取方法，包括以下步骤：

[0034] 使用醇溶液对喙尾琵琶甲粉体进行冷浸提取，得到提取液；

[0035] 将所述提取液依次进行石油醚萃取、氯代甲烷萃取和乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；

[0036] 将所述乙酸乙酯萃取物进行第一硅胶柱层析分离，得到含第一粗产物的流分；所述第一硅胶柱层析分离的洗脱剂为石油醚-丙酮体系或石油醚-氯仿体系；

[0037] 将所述含第一粗产物的流分进行第二硅胶柱层析分离，得到含第二粗产物的流分；所述第二硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇体系；

[0038] 将所述含第二粗产物的流份依次进行ODS反相柱层析分离、第三硅胶柱层析分离和凝胶柱层析分离，得到2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶。

[0039] 本发明使用醇溶液对喙尾琵琶甲粉体进行冷浸提取，得到提取液。在本发明中，所述喙尾琵琶甲粉体的粒径优选为10～40目，更优选为20目；本发明对喙尾琵琶甲粉体的制备方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的制备方法即可；在本发明的具体实施例中，可以直接将喙尾琵琶甲药材粉碎，得到喙尾琵琶甲粉体；如果是以鲜活喙尾琵琶甲为原始原料，也可以将鲜活喙尾琵琶甲用开水烫死后依次进行风干和粉碎，得到喙尾琵琶甲粉体；本发明对所述粉碎没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的粉碎方法，能够粉碎至所需粒径即可，具体的如机械粉碎。

[0040] 在本发明中，所述醇溶液中的醇优选为碳原子数为1～3的醇中的一种或几种的混合物，更优选为甲醇和/或乙醇，最优选为乙醇；所述醇溶液的质量浓度优选为90～95％，更优选为95％；所述醇溶液和喙尾琵琶甲粉体的质量比优选为3～5:1，更优选为4:1。

[0041] 在本发明中，所述冷浸提取的次数优选为2～5次，更优选为3次；所述单次冷浸提取的时间独立地优选为12～48h，更优选为24～48h；在本发明的具体实施例中，当冷浸提取次数为3次时，第一次冷浸提取的时间优选为40～50h，更优选为48h；第二次冷浸提取的时间优选为15～30h，更优选为24h；第三次冷浸提取的时间优选为15～30h，更优选为24h；本发明优选将喙尾琵琶甲粉体浸泡在醇溶液中进行冷浸提取。

[0042] 在本发明的具体实施例中，当冷浸提取次数≥2次时，第一次冷浸提取完成后，本发明优选将提取体系过滤，将过滤所得滤渣再次浸泡在醇溶液中进行第二次提取，依次类推，最终将过滤所得滤液合并。在本发明中，所述每次冷浸提取醇溶液的用量均以初始喙尾琵琶甲粉体的质量为基准进行计算。

[0043] 冷浸提取完成后，本发明优选将所得滤液进行浓缩，得到提取液。本发明优选通过减压蒸馏将所述滤液浓缩，所述减压蒸馏的温度优选≤60℃，更优选为40～50℃；本发明对所述减压蒸馏的时间没有特殊要求，在本发明的具体实施例中，优选将滤液蒸馏至无醇味为止；本发明对所述减压蒸馏的压力没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的减压蒸馏压力，能够将醇蒸馏出来即可；本发明优选使用旋转蒸发器进行减压蒸馏；本发明通过减压蒸馏将滤液中的醇回收，并将滤液进行浓缩，以便于后续的分离。

[0044] 得到提取液后，本发明将所述提取液依次进行石油醚萃取、氯代甲烷萃取和乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物。在本发明中，所述石油醚萃取的相比优选为0.5～1.5:1，更优选为1:1；所述石油醚萃取的次数优选为2～4次，更优选为3次；所述单次萃取的时间优选≥1h，更优选为1～2h，最优选为1.5h。本发明通过石油醚萃取去除提取液中的低极性脂溶性杂质。

[0045] 石油醚萃取完成后，本发明优选将石油醚萃取后的萃余液进行氯代甲烷萃取。在本发明中，所述氯代甲烷优选为氯仿或二氯甲烷；所述氯代甲烷萃取的相比优选为0.5～1.5:1，更优选为1:1；所述氯代甲烷萃取的次数优选为2～4次，更优选为3次；所述单次萃取的时间优选≥1h，更优选为1～2h，最优选为1.5h。本发明通过氯代甲烷萃取将提取液中甾醇、长链脂肪酸和一元酚酸等弱极性的物质去除。

[0046] 氯代甲烷萃取完成后，本发明优选将氯代甲烷萃取后的萃余液进行乙酸乙酯萃取。在本发明中，所述乙酸乙酯萃取的相比优选为0.5～1.5:1，更优选为1:1；所述乙酸乙酯萃取的次数优选为2～4次，更优选为3次；所述单次萃取的时间优选≥1h，更优选为1～2h，最优选为1.5h。本发明通过乙酸乙酯萃取将提取液中极性中等的化合物萃取到乙酸乙酯相中，本发明所要提取的目标化合物即存在于乙酸乙酯萃取相中，高极性化合物和水溶性化合物剩余在乙酸乙酯萃余液中。

[0047] 乙酸乙酯萃取完成后，本发明将得到的乙酸乙酯萃取相浓缩，得到乙酸乙酯萃取物。本发明优选通过减压蒸馏将所述滤液浓缩，所述减压蒸馏的温度优选≤60℃，更优选为40～50℃；本发明对所述减压蒸馏的时间没有特殊要求，在本发明的具体实施例中，优选将乙酸乙酯萃取相蒸馏至干；本发明对所述减压蒸馏的压力没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的减压蒸馏压力，能够将乙酸乙酯蒸馏出来即可；本发明优选使用旋转蒸发器进行减压蒸馏；本发明通过减压蒸馏将乙酸乙酯萃取相中的乙酸乙酯溶剂回收，并将乙酸乙酯萃取相进行浓缩，以便于后续的分离。

[0048] 得到乙酸乙酯萃取物后，本发明将所述乙酸乙酯萃取物进行第一硅胶柱层析分离，得到含第一粗产物的流分。在本发明中，所述第一硅胶柱层析分离用硅胶的粒径优选为80～100目或100～150目，更优选为80～100目；所述第一硅胶柱层析分离的温度优选为室温，无需进行额外的加热或降温；所述第一硅胶柱层析分离的压力优选为常压。

[0049] 在本发明中，所述第一硅胶柱层析分离的洗脱剂为石油醚-丙酮体系或石油醚-氯仿体系；所述第一硅胶柱层析分离的洗脱方式优选为梯度洗脱；所述梯度洗脱优选为11个梯度；所述各梯度洗脱剂中石油醚和丙酮(或石油醚和氯仿)的体积比优选依次为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10；所述洗脱剂的流速优选为10～30ml/min，更优选为15～20ml/min；本发明在梯度洗脱过程中将流份收集，按照上述洗脱剂比例依次得到11种流份(按照极性从小到大分别记为FrA、FrB、FrC、FrD、FrE、FrF、FrG、FrH、FrI、FrJ、FrK)。本发明通过梯度洗脱将乙酸乙酯萃取物中不同极性的化合物逐步洗脱出来，其中FrC流份即为本发明所述的含有第一粗产物的流份(在本发明的具体实施例中，可以对所得各个流份进行薄层色谱TLC或高效液相色谱HPLC检测，以确定含有目标化合物的流份)；在本发明的具体实施例中，为简化试验步骤，可仅进行前3个梯度的洗脱，得到FrC流份即可，后续的洗脱过程可省略。本发明通过第一硅胶柱层析对乙酸乙酯萃取物中的化合物进行初步分离。

[0050] 得到含有第一粗产物的流份后，本发明将所述含第一粗产物的流分进行第二硅胶柱层析分离，得到含第二粗产物的流分。在本发明中，所述第二硅胶柱层析分离用硅胶的粒径优选为200～300目或300～400目，更优选为300～400目；所述第二硅胶柱层析分离的温度优选为室温，无需进行额外的加热或降温；本发明对所述第二硅胶柱层析分离的洗脱压力没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的洗脱压力即可，在本发明的具体实施例中，优选使用小型空气加压泵于柱顶加压洗脱，以加快洗脱速度。

[0051] 在本发明中，所述第二硅胶柱层析分离的洗脱剂为氯仿-甲醇体系；所述第二硅胶柱层析分离的洗脱方式优选为梯度洗脱；所述梯度洗脱优选按照氯仿和甲醇的体积比为100:1→3:1比例进行洗脱；在本发明的具体实施例中，所述梯度洗脱优选为6～10个梯度；
所述各梯度洗脱剂中氯仿和甲醇的体积比优选依次为100:1、50:1、25:1、12.5:1、10:1、5:
1、4:1、3:1。在本发明中，所述洗脱剂的流速优选为5～20ml/min，更优选为10～15ml/min；
本发明对所述第二硅胶柱层析分离的洗脱压力没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的洗脱压力，能够达到要求的流速即可；在本发明的具体实施例中优选使用小型空气加压泵于柱顶加压洗脱，以使洗脱速度达到要求。

[0052] 本发明在第二硅胶柱层析分离梯度洗脱过程中将流份收集，并将相同的流份合并(在本发明的实施例中，可使用硅胶薄层板进行点板分析，然后将相同流分进行合并，也可以采用HPLC检测合并)，共得到7种流份(按照极性从小到大依次记为FrC1、FrC2、FrC3、FrC4、FrC5、FrC6、FrC7)。本发明通过梯度洗脱进一步将第一粗产物中不同极性的化合物逐步洗脱出来，其中FrC5流份即为本发明所述的含有第二粗产物的流份(在本发明的具体实施例中，可以对所得各个流份进行TLC或HPLC检测，以确定含有目标化合物的流份)。本发明通过第二硅胶柱层析将第一粗产物中的化合物进一步分离。

[0053] 得到含有第二粗产物的流份后，本发明将所述含第二粗产物的流份进行ODS反相柱层析分离，得到含第三粗产物流份。在本发明中，所述ODS(十八烷基硅烷)反相柱层析分离的洗脱方式为等度洗脱；所述ODS反相柱层析分离的洗脱剂为甲醇/水体系；所述洗脱剂中甲醇和水的体积比优选为15～25:75～85，更优选为20:80；所述洗脱剂的流速优选为0.5～2ml/min，更优选为1～1.5ml/min；所述ODS柱层析分离的温度优选为室温，无需进行额外的加热或降温；本发明对所述ODS柱层析分离的洗脱压力优选使用小型空气加压泵于柱顶加压洗脱，以使洗脱速度达到要求；在本发明的具体实施例中，优选对洗脱液进行TLC检测，将组分相同流份合并，获得4种流份，按洗脱顺序依次记为FrC5-1，FrC5-2，FrC5-3，FrC5-4，其中FrC5-2流份即为本发明所述的含有第三粗产物的流份(在本发明的具体实施例中，可以对所得各个流份进行TLC、HPLC检测，以确定含有目标化合物的流份)。本发明通过ODS柱层析将第二粗产物中的化合物进一步分离。

[0054] 得到含第三粗产物的流份后，本发明将所述含第三粗产物的流份依次进行第三硅胶柱层析分离和凝胶柱层析分离，得到2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶。

[0055] 在本发明中，所述第三硅胶柱层析分离的洗脱方式优选为等度洗脱；所述第三硅胶柱层析分离的洗脱剂优选为氯仿-甲醇体系；所述洗脱剂中氯仿和甲醇的体积比优选为6～10:1，更优选为8:1；所述洗脱剂的流速优选为1～3ml/min，更优选为1.5～2.5ml/min。在本发明中，所述第三硅胶柱层析分离使用的硅胶的粒径优选为200～300目或300～400目，更优选为300～400目；所述第三硅胶柱层析分离的温度优选为室温，无需进行额外的加热或降温；本发明对所述第三硅胶柱层析分离的洗脱压力没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的洗脱压力，能够达到要求的流速即可；在本发明的具体实施例中，优选使用小型空气加压泵于柱顶加压洗脱，以使洗脱速度达到要求；在本发明的具体实施例中，可以对洗脱液进行TLC、HPLC检测，以跟踪目标化合物。本发明通过第三硅胶柱层析将ODS反相柱层析洗脱液进一步纯化。

[0056] 第三硅胶柱层析分离完成后，本发明将得到的第三硅胶柱层析洗脱液进行凝胶柱层析分离，得到2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶。在本发明中，所述凝胶柱层析分离的层析介质优选为葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶，更优选为葡萄糖凝胶，在本发明的具体实施例中，优选使用Sephadex LH-20(羟丙基葡萄糖凝胶)作为层析介质；所述凝胶柱层析分离的洗脱方式优选为等度洗脱；所述凝胶柱层析分离的洗脱剂优选为甲醇；所述洗脱剂的流速优选为0.5～2ml/min，更优选为1～1.5ml/min。本发明对所述凝胶柱层析分离的具体操作方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的凝胶柱层析分离方法即可；优选采用恒流泵于柱顶添加洗脱剂；在本发明的具体实施例中，可以对洗脱液进行TLC、HPLC检测，以跟踪目标化合物。本发明通过凝胶柱层析分离将第三硅胶柱层析洗脱液中极性相近而分子量不同的杂质去除，得到含有2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶的洗脱液。

[0057] 凝胶柱层析分离后，本发明优选将得到的含有2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶的洗脱液中的洗脱剂去除，得到2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶。本发明优选通过旋转蒸发将洗脱剂去除，本发明对所述旋转蒸发的具体条件没有特殊要求，能够将洗脱剂去除完全即可；本发明对旋转蒸发的时间没有特殊要求，旋蒸至干即可。在本发明的具体实施例中，旋蒸至干后，得到白色固体，即为2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶；命名为喙尾琵琶甲素C。

[0058] 本发明还提供了上述方案所述的2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶或上述方案所述提取方法得到的2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶在制备清除氧自由基药物中的应用。本发明提供的2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶具有清除氧自由基的能力，在抗氧化过程中可以释放出氢原子与过氧化物结合，从而中断连锁反应，阻止氧化过程继续进行；在治疗与人体自由基破坏细胞功能有关的疾病方面有广阔的应用前景。

[0059] 本发明对所述2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶在制备清除氧自由基药物中的具体应用方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的方法进行应用即可。在本发明的具体实施例中，可以将2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶和微晶纤维素混合，采用乙醇湿法治粒的方法制备具有清除氧自由基作用的胶囊；所述胶囊中2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶的含量优选为10～30g/100g。

[0060] 下面结合实施例对本发明提供的2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶及其提取方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0061] 实施例1

[0062] 取喙尾琵琶甲干粉5Kg，采用95％乙醇冷浸提取三次(乙醇和喙尾琵琶甲干粉的质量比为3:1，第一次提取时间为48h，第二次提取时间为12h，第三次提取时间为12h)，将三次提取的滤液合并，将滤液减压蒸馏至无醇味，得到冷浸提取液；将冷浸提取液依次用石油醚(相比为1:1，萃取3次)、氯仿(相比为1:1，萃取3次)、乙酸乙酯(相比为1:1，萃取3次)萃取，将乙酸乙酯萃取相合并，然后进行减压蒸馏，将乙酸乙酯回收，得到乙酸乙酯萃取物；乙酸乙酯萃取物(200g)经硅胶柱层析分离，以石油醚:丙酮(V:V＝10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10)梯度洗脱得到FrA～FrK流分，将FrC流份经硅胶柱层析分离，以氯仿：甲醇(V:V＝100:1→3:1)进行梯度洗脱，得到FrC1～FrC7流份；对FrC5流份进行十八烷基硅烷(ODS)反相柱层析(甲醇和水体积比为20:80进行洗脱)，得到FrC5-1～FrC5-4流份；
将FrC5-2流份依次进行硅胶柱层析(氯仿和甲醇的体积比为5:1进行洗脱)、葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析(甲醇洗脱)，将洗脱液旋蒸至干，除去洗脱剂，得到固体产物(白色固体)8mg。

[0063] 对所得白色固体产物进行结构鉴定：

[0064] 使用红外图谱对所得产物进行分析，得到如下数据：IR(KBr,cm-1)νmax:3342,2959,1740,1603,1519,1430,1290,1195,1110,944,805。

[0065] 使用HR-ESI-MS对所得产物进行测试，结果显示M/e:202.0859(计：202.0868，M+H,)，推算分子式为C12H11NO2。

[0066] 所得产物的核磁共振碳谱和核磁共振氢谱数据见表1，碳谱数据显示1个伯碳，6个叔碳，5个季碳共12个信号

[0067] 氢谱低场信号显示有两组3取代芳香环，耦合常数提示均为1,3,4取代。根据13C化学位移值及HMBC相关信号提示存在3,4-二羟基苯基片段。但另一个芳环3组1H信号明显偏低场，提示可能与强吸电子性基团相连或为缺π芳环；而高场提示有1个甲基信号，HMBC提示直接与该芳环相连，结合分子式，推测另一个芳香环可能为吡啶环，且直接和苯环相连。

[0068] 通过HMQC各HMBC对核磁共振碳谱和核磁共振氢谱信号进行归属，所得结果如表1所示；

[0069] 所得产物的H-H COSY和HMBC相关图如图1所示，通过解析HMBC相关信号，可知δ2.49的甲基仅主要与155.98(C2)和123.24(C3)相关，提示甲基处于吡啶环的2位；δ129.30(C1′)与同环的H-4(δ6.90)及吡啶环中H-4(δ7.80)和H-6(δ8.64)相关，而δ133.62(C5)同时与苯环中的H-2′(δ7.11)，H-6′(δ6.97)及吡啶环中的H-3(δ7.24)相关，推测产物结构为2-甲基吡啶的5号位与1,2-二苯酚的4号位相连。

[0070] 根据以上分析，可以确定所得产物结构为2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶。

[0071] 表1实施例1所得产物的核磁共振碳谱和核磁共振氢谱数据

[0072]

[0073] 注：核磁共振波谱数据在BrukerAV-400型核磁共振波谱仪测定(δ单位为ppm，J为耦合常数，用括号中的数字表示，单位为Hz)；测试所用氘代溶剂为氘代甲醇CD3OD；表1中的原子编号对应图1中的原子编号；d为双重峰，dd为双双重峰。

[0074] 实施例2

[0075] 取喙尾琵琶甲干粉5Kg，采用95％乙醇冷浸提取三次(乙醇和喙尾琵琶甲干粉的质量比为3:1，第一次提取时间为48h，第二次提取时间为12h，第三次提取时间为12h)，将三次提取的滤液合并，将滤液减压蒸馏至无醇味，得到冷浸提取液；将冷浸提取液依次用石油醚(相比为1.1:1，萃取3次)、二氯甲烷(相比为1.1:1，萃取3次)、乙酸乙酯(相比为1:1，萃取3次)萃取，将乙酸乙酯萃取相合并，然后进行减压蒸馏，将乙酸乙酯回收，得到乙酸乙酯萃取物；乙酸乙酯萃取物(200g)经硅胶柱层析分离，以石油醚:氯仿(V:V＝10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10)梯度洗脱得到FrA～FrK流分，将FrC流份经硅胶柱层析分离，以氯仿：甲醇(V:V＝100:1→3:1)进行梯度洗脱，得到FrC1～FrC7流份；对FrC5流份进行十八烷基硅烷(ODS)反相柱层析(甲醇和水体积比为20:80进行洗脱)得到FrC5-1～FrC5-4流份；将FrC5-2流份依次进行硅胶柱层析(氯仿和甲醇的体积比为5:1进行洗脱)、葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析(甲醇洗脱)，将洗脱液旋蒸至干，除去洗脱剂，得到固体产物(白色固体)8mg。

[0076] 利用实施例1中的方法对所得产物进行结构鉴定，鉴定结果和实施例1一致，所得白色固体即为2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶。

[0077] 实施例3

[0078] 1,1-二苯基-二苦基肼(DPPH)是一种比较稳定的脂性自由基，其N上有一个游离电子，其乙醇溶液呈紫色，经全波长扫描可知其在517nm处有最大吸收峰。加入抗氧化剂以后，DPPH捕捉一个电子与游离电子配对，紫色褪去，变为无色物质，在517nm处吸收峰消失，褪色程度与其接受的电子数成定量关系。即DPPH被氧化还原时吸收值下降，吸光度越低，其抗氧化作用越强。据此原理测定样品提供氢原子、清除自由基、抗氧化的能力。

[0079] 对实施例1所得2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶进行抗氧化活性测试，测试步骤如下：

[0080] (1)DPPH溶液的配制：精密称取0.0050克的DPPH，用无水乙醇溶解，并定量转入25毫升(mL)棕色容量瓶中，用无水乙醇定容、摇匀，得质量浓度为200毫克/升(mg/L)的DPPH溶液。

[0081] (2)清除DPPH·能力的测定：使用无水乙醇将实施例1所得2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶配制成不同浓度的溶液，作为待测样品溶液；待测样品溶液的浓度梯度为：256μg/mL，128μg/mL，64μg/mL，32μg/mL，16μg/mL，8μg/mL，4μg/mL；

[0082] 以维生素C(Vit C)溶液为阳性对照，按照相同的方法检测维生素C的清除自由基活性，维生素C检测浓度梯度为：128，64，32，16，8，4，2μg/mL。

[0083] 取不同浓度的待测样品溶液、不同浓度的Vit C溶液、无水乙醇置于96孔板中，平行三个复孔，每孔50微升(μL)，并加入DPPH溶液50μL，混匀；另于三个复孔中各加入100μL无水乙醇作为空白对照，室温下暗室放置30分钟，用酶标仪于517nm波长处测定样品、阳性对照吸光度(Ai)、空白对照吸光度(A0)、DPPH溶液吸光度(Aj)。

[0084] (3)自由基清除率(K)计算公式：K＝[1－(Ai－A0)/(Aj－A0]×100％。

[0085] (4)实验结果：清除50％自由基时的待测化合物浓度为IC50值，以待测化合物浓度(μg/mL)为横坐标，DPPH自由基清除率K(％)为纵坐标，绘制样品的清除率曲线，根据曲线计算线性回归方程，并根据回归方程计算IC50值，所得IC50值为三次结果的平均值，所得结果如表2所示：

[0086] 表2实施例1所得产物清除DPPH自由基活性数据

[0087]

[0088] 根据表2中的结果可以看出，本发明提供的2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶具有对DPPH自由基的清除活性，其对DPPH自由基清除能力与维生素C相当。说明2-甲基-5-(3,4-二羟基苯基)吡啶具有良好的清除氧自由基的能力，在治疗与人体自由基破坏细胞功能有关的疾病方面有广阔的应用前景。

[0089] 由以上实施例可知，本发明以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。