四氢苯并噻吩衍生物及其在制备糖原合酶激酶3β抑制剂中的用途

摘要

本发明公开了四氢苯并噻吩衍生物及其在制备糖原合酶激酶3β抑制剂中的用途。本发明的一种四氢苯并噻吩衍生物、其药学上可接受的盐、光学活性体或消旋体，具有通式Ⅰ所示的化学结构。实验证明，本发明所制得的化合物具有良好的GSK‑3β抑制活性。此外，本发明还提出了一种制备该四氢苯并噻吩类化合物的方法，该方法合成路线短，制备过程简单、易操作，能够满足大规模工业生产的需要。

权利要求

1.一种四氢苯并噻吩衍生物、其药学上可接受的盐、光学活性体或消旋体，其特征在于，选自以下化合物所组成群组：

2.一种制备权利要求1所述的四氢苯并噻吩衍生物、其药学上可接受的盐、光学活性体或消旋体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)环己酮与化合物2在乙醇溶液中反应得到化合物3，向反应后的溶液中加入硫粉，并滴加二乙胺，保持反应温度不超过50℃，反应3h后改为冰盐浴，使反应液产生结晶，或将反应液倒入水中，抽滤，析出固体用乙醇重结晶得化合物4；

(2)化合物4溶于干燥的CH2Cl2中，加入X＝C＝Y-R2加热回流；反应液冷却后加入50v/v％的乙醇水溶液，抽滤，析出固体用乙醇重结晶，得化合物5；

其中R1为氨基甲酰基，R2为环戊基、环己基、苯基、苄基、乙酰基或苯甲酰基；X为O或S；Y为亚氨基。

3.一种制备权利要求1所述的四氢苯并噻吩衍生物、其药学上可接受的盐、光学活性体或消旋体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)环己酮以及2-腈基乙酸乙酯在乙醇溶液中反应得到化合物3’，向反应后的溶液中加入硫粉，滴加二乙胺，并保持反应温度不超过50℃，反应3h后改为冰盐浴，使反应液产生结晶，或将反应液倒入水中，抽滤得固体产物化合物4’，所得化合物4’溶解在30mL丙酮溶液中，加入NaOH水溶液，于40℃下加热反应2h，反应结束后用稀盐酸调节pH＝1，二氯甲烷萃取后蒸干得到化合物5’；

(2)化合物5’溶于干燥的CH2Cl2中，加入X＝C＝Y-R2加热回流；反应液冷却后加入50v/v％的乙醇水溶液，抽滤，析出固体用乙醇重结晶，得化合物5；

其中，R1为羧基，R2为环己基，X为O或S；Y为亚氨基，R1’为乙氧基甲酰基。

4.权利要求1所述的四氢苯并噻吩衍生物、其药学上可接受的盐、光学活性体或消旋体在制备预防或治疗GSK-3β相关疾病药物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的GSK-3β相关疾病选自糖尿病、阿尔茨海默氏病、胃癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌以及混合性白血病。

6.一种药物组合物，其特征在于，含有药物有效计量的如权利要求1所述的四氢苯并噻吩衍生物、其药学上可接受的盐、光学活性体、消旋体或其混合物及药用载体。

7.权利要求6所述的药物组合物在制备预防或治疗GSK-3β相关疾病药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的GSK-3β相关疾病选自糖尿病、阿尔茨海默氏病、胃癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌以及混合性白血病。

说明书

四氢苯并噻吩衍生物及其在制备糖原合酶激酶3β抑制剂中的

用途

技术领域

[0001] 本发明涉及新颖的四氢苯并噻吩类衍生物，其制备方法以及它们在预防或治疗与GSK-3β相关疾病方面的应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

[0002] 阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)是一种以进行性认知功能减退及行动和社会适应能力下降为基本特征的神经退行性疾病。随着全球人口老龄化的快速发展，AD已成为威胁老年人生命健康的重大疾病，其危害仅次于心血管疾病、癌症和脑卒中，给社会和家庭带来了沉重的负担。据统计，截至2015年，全球已有4600万人患有AD，预计到2050年，AD患病人数将达到1.31亿。目前在中国有950万AD患者，为全球患AD人数最多的国家。

[0003] 阿尔茨海默病的发病机制十分复杂，随着AD临床研究及诊断标准的不断完善，国际上针对AD治疗的研究也越来越多。但迄今为止，临床上针对AD仍缺乏有效的药物和治疗手段。大量研究表明，AD的各种发病机制并非单独起作用，其主要病理特征，胆碱能系统损伤、Aβ淀粉样蛋白沉积和Tau蛋白异常磷酸化之间存在密切的关联性，形成了一个复杂的发病机制网络。

[0004] 阿尔茨海默病患者的脑组织病理检查发现，其特征性的病理改变主要是出现于大脑皮质和海马区等处的细胞内神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)，同时还伴有神经元和突触退化等其他非特异性病理变化。而NFTs的形成是由微管相关的Tau蛋白的异常修饰导致的结果。正常情况下，每分子Tau蛋白含有2-3个磷酸基，而患有AD时，Tau蛋白的磷酸基可增加至8-9个，这说明患病过程中部分Tau蛋白磷酸化激酶被激活。

[0005] GSK-3β(Glycogen Synthase Kinase 3beta)是目前研究较多的Tau蛋白磷酸化激酶，也是磷酸化Tau蛋白最有效率的蛋白激酶之一。在AD患者的大脑中发现这两种激酶的活性形式与NFTs共存，并且与Tau蛋白共沉淀。所以，GSK-3β被认为是潜在的治疗AD的药物靶点。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一类结构新颖的可作为GSK-3β抑制剂的四氢苯并噻吩衍生物。

[0007] 本发明的另一目的是提供该四氢苯并噻吩类化合物的制备方法。

[0008] 本发明的另一个目的是提供包含上述化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。

[0009] 本发明又一目的是提供上述化合物以及包含该化合物的组合物用于制备预防或治疗GSK-3β相关疾病的药物。

[0010] 为了达到上述目的，本发明采用了如下技术方案：

[0011] 本发明的一种四氢苯并噻吩衍生物、其药学上可接受的盐、光学活性体或消旋体，具有通式Ⅰ所示的化学结构：

[0012]

[0013] 其中，R1为下列基团中的任意一个基团：(1)H原子；(2)C1-6烷基、C3-8环烷基、C2-6链烯基、C2-6链炔基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷氧基、C2-6链烯氧基、C2-6链炔氧基，上述各基团任意被选自H原子、卤原子、羟基、氰基、硝基和氨基中的一种或多种取代基所取代；(3)取代的羰基，其任意被选自H原子、羟基、C1-6烷基、氨基、C1-6烷氨基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基和C3-8环烷基中的一种或多种取代基所取代；(4)取代的氨基，其任意被选自H原子、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6链炔基、C1-6烷基磺酰基、C2-6链烯基磺酰基、C2-6链炔基磺酰基、C1-6烷基羰基、C2-6链烯基羰基和C2-6链炔基羰基中的一种或多种取代基所取代；(5)取代的苯基、取代的苄基、取代的苯甲酰基、取代的苯磺酰基、取代的吡啶环、取代的吡唑环、取代的吡咯环、取代的嘧啶环、取代的喹啉环、取代的异喹啉环、取代咪唑环、取代的吗啉环、取代的哌嗪环、取代的哒嗪环、取代的吡嗪环、取代的哌啶环、取代的噻吩环、取代的吡喃环、取代的吲哚环、取代的呋喃环，上述各基团任意被选自H原子、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基氨基、C3-7环烷基、C1-6烷氧基、苄氧羰基、三卤甲基、羟甲基、羟基、氰基、硝基和氨基中的一种或多种取代基所取代；

[0014] R2为下列基团中的任意一个基团：(1)H原子；(2)C1-6烷基、C3-8环烷基、C2-6链烯基、C2-6链炔基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷氧基、C2-6链烯氧基、C2-6链炔氧基，上述各基团任意被选自H原子、卤原子、羟基、氰基、硝基和氨基中的一种或多种取代基所取代；(3)取代的羰基，其任意被选自H原子、羟基、C1-6烷基、氨基、C1-6烷氨基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基和C3-8环烷基中的一种或多种取代基所取代；(4)取代的氨基，其任意被选自H原子、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6链炔基、C1-6烷基磺酰基、C2-6链烯基磺酰基、C2-6链炔基磺酰基、C1-6烷基羰基、C2-6链烯基羰基和C2-6链炔基羰基中的一种或多种取代基所取代；(5)取代的苯基、取代的苄基、取代的苯甲酰基、取代的苯磺酰基、取代的吡啶环、取代的吡唑环、取代的吡咯环、取代的嘧啶环、取代的喹啉环、取代的异喹啉环、取代咪唑环、取代的吗啉环、取代的哌嗪环、取代的哒嗪环、取代的吡嗪环、取代的哌啶环、取代的噻吩环、取代的吡喃环、取代的吲哚环、取代的呋喃环，上述各基团任意被选自H原子、卤素、C1-6烷基、C1-6烷基氨基、C3-7环烷基、C1-6烷氧基、苄氧羰基、三卤甲基、羟甲基、羟基、氰基、硝基和氨基中的一种或多种取代基所取代；

[0015] X为C、O、S或N原子；

[0016] Y为亚甲基、O、S或亚氨基。

[0017] 本发明涉及的任何一个衍生物可具有不对称中心，因此以不同的对映和非对映体的形式存在。本发明涉及本发明衍生物的所有旋光异构体、消旋体及其混合物。“消旋体”是指含有等量的一对对映异构体的混合物。

[0018] 在本发明中，优选的，通式Ⅰ中，R1为氨基甲酰基或羧基，R2为环戊基、环己基、异丙基、苯基、苄基、乙酰基或苯甲酰基；X为O或S；Y为亚氨基。

[0019] 在本发明中，优选的，所述的四氢苯并噻吩衍生物、其药学上可接受的盐、光学活性体或消旋体，选自以下化合物所组成群组：

[0020]

[0021] 进一步的，本发明还提出了一种制备所述四氢苯并噻吩衍生物、其药学上可接受的盐、光学活性体或消旋体的方法，当R1、R2、X和Y的定义同上，但R1不为羧基时，包括以下步骤：

[0022] (1)环己酮与化合物2在乙醇溶液中反应得到化合物3，向反应后的溶液中加入硫粉，并滴加二乙胺，保持反应温度不超过50℃，反应3h后改为冰盐浴，使反应液产生结晶，或将反应液倒入水中，抽滤，析出固体用乙醇重结晶得化合物4；

[0023] (2)化合物4溶于干燥的CH2Cl2中，加入X＝C＝Y-R2加热回流；反应液冷却后加入50v/v％的乙醇水溶液，抽滤，析出固体用乙醇重结晶，得化合物5；

[0024]

[0025] 当R2、X和Y的定义同上，R1为羧基时，包括以下步骤：

[0026] (1)环己酮以及2-腈基乙酸乙酯在乙醇溶液中反应得到化合物3’，向反应后的溶液中加入硫粉，滴加二乙胺，并保持反应温度不超过50℃，反应3h后改为冰盐浴，使反应液产生结晶，或将反应液倒入水中，抽滤得固体产物化合物4’，所得化合物4’溶解在30mL丙酮溶液中，加入NaOH水溶液，于40℃下加热反应2h，反应结束后用稀盐酸调节pH＝1，二氯甲烷萃取后蒸干得到化合物5’；

[0027] (2)化合物5’溶于干燥的CH2Cl2中，加入X＝C＝Y-R2加热回流；反应液冷却后加入50v/v％的乙醇水溶液，抽滤，析出固体用乙醇重结晶，得化合物5；

[0028]

[0029] 其中，R1’为乙氧基甲酰基。

[0030] 更进一步的，本发明还提出了所述的四氢苯并噻吩衍生物、其药学上可接受的盐、光学活性体或消旋体在制备预防或治疗GSK-3β相关疾病药物中的应用。

[0031] 再进一步的，本发明还提出了一种药物组合物，含有药物有效计量的本发明所述的任一项所述的四氢苯并噻吩衍生物、其药学上可接受的盐、光学活性体、消旋体或其混合物及药用载体。以及所述的药物组合物在制备预防或治疗GSK-3β相关疾病药物中的应用。

[0032] 所述GSK-3β相关疾病可以是糖尿病、阿尔茨海默氏病、胃癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌、混合性白血病，但不局限于此。

[0033] 相较于现有技术，本发明的有益效果是：

[0034] 本发明提供了一类结构新颖的可作为GSK-3β抑制剂的四氢苯并噻吩衍生物。经试验证明，本发明提供的化合物均表现出较高活性，噻吩环是一个活性结构骨架，所制得的化合物具有良好的GSK-3β抑制活性，并在抗阿尔茨海默病方面表现出较好的活性。本发明的提出为抗阿尔茨海默病的研究提供了一个新的技术手段。此外，本发明还提出了一种制备该四氢苯并噻吩类化合物的方法，该方法合成路线短，制备过程简单、易操作，能够满足大规模工业生产的需要。

附图说明

[0035] 图1是化合物GX001-010以及阳性对照药Staurosporine对GSK-3β的IC50值；其中，图1A为化合物GX001-006对GSK-3β的IC50值；图1B为化合物GX007-010以及阳性对照药Staurosporine对GSK-3β的IC50值。

具体实施方式

[0036] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0037] 以下实施例1-实施例12为表1所示化合物及中间体的合成方法，R1为氨基甲酰基时合成路线如下所示：

[0038]

[0039] R1为羧基时合成路线如下所示：

[0040]

[0041] 表1

[0042]

[0043]

[0044] 实施例1中间体A(2-氨基-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成[0045] 环己酮(0.1mol)以及2-腈基乙酰胺(0.1mol)在乙醇溶液(30mL)中反应得到化合物3，向反应后的溶液中加入硫粉(0.1–0.11mol)，滴加二乙胺(10mL)，并保持反应温度不超过50℃。反应3h后改为冰盐浴，使反应液产生结晶，如没有结晶将反应液倒入100mL水中，抽滤，析出固体用乙醇重结晶得目标化合物，即化合物4。收率61％。

[0046] Mp 190℃；1H-NMR(DMSO-d6):d(ppm)1.68(m,4H),2.51(m,4H),6.52(bs,2H),6.89(s,2H)；LRMS-EI:m/z calcd 196.1,found 196.0。

[0047] 实施例2：GX001(2-(3-环己基脲)-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成[0048] 溶解化合物4(0.80mmol)在干燥的CH2Cl2(5mL)中，加入环己基异氰酸酯(12.8mmol)加热回流5d。反应液冷却后加入50％的乙醇水溶液(5mL)，抽滤，得析出固体用乙醇重结晶，得目标产物，收率79％。

[0049] Mp 190.5-192.5℃；1H-NMR(DMSO-d6):d(ppm)1.21(m,4H),1.49(m,6H),1.70(m,4H),2.52(m,4H),3.54(m,1H),6.97(bs,2H),7.53(s,1H),10.48(s,1H)；ESI-MS m/z:322.1+
[M+H]。

[0050] 实施例3：GX002(2-(3-环戊基脲)-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成[0051] 溶解化合物4(0.80mmol)在干燥的CH2Cl2(5mL)中，加入环戊基异氰酸酯(12.8mmol)加热回流5d。反应液冷却后加入50％的乙醇水溶液(5mL)，抽滤，得析出固体用乙醇重结晶，得目标产物，收率61％。

[0052] Mp 200.3-202.5℃；1H-NMR(DMSO-d6):d(ppm)1.50(m,4H),1.86(m,4H),1.70(m,4H),2.52(m,4H),3.61(m,1H),6.97(bs,2H),7.53(s,1H),10.48(s,1H)；ESI-MS m/z:308.4[M+H]+。

[0053] 实施例4：GX003(2-(3-异丙基脲)-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成[0054] 溶解化合物4(0.80mmol)在干燥的CH2Cl2(5mL)中，加入异丙基异氰酸酯(12.8mmol)加热回流5d。反应液冷却后加入50％的乙醇水溶液(5mL)，抽滤，得析出固体用乙醇重结晶，得目标产物，收率58％。

[0055] Mp 192.5-194.1℃；1H-NMR(DMSO-d6):d(ppm)1.27(m,6H),1.70(m,4H),2.52(m,4H),4.17(m,1H),6.97(bs,2H),7.53(s,1H),10.48(s,1H)；ESI-MS m/z:282.1[M+H]+。

[0056] 实施例5：GX004(2-(3-苯基脲)-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成[0057] 溶解化合物4(0.80mmol)在干燥的CH2Cl2(5mL)中，加入苯基异氰酸酯(12.8mmol)加热回流5d。反应液冷却后加入50％的乙醇水溶液(5mL)，抽滤，得析出固体用乙醇重结晶，得目标产物，收率71％。

[0058] Mp 223.5-230.1℃；1H-NMR(DMSO-d6):d(ppm)1.70(m,4H),2.52(m,4H),6.97(bs,2H),7.19(m,1H),7.43(m,2H),7.61(m,2H),7.53(s,1H),10.48(s,1H)；ESI-MS m/z:316.4[M+H]+。

[0059] 实施例6：GX005(2-(3-苄基脲)-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成[0060] 溶解化合物4(0.80mmol)在干燥的CH2Cl2(5mL)中，加入苄基异氰酸酯(12.8mmol)加热回流5d。反应液冷却后加入50％的乙醇水溶液(5mL)，抽滤，得析出固体用乙醇重结晶，得目标产物，收率52％。

[0061] Mp 187.5-193.2℃；1H-NMR(DMSO-d6):d(ppm)1.70(m,4H),2.52(m,4H),4.25(s,2H),6.97(bs,2H),7.26(m,1H),7.23(m,2H),7.33(m,2H),7.53(s,1H),10.48(s,1H)；ESI-MS m/z:330.1[M+H]+。

[0062] 实施例7：GX006(2-(3-苯基硫脲)-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成[0063] 溶解化合物4(0.80mmol)在干燥的CH2Cl2(5mL)中，加入苯基硫代异氰酸酯(12.8mmol)加热回流5d。反应液冷却后加入50％的乙醇水溶液(5mL)，抽滤，得析出固体用乙醇重结晶，得目标产物，收率41％。

[0064] Mp 198.5-201.3℃；1H-NMR(DMSO-d6):d(ppm)1.70(m,4H),2.52(m,4H),6.97(bs,2H),6.81(m,1H),7.20(m,2H),7.70(m,2H),7.53(s,1H),10.48(s,1H)；ESI-MS m/z:332.4[M+H]+。

[0065] 实施例8：GX007(2-(3-乙酰基硫脲)-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成

[0066] 溶解化合物4(0.80mmol)在干燥的CH2Cl2(5mL)中，加入乙酰基硫代异氰酸酯(12.8mmol)加热回流5d。反应液冷却后加入50％的乙醇水溶液(5mL)，抽滤，得析出固体用乙醇重结晶，得目标产物，收率23％。

[0067] Mp 211.3-215.3℃；1H-NMR(DMSO-d6):d(ppm)1.70(m,4H),1.86(s,3H),2.52(m,4H),6.97(bs,2H),7.53(s,1H),10.48(s,1H)；ESI-MS m/z:298.4[M+H]+。

[0068] 实施例9：GX008(2-(3-苯甲酰基硫脲)-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-3-甲酰胺)的合成

[0069] 溶解化合物4(0.80mmol)在干燥的CH2Cl2(5mL)中，加入苯甲酰基硫代异氰酸酯(12.8mmol)加热回流5d。反应液冷却后加入50％的乙醇水溶液(5mL)，抽滤，得析出固体用乙醇重结晶，得目标产物，收率33％。

[0070] Mp 180.5-182.5℃；1H-NMR(DMSO-d6):d(ppm)1.70(m,4H),2.52(m,4H),7.20(bs,2H),7.50(s,1H),7.63(m,2H),7.70(m,1H),8.03(m,2H),10.48(s,1H)；ESI-MS m/z:360.1[M+H]+。

[0071] 实施例10：中间体B(2-氨基-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-3-羧酸)的合成[0072] 环己酮(0.1mol)以及2-腈基乙酸乙酯(0.1mol)在乙醇溶液(25mL)中反应得到化合物3’(其中R1’为乙氧基甲酰基)，向反应后的溶液中加入硫粉(0.1–0.11mol)，滴加二乙胺(10mL)，并保持反应温度不超过50℃。反应3h后改为冰盐浴，使反应液产生结晶，如没有结晶将反应液倒入100mL水中，抽滤，得到化合物4’。所得固体产物化合物4’溶解在30mL丙酮溶液中，加入1mL NaOH水溶液(1mol/L)，于40℃下加热反应2h。反应结束后用稀盐酸调节pH＝1，二氯甲烷萃取后蒸干得到目标产物，即化合物5’(其中R1为羧基)，收率为29％。

[0073] Mp 230.1-232.3℃；1H-NMR(DMSO-d6):d(ppm)1.79(m,4H),2.65(m,4H),6.99(bs,2H),10.1(bs,1H)；LRMS-EI:m/z calcd 197,found 197.1。

[0074] 实施例11：GX009(2-(3-环己基硫脲)-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-3-羧酸)的合成[0075] 溶解化合物5’(0.80mmol)在干燥的CH2Cl2(5mL)中，加入环己基硫代异氰酸酯(12.8mmol)加热回流5d。反应液冷却后加入50％的乙醇水溶液(5mL)，抽滤，得析出固体用乙醇重结晶，得目标产物，收率45％。

[0076] Mp 200.1-204.2℃；1H-NMR(DMSO-d6):d(ppm)1.21(m,4H),1.49(m,6H),1.70(m,4H),2.52(m,4H),3.54(m,1H),7.53(s,1H),10.48(s,1H),10.23(bs,1H)；ESI-MS m/z:
339.5[M+H]+。

[0077] 实施例12：GX010(2-(3-环己基脲)-4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩-3-羧酸)的合成[0078] 溶解化合物5’(0.80mmol)在干燥的CH2Cl2(5mL)中，加入环己基异氰酸酯(12.8mmol)加热回流5d。反应液冷却后加入50％的乙醇水溶液(5mL)，抽滤，得析出固体用乙醇重结晶，得目标产物，收率59％。

[0079] Mp 195.5-199.7℃；1H-NMR(DMSO-d6):d(ppm)1.21(m,4H),1.49(m,6H),1.70(m,4H),2.52(m,4H),3.42(m,1H),7.36(s,1H),8.35(s,1H),10.11(bs,1H)；ESI-MS m/z:323.4[M+H]+。

[0080] 实施例13-22四氢苯并噻吩衍生物对GSK-3β的抑制作用

[0081] 四氢苯并噻吩衍生物对GSK-3β的抑制作用的通用实验方法如下：

[0082] 化合物对GSK-3β的IC50值检测是利用微流体芯片技术的迁移率检测技术(Mobility-Shitft Assay)，该技术是将毛细管电泳的基本理念应用到微流体环境中。在不加入中止试剂的情况下检测酶学实验。用于实验的底物是带有荧光标记的多肽，在反应体系中酶的作用下，底物转变为产物，其所带的电荷也发生了相应的变化，Mobility-Shitft Assay正是利用底物和产物所带电荷的不同，将二者进行分离，并分别进行检测。

[0083] Mobility-Shitft Assay法GSK-3β激酶活性检测实验材料：

[0084] GSK-3β，P15肽(一种15个氨基酸多肽)，ATP，DMSO，EDTA，96孔板，384孔板。

[0085] 以下实施例13-22为化合物GX001与阳性对照药Staurosporine的药理实验方法。

[0086] 实施例13：化合物GX001对GSK-3β抑制作用的实验方法

[0087] 基础缓冲液和终止缓冲液的配置，基础缓冲液20mM HEPES(pH 7.5),Triton X-100(0.01％)，MgCl2(10mM)，DTT(2mM)。终止缓冲液100mM HEPES(pH 7.5),Brij-35(0.015％)，Coating Reagent#3(0.2％)，EDTA(50mM)。将待测化合物GX001配置为10mM备用，并稀释成梯度浓度，Staurosporine作为阳性对照药，配置为10mM备用，并稀释成与GX001相同的梯度浓度。

[0088] 在96孔板中，加入100μl的DMSO溶剂至两个孔作为无化合物与无酶的控制组，并标记96孔板为原始板。从原始板转移5μl化合物GX001或Staurosporine到一个新的96孔板作为中间媒介板，加入95μl的酶缓冲液至中间媒介板，使得每孔为最终浓度为1％DMSO的反应，振摇10min。从中间媒介板每孔转移5μl至一个384孔板的两个孔。例如，96孔板的A1孔转移至384孔板的A1和A2孔，96孔板的A2孔转移至384孔板的A3和A4孔，以此类推。激酶反应方法，制备2.5倍量的酶和2.5倍量的FAM-标记的肽和ATP溶液，此时测试板已经含有5μl化合物GX001或Staurosporine的10％DMSO溶液。将10μl的2.5倍的酶溶剂加入至384孔板测试板的各个孔，在室温条件下孵育10min。将2.5倍的肽溶剂至测试板。在28℃的条件下孵化、培养，最终加入25μl终止缓冲液用于终止反应。在Caliper检测平台上收集数据并进行曲线拟合。

[0089] 抑制率＝(max-conversion)/(max-min)×100.

[0090] max为DMSO控制组荧光最大检测值；min为DMSO控制组荧光最小检测值；conversion为化合物检测荧光值。

[0091] IC50的计算公式如下：

[0092] Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+(LogIC50/X)×Hill Slope))

[0093] Top为梯度浓度检测下，测试化合物最大抑制率；Bottom为梯度浓度检测下，测试化合物最小抑制率；Hill Slope指的是拟合曲线最大斜率的绝对值(即曲线中点)。

[0094] 通过检测8个梯度浓度下的抑制率后拟合出GX001的IC50为9.22μM。阳性对照药Staurosporine对GSK-3β的IC50值为22nM(图1)。

[0095] 实施例14：化合物GX002对GSK-3β抑制作用的实验方法

[0096] 实验方法同实施例13

[0097] 通过检测8个梯度浓度下的抑制率后拟合出GX002的IC50为98.3μM(图1)。

[0098] 实施例15：化合物GX003对GSK-3β抑制作用的实验方法

[0099] 实验方法同实施例13

[0100] 通过检测8个梯度浓度下的抑制率后拟合出GX003的IC50为78.5μM(图1)。

[0101] 实施例16：化合物GX004对GSK-3β抑制作用的实验方法

[0102] 实验方法同实施例13

[0103] 通过检测8个梯度浓度下的抑制率后拟合出GX004的IC50为25.8μM(图1)。

[0104] 实施例17：化合物GX005对GSK-3β抑制作用的实验方法

[0105] 实验方法同实施例13

[0106] 通过检测8个梯度浓度下的抑制率后拟合出GX005的IC50为22.6μM(图1)。

[0107] 实施例18：化合物GX006对GSK-3β抑制作用的实验方法

[0108] 实验方法同实施例13

[0109] 通过检测8个梯度浓度下的抑制率后拟合出GX006的IC50为24.3μM(图1)。

[0110] 实施例19：化合物GX007对GSK-3β抑制作用的实验方法

[0111] 实验方法同实施例13

[0112] 通过检测8个梯度浓度下的抑制率后拟合出GX007的IC50为81.6μM(图1)。

[0113] 实施例20：化合物GX008对GSK-3β抑制作用的实验方法

[0114] 实验方法同实施例13

[0115] 通过检测8个梯度浓度下的抑制率后拟合出GX008的IC50为89.5μM(图1)。

[0116] 实施例21：化合物GX009对GSK-3β抑制作用的实验方法

[0117] 实验方法同实施例13

[0118] 通过检测8个梯度浓度下的抑制率后拟合出GX009的IC50为18.2μM(图1)。

[0119] 实施例22：化合物GX010对GSK-3β抑制作用的实验方法

[0120] 实验方法同实施例13

[0121] 通过检测8个梯度浓度下的抑制率后拟合出GX010的IC50为95.3μM(图1)。

[0122] 实施例23-32噻吩类衍生物的体外抗AD活性实验

[0123] 具体实验步骤如下：

[0124] 1、凝聚态Aβ25-35的制备

[0125] 用超纯水将冻干的Aβ25-35溶解配成1mmol/L的储存液，于-20℃保存，临用前于37℃放置4h使其凝聚。

[0126] 2、细胞培养与药物处理

[0127] 以每孔1×104个细胞将SH-SY5Y接种在96孔培养板。用含15％胎牛血清的RPMI1640培养液于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，隔3～4d传代。实验前16h细胞换用含N2添加剂的无血清培养液。通过MTT及LDH法观察不同浓度(10，20，40，80，160μmol/L)的Aβ25-35对SH-SY5Y细胞存活率的影响；选择对细胞存活影响较小的作用浓度和作用时间来诱导SH-SY5Y细胞中Tau蛋白过度磷酸化。

[0128] 3、MTT实验

[0129] 不同浓度凝聚态Aβ25-35作用24，48，72h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)10μL，37℃继续孵育4h，终止培养，吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜75μL，振荡10min，使结晶物充分溶解，用全自动酶标仪读取490nm处光密度值。设定正常对照组(扣除空白对照组)MTT代谢率为100％，其余各组光密度(扣除空白对照组)与之相比得到各自的MTT代谢率。

[0130] (1)空白组，不加Aβ25-35也不加药物。这一组的细胞存活率为100％。

[0131] (2)对照组，加确定浓度的Aβ25-35，但不加药物。

[0132] (3)实验组，加确定浓度的Aβ25-35，同时也加药物，如果药物有作用，则细胞的存活率会比对照组高(加药物的时间是在加Aβ25-35之前1h)。

[0133] 实施例23：化合物GX001对Aβ25-35诱导的细胞保护作用的药理实验[0134] 分别在5μM，10μM和20μM三个浓度下检测化合物GX001对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响，检测结果为细胞存活率分别为65.7％，74.8％，85.2％。空白组，不加Aβ25-35也不加药物。这一组的细胞存活率为100％。

[0135] 实施例24：化合物GX002对Aβ25-35诱导的细胞保护作用的药理实验[0136] 分别在5μM，10μM和20μM三个浓度下检测化合物GX002对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响，检测结果为细胞存活率分别为61.6％，68.7％，75.4％。空白组，不加Aβ25-35也不加药物。这一组的细胞存活率为100％。

[0137] 实施例25：化合物GX003对Aβ25-35诱导的细胞保护作用的药理实验[0138] 分别在5μM，10μM和20μM三个浓度下检测化合物GX003对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响，检测结果为细胞存活率分别为59.3％，70.8％，73.7％。

[0139] 空白组，不加Aβ25-35也不加药物。这一组的细胞存活率为100％。

[0140] 实施例26：化合物GX004对Aβ25-35诱导的细胞保护作用的药理实验[0141] 分别在5μM，10μM和20μM三个浓度下检测化合物GX004对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响，检测结果为细胞存活率分别为41.3％，49.7％，60.4％。

[0142] 空白组，不加Aβ25-35也不加药物。这一组的细胞存活率为100％。

[0143] 实施例27：化合物GX005对Aβ25-35诱导的细胞保护作用的药理实验[0144] 分别在5μM，10μM和20μM三个浓度下检测化合物GX005对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响，检测结果为细胞存活率分别为20.8％，32.2％，46.9％。

[0145] 空白组，不加Aβ25-35也不加药物。这一组的细胞存活率为100％。

[0146] 实施例28：化合物GX006对Aβ25-35诱导的细胞保护作用的药理实验[0147] 分别在5μM，10μM和20μM三个浓度下检测化合物GX006对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响，检测结果为细胞存活率分别为63.8％，69.1％，75.0％。

[0148] 空白组，不加Aβ25-35也不加药物。这一组的细胞存活率为100％。

[0149] 实施例29：化合物GX007对Aβ25-35诱导的细胞保护作用的药理实验[0150] 分别在5μM，10μM和20μM三个浓度下检测化合物GX007对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响，检测结果为细胞存活率分别为32.6％，45.7％，61.9％。

[0151] 空白组，不加Aβ25-35也不加药物。这一组的细胞存活率为100％。

[0152] 实施例30：化合物GX008对Aβ25-35诱导的细胞保护作用的药理实验[0153] 分别在5μM，10μM和20μM三个浓度下检测化合物GX008对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响，检测结果为细胞存活率分别为55.6％，68.5％，75.1％。

[0154] 空白组，不加Aβ25-35也不加药物。这一组的细胞存活率为100％。

[0155] 实施例31：化合物GX009对Aβ25-35诱导的细胞保护作用的药理实验[0156] 分别在5μM，10μM和20μM三个浓度下检测化合物GX009对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响，检测结果为细胞存活率分别为21.7％，48.7％，52.7％。

[0157] 空白组，不加Aβ25-35也不加药物。这一组的细胞存活率为100％。

[0158] 实施例32：化合物GX010对Aβ25-35诱导的细胞保护作用的药理实验[0159] 分别在5μM，10μM和20μM三个浓度下检测化合物GX010对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响，检测结果为细胞存活率分别为51.3％，62.4％，68.5％。

[0160] 空白组，不加Aβ25-35也不加药物。这一组的细胞存活率为100％。