一种可比率检测半胱氨酸的水溶性荧光传感器的制备及应用

摘要

本发明公开了一种可比率检测半胱氨酸的水溶性荧光传感器的制备及应用，该荧光传感器是以根据现有技术制备的碳量子点，异硫氰酸荧光素和丙烯酰氯为原料制备的一种新型比率检测半胱氨酸的水溶性荧光传感器。该荧光传感器能在纯水溶液中能实现对半胱氨酸的高选择性和高灵敏度比率检测。相比于现有的荧光检测技术，本发明得到的荧光传感器具有对半胱氨酸高选择性快速响应，低细胞毒性，优良的水分散性，且投入成本较低，合成路线简单等优点，适于放大合成和实际生产应用，在分析化学、生命科学等技术领域有着巨大的应用前景。

权利要求

1.一种可比率检测半胱氨酸的水溶性荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将异硫氰酸荧光素、三乙胺和丙烯酰氯溶解于二氯甲烷中，室温反应，反应完成之后除去溶剂，用硅胶柱纯化，得到产物1；

（2）将10g水、1g柠檬酸，0  .35g乙二胺的混合溶液放置在功率为640W的微波反应器上 反应5分钟得粗产物，将粗产物用3ml水溶解，沉淀于40ml乙醇溶液，后真空干燥，可制备表面含羧基的碳量子点；将碳量子点与一定量的产物1溶解于二甲基亚砜，将混合溶液置于避光和N2保护的条件下室温搅拌，反应结束后用乙醚沉淀，离心，真空干燥，得到产物2，即一种可比率检测半胱氨酸的水溶性荧光传感器。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，碳量子点和产物1的质量比为1:1 5；保持碳量子点在二甲基亚砜的浓度为5 20 g/L。

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3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，碳量子点和产物1的质量比为1:2 3；

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保持碳量子点在二甲基亚砜的浓度为10 15 g/L。

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4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法制备的水溶性荧光传感器在选择性比率检测半胱氨酸中的应用。

说明书

一种可比率检测半胱氨酸的水溶性荧光传感器的制备及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种可用于检测的荧光传感器的制备和应用，具体来说，涉及可比率检测半胱氨酸的水溶性荧光传感器的制备及其应用，属于化学材料制备及分析检测领域。

背景技术

[0002] 半胱氨酸(Cys)是广泛存在于生物细胞中一种非常重要的还原性物种，也是人体的必须具有生理功能氨基酸之一，同时也是组成蛋白质的20多种氨基酸中具有还原性基团巯基(-SH)的氨基酸之一，在维持细胞的氧化还原进程中起着重要的作用，且水平异常的生物硫醇会导致各种各样的疾病，例如发育缓慢、头发退色、水肿、精神萎靡、肝脏疾病、皮肤损伤、低血糖脑损伤及瘦弱等。此外，Cys已在医药、食品添加剂和化妆品中广泛应用，可见其在生物世界起相当重要的作用。

[0003] 目前，已经发展起来的检测半胱氨酸的方法很多，但是主要以小分子传感器为主。然而，涉及到小分子传感器，便不能忽视其所特有的缺陷，首先是小分子传感器大多数在纯有机溶剂或者混合溶剂中工作，因为有机溶剂的生物毒性限制了它的可应用性；其次是小分子传感器在水中会因为彼此之间的π-π相互作用导致聚集，进一步限制了可应用性。这也导致这类传感器在实际检测中运用的可行性降低。此外，目前的传感器主要是利用单波长发射来检测半胱氨酸，相比于单波长发射容易受到仪器波动，样品浓度，环境等因素的影响，双波长比率荧光探针因其双波长比率检测的有点可以有效的避免单波长所面临的缺陷。除此之外，水溶性荧光传感器因其优异的水溶性、低细胞毒性、无有机溶剂残留、可设计性强、高灵敏度、高选择性等优点，受到了越来越多的关注，在化学、医学和环境科学等研究领域显示了极其广阔的应用前景。

[0004] 此外，目前针对于半胱氨酸（Cys），高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）的荧光传感器已经有很多被制备，但是仍然存在着几个问题，首先是已经报道的很多荧光传感器不能够很好的区分这三种具有还原性基团巯基(-SH)的氨基酸(Chen. W, et al. Anal. Chem 2016, 88 (7), 3638-3646; Wang. P, et al. Sens Actuators B  2017,245, 297-304; Li. Y, et al. Biosens Bioelectron  2017,90, 117-124; Chen. Z, et al. Biosens Bioelectron 2017,91, 553-559; Gao. Q, et al. Anal Chem 2017,89 (8), 4517-
4524.)。其次是水溶性和生物毒性。虽然已经有利用异硫氰酸荧光素和丙烯酰氯结合特异性识别Cys (Ma. D, et al. Chem Asian J  2015,10 (4), 894-902)，但是这个探针要有乙腈（体积含量大约为30%）作为助溶剂，除此之外也有一些针对于区分这三种氨基酸的荧光探针(Li. R, et al. J Mol Struct  2017,1136, 1-6; Ma. D, et al. Chem Asian J 
2015,10 (4), 894-902; Song. X, et al. Anal Methods 2017,9 (12), 1891-1896; Han. C, et al. ACS Appl Mater Interfaces 2015,7 (50), 27968-27975.)，然而这些探针都面临着一个突出的缺陷，就是需要在有机溶剂和水的混合溶剂中工作。众所周知，有机溶剂的细胞毒性是一个很大的问题，并且小分子荧光探针本身也有很大的生物毒性，这在很大程度上限制了在生物和医学领域的应用。

[0005] 因此，发明一种简单、低成本、优良的水溶性、生物毒性低、且高效的可比率检测半胱氨酸的水溶性荧光传感器具有相当重要的现实意义和应用前景。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种可比率检测半胱氨酸的水溶性荧光传感器的制备方法及应用，该荧光传感器以根据现有技术制备的碳量子点（CN104357048B），异硫氰酸荧光素和丙烯酰氯为原料制备。进一步应用研究表明，该荧光传感器能够实现对水中半胱氨酸的高灵敏度、高选择性的比率检测。

[0007] 本发明的目的是通过下述方式实现的：

[0008] 一种可比率检测半胱氨酸的聚合物荧光传感器的制备，包括以下步骤：

[0009] （1）将一定的异硫氰酸荧光素、三乙胺和丙烯酰氯溶解于二氯甲烷中，室温反应，反应完成之后除去溶剂，用硅胶柱纯化，得到产物1；

[0010] （2）取一定量的产物1和根据专利（CN104357048B）制备的碳量子点溶解于二甲基亚砜，将混合溶液置于避光和N2保护的条件下室温搅拌，反应结束后用乙醚沉淀，离心，真空干燥，得到产物2，即一种可比率检测半胱氨酸的水溶性荧光传感器。

[0011] 根据上述制备方法制备的荧光传感器，其具体的反应过程如下：

[0012]

[0013] 步骤（2）中，碳量子点和产物1的质量比为1:1 5，保持碳量子点在二甲基亚砜的浓~度为5 20 g/L。
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[0014] 作为进一步优选，碳量子点和产物1的质量比为1:2 3；保持碳量子点在二甲基亚~砜的浓度为10 15 g/L。
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[0015] 根据上述的制备方法制备的水溶性荧光传感器在比率检测半胱氨酸中的应用。

[0016] 本发明以柠檬酸，乙二胺，异硫氰酸荧光素和丙烯酰氯为原料来制备所需要的水溶性荧光传感器，该聚合物荧光传感器在的pH为7.4的缓冲溶液稀释之后，在有半胱氨酸存在时，在516 nm处会随着半胱氨酸浓度的增加出现显著的荧光增强现象，而在455 nm处，随着半胱氨酸浓度的增加荧光强度只有微小的变化，进而表现出优良的比率检测效果。并且随着半胱氨酸浓度的增加，可见光下溶液逐渐由浅绿色变为明亮的绿色，而在紫外光下，溶液由明亮的蓝色荧光逐渐变为明亮的绿色荧光。而且该荧光传感器对半胱氨酸的检测具有明显的高选择性，并且能达到高灵敏度检测的效果。相比于现有的一些检测技术，本发明中的荧光化学传感器克服了传统小分子传感器水溶性差、细胞毒性大的缺点，成本投入较少，合成路线简单、后处理方便、可直接对半胱氨酸实现快速特异性识别，尤其是在生理环境pH为7左右的生物体内环境的应用有着极其重要的意义。

[0017] 总而言之，本发明提供了一种可比率检测半胱氨酸的水溶性荧光传感器的制备及其应用，该聚合物荧光传感器制备简单，灵敏度高，有望在生物材料科学领域得到广泛应用。

附图说明

[0018] 图1为制备的荧光传感器的核磁共振氢谱图。

[0019] 图2为制备的荧光传感器的粒径图。

[0020] 图3为制备的荧光传感器对半胱氨酸的识别示意图。

[0021] 图4为不同半胱氨酸(Cys)浓度时，荧光传感器的荧光发射光谱变化图（激发波长：360 nm），[Cys] = 0 mol/L（a），1.0×10-6 mol/L（b）, 3.0×10-6 mol/L（c）, 5.0×10-6 mol/L（d），7×10-6 mol/L（e），1.0×10-5 mol/L（f）, 1.5×10-5 mol/L（g）, 2×10-5 mol/L（h），3.0×10-5 mol/L（i）,4.0×10-5 mol/L（j）。

[0022] 图5为荧光传感器随Cys浓度变化的荧光强度变化值对应的拟合曲线和该曲线所对应的函数图。

[0023] 图6为各种离子对该荧光传感器荧光比率强度的选择性对比数据图，加入后的离子的浓度均为5.0×10-4 mol/L，Cys浓度为5.0×10-5 mol/L，I455和I516为各离子加入前后的荧光传感器在以360 nm为激发波长，455 nm和516 nm为发射波长处的荧光强度变化值。

具体实施方式

[0024] 下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。

[0025] 实施例1：一种可比率检测半胱氨酸的荧光传感器的制备，具体步骤以下：

[0026] （1）取异硫氰酸荧光素（100 mg）和三乙胺（100 mg）溶解于40 mL的二氯甲烷，然后将丙烯酰氯(231 mg)溶解到5 mL的二氯甲烷中，然后滴加到上述溶液中，室温搅拌3 h，反应结束后旋转蒸发除去大部分（85 95%）二氯甲烷，过柱提纯产物，真空干燥，得到产物1；~

[0027] （2）将步骤（1）合成的产物1（50 mg）和根据现有技术制备的碳量子点（50 mg）溶解于二甲基亚砜（5 mL）溶液中，室温反应24小时，反应结束后先用乙醚沉淀，然后用甲醇沉淀，离心，真空干燥，得产物2。

[0028] 实施例2：一种可比率检测半胱氨酸的荧光传感器的制备，具体步骤以下：

[0029] （1）取异硫氰酸荧光素（100 mg）和三乙胺（100 mg）溶解于40 mL的二氯甲烷，然后将丙烯酰氯(231 mg)溶解到5 mL的二氯甲烷中，然后滴加到上述溶液中，室温搅拌3 h，反应结束后旋转蒸发除去大部分（85 95%）二氯甲烷，过柱提纯产物，真空干燥，得到产物1；~

[0030] （2）将步骤（1）合成的产物1（250 mg）和根据现有技术制备的碳量子点（50 mg）溶解于二甲基亚砜（8 mL）溶液中，室温反应24小时，反应结束后先用乙醚沉淀，然后用甲醇沉淀，离心，真空干燥，得产物2。

[0031] 实施例3：一种可比率检测半胱氨酸的荧光传感器的制备，具体步骤以下：

[0032] （1）取异硫氰酸荧光素（100 mg）和三乙胺（100 mg）溶解于40 mL的二氯甲烷，然后将丙烯酰氯(231 mg)溶解到5 mL的二氯甲烷中，然后滴加到上述溶液中，室温搅拌3 h，反应结束后旋转蒸发除去大部分（85 95%）二氯甲烷，过柱提纯产物，真空干燥，得到产物1；~

[0033] （2）将步骤（1）合成的产物1（150 mg）和根据现有技术制备的碳量子点（50 mg）溶解于二甲基亚砜（10 mL）溶液中，室温反应24小时，反应结束后先用乙醚沉淀，然后用甲醇沉淀，离心，真空干燥，得产物2。然后将产物2溶解到水中，最终浓度为1mg/mL。即一种可比率检测半胱氨酸的荧光传感器。该荧光传感器以纳米粒子的形式存在，其粒径数据如图1所示。

[0034] 实施例4：半胱氨酸的检测实验。

[0035] 取10个5 mL样品瓶，分别加入实施例3中所得的荧光传感器溶液15 µL（该荧光传感器原溶液的浓度为1 mg/mL），依次加入2.985 mL的pH为7.4的缓冲溶液溶液，搅拌1 min之后分别将浓度为[Cys] = 0 mol/L（a），1.0×10-4 mol/L（b），3.0×10-4 mol/L（c），5.0×-4 -4 -3  -3  -310  mol/L（d），7×10  mol/L（e），1.0×10 mol/L（f），1.5×10 mol/L（g），2×10  mol/L（h），3.0×10-3 mol/ L（i）, 4.0×10-3 mol/L（j）的3µL半胱氨酸溶液加入9个样品瓶中，常温下搅拌10 min后，以360 nm为激发波长，分别测定每个样品的荧光发射光谱，得9个样品的荧光发射光谱变化图，见图4。测定结果表明：该聚合物荧光传感器在455 nm处的荧光强度随着半胱氨酸浓度的逐渐增加而保持不变，而在516 nm处的荧光强度明显上升。根据图4中455 nm和516 nm处荧光强度比率变化值与浓度的变化关系可作出对应的拟合后的比较理想的函数曲线图和该曲线所对应的函数图（y=a+b×x，a=0.8498，b=0.01944，R2=
0.9751），见图5。

[0036] 实施例5：其它离子影响的对比检测实验。

[0037] 取12个5 mL样品瓶，分别装入实施例1中所得的荧光传感器溶液15 µL（该荧光传感器浓度为0.02 mg/mL），然后依次加入2.985 mL的pH为7.4的缓冲溶液，搅拌1 min之后分别将浓度为0.1 mol/L的Na+、K+、S2-、BSA（牛血清白蛋白）、Gln（谷氨酸）、Ser（丝氨酸）、Asn（天冬酰胺）、Thr（苏氨酸）、Hcy（高半胱氨酸）、GSH（谷胱甘肽）溶液和浓度为8.0×10-3 mol/L 的半胱氨酸溶液各取15 µL加入另外前11个样品瓶中，12号样品为空白样。然后分别测定12个样品在360 nm波长激发下的荧光光谱数据，得到在455 nm和516nm波长发射处的荧光比率变化值，结果见图6。测定结果表明：除了半胱氨酸外，其它上述各种离子和氨基酸对所制备的荧光传感器的荧光比率强度没有明显影响。

[0038] 上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明所作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。