鸭抗原转运相关蛋白TAP2单克隆抗体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了鸭抗原转运相关蛋白TAP2单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明首先提供了一株稳定分泌鸭抗原转运相关蛋白TAP2单克隆抗体的杂交瘤细胞株；本发明进一步提供了构建所述杂交瘤细胞株的方法，包括：构建表达TAP2的原核表达质粒；诱导原核表达质粒表达TAP2蛋白，将表达产物过镍柱，用咪唑洗脱液洗脱目的蛋白得到纯化的重组TAP2蛋白；用纯化的重组TAP2蛋白免疫BALB/c雌小鼠，将免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选获得特异性抗体分泌最高的阳性单克隆株。免疫组织化学检测结果表明，本发明制备的TAP2单克隆抗体(1A6)具有特异性生物学功能，能应用于检测动物组织或细胞内的TAP2蛋白。

权利要求

1.一株稳定分泌鸭抗原转运相关蛋白TAP2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No. 12997。

2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的鸭抗原转运相关蛋白TAP2单克隆抗体。

3.权利要求1所述杂交瘤细胞株在检测TAP2蛋白在动物组织或细胞内表达或分布中的应用，所述的检测是非诊断或治疗目的的应用。

4.权利要求2所述鸭抗原转运相关蛋白TAP2单克隆抗体在检测TAP2蛋白在动物组织或细胞内表达或分布中的应用，所述的检测是非诊断或治疗目的的应用。

5.检测鸭抗原转运相关蛋白TAP2的免疫组化试剂盒，包括检测抗体，其特征在于，所述的检测抗体是权利要求2所述的鸭抗原转运相关蛋白TAP2单克隆抗体。

说明书

鸭抗原转运相关蛋白TAP2单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及鸭抗原转运相关蛋白TAP2单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明进一步涉及它们在免疫组化中的应用，属于 TAP2单克隆抗体领域。

背景技术

[0002] 抗原处理相关转运体(Transporter associated with antigen processing, TAP)是一种异二聚体跨膜转运蛋白，TAP1/TAP2跨越内质网膜6次形成“匙孔”样结构。肿瘤抗原和病毒编码蛋白等内源性抗原，被抗原递呈细胞(APC)内的蛋白酶复合物水解成8-10个氨基酸的短肽。肽首先与“匙孔”的胞浆区结合，ATP结合在TAP1/TAP2的羧基端，水解导致异二聚体构型改变，开放跨膜通道，暴露膜内区的结合位点，肽段被转运于内质网腔内。在Tapasin、钙连蛋白和钙网蛋白等分子伴侣的协同作用下与内质网中新合成组装完整的MHCIα/β2m分子上的肽结合槽结合，形成稳定的MHC I-抗原肽复合物。分泌至APC细胞表面，被CD8+T细胞识别并引起免疫应答。TAP蛋白对MHC I类分子在细胞膜上表达的密度和稳定性起重要作用：TAP分子缺陷或表达降低，可导致MHC I类分子因没有荷载抗原肽而无法在细胞表面稳定表达。

[0003] 不同种属动物的TAP基因均位于MHC核心区域，但大小和基因组位置各不相同。火鸡的TAP基因还没有明确鉴定，但是已通过序列分析获得了功能和序列类似的MDR/TAP基因。鸡TAP2基因与优势表达的MHC 经典I类分子a链编码基因BF2紧密相连。鹌鹑TAP基因结构更为复杂，与经典I类分子4个拷贝基因相邻。鸭有TAP1和TAP2两个反向转录的拷贝基因，其中TAP2与MHCI类分子5个拷贝基因中的优势表达基因UAA毗邻。

[0004] 在机体被致病性病毒侵袭或有应激的情况下，如果TAP基因组序列发生突变或其调节机制出现缺陷，均可以导致TAP蛋白的活性下降和表达下调，导致肿瘤抗原不能被有效地转运，使肿瘤逃逸免疫监视，最终引起病毒性感染或发生肿瘤。

[0005] TAP基因的多态性与多种疫病的种族敏感性有关，相关度较高的有鼻咽癌(黄种人较白种人患病多)、原发性黑色素瘤、乳腺癌、汉族食管癌以及人乳头瘤病毒导致的宫颈癌等，但免疫遗传学分子机制尚未阐明。鸭的人工驯化时间较短，家鸭的遗传资源丰富度远大于家鸡，是良好的免疫遗传研究的模式动物。利用TAP基因纯合的无特定病原体实验动物化鸭群感染鸭瘟或禽流感后，不同单倍型鸭的血清抗体效价或致病性不同，表明鸭TAP基因有可能作为病毒病免疫遗传机制研究的候选靶基因。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株稳定分泌鸭抗原转运相关蛋白TAP2单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

[0007] 本发明所要解决的第二个技术问题是将所述杂交瘤细胞株分泌的鸭抗原转运相关蛋白TAP2单克隆抗体应用于检测在动物组织或细胞内表达的TAP2蛋白。

[0008] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

[0009] 本发明首先构建表达TAP2的原核表达质粒pET-A2TAP2PBD；采用 IPTG诱导pET-A2TAP2PBD原核表达质粒，菌体超声破碎后，离心弃上清，沉淀用含尿素的结合缓冲液重悬，过镍柱；用含有不同浓度的咪唑洗脱液洗脱目的蛋白，SDS-PAGE结果显示主要在100mM咪唑浓度时， A2TAP2PBD蛋白被洗脱下来。进一步利用表达纯化的重组A2TAP2PBD 蛋白免疫BALB/c雌小鼠，将免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，最初获得6A、4F、3A、10D、9C、6F、10H、6H和7H共9孔阳性细胞孔。但经过连续4次扩大培养并检测，结果表明，只有6A和4F的衍生细胞仍保持阳性，其它7株逐渐失去分泌特异性抗体的能力，且6A始终表现为强阳性，4F的EILSA OD450值较低；因此，本发明保留6A进一步作亚克隆化。经过4次亚克隆，筛选获得特异性抗体分泌最高的单克隆株，命名为1A6，进一步制备了腹水。

[0010] 本发明进一步对16A进行亚类鉴定，鉴定结果为：其单抗重链类型为IgM，轻链为Kappa链。

[0011] 通过截短表达的方式，确定了1A6针对的TAP蛋白表位：先后设计并合成两对引物，鉴定1A6的表位，确定1A6针对的段肽的氨基酸序列为NARHQMLQQAVLDATAGTGMVAQEAI。Blast分析表明，与NCBI 登录的鸭TAP蛋白序列同源性为96％(AAQ62605.1)-88％(AAZ30019.1)。

[0012] 本发明将稳定分泌鸭抗原转运相关蛋白TAP2抗体的单克隆杂交瘤细胞株1A6提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12997；分类命名为：BALB/c小鼠杂交瘤细胞。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2016年10月26日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

[0013] 为了确证本发明制备的单克隆抗体1A6是否具有特异性生物学功能，本发明将鸭瘟强毒株感染雏鸭的大肠、肾脏、盲肠扁桃体和法氏囊组织，-20度冻存后制备冰冻切片。将1A6用PBS稀释10倍，HRP标记鼠 IgG为二抗，进行免疫组织化学检测。免疫组织化学检测结果表明，在肠粘膜、肾小球、法氏囊生发中心等部位，检测到特异性很强的阳性信号，而在气管、心脏和小肠组织，未检测到特异性显色，特异性显色部位与鸭瘟主要引起消化道症状相符合，这是首次利用TAP特异性单抗检测到鸭瘟感染组织中TAP蛋白的表达部位。

[0014] 为了确证本发明制备的鸭TAP蛋白特异性单抗是否能够检测到 TAP蛋白在亚细胞水平的表达，本发明采集3周龄商品化鸭瘟疫苗免疫后攻击鸭肠炎病毒(DEV)强毒株CSC后的鸭大肠组织，2.5％戊二醛固定 2h，用0.1M PBS漂洗3次，每次15min。再加入1％锇酸4℃固定1-2h，用0.1M PBS漂洗3次，每次15min；用50％、70％、90％、100％丙酮逐级脱水。加入Epon812树脂，室温浸透过夜。将样品块挑出放在包埋模具中80℃聚合48h，修块、切片，切片、染色。冷冻电镜检测结果表明，在肠粘膜细胞的细胞核核膜上，可清晰看到特异性的标记(图6)，这说明利用本发明制备鸭TAP蛋白特异性单抗能够检测到TAP蛋白在亚细胞水平的表达。

附图说明

[0015] 图1为A2TAP2PBD原核表达蛋白纯化SDS-PAGE结果；M:蛋白质分子质量标准；1.过镍柱前；2流穿(1)；3.流穿(2)；4.流穿(3)； 5.洗脱液；6.100mM(1)；7.100mM(2)；8.250mM(1)；9.250mM(2)； 10.250mM(3)；11.250mM(4)；12.500mM(1)；13.500mM(2)；14.500mM (3)；15.800mM(1)；16.800mM(2)；17.1M(1)；18.1M(2)。

[0016] 图2鼠抗A2TAP2PBD蛋白多克隆抗体的Western blot检测结果；M：蛋白质分子质量标准；1：诱导前菌体蛋白；2：诱导后菌体蛋白； A为SDS-PAGE结果，B的一抗为鼠多抗血清，C的一抗为阴性鼠血清。

[0017] 图3 4F的Western blot检测结果；M:蛋白质分子质量标准；1: 诱导前A2TAP2PBD；2：诱导后A2TAP2PBD。

[0018] 图4 1A6的Western blot检测结果；M:蛋白质分子质量标准；1:  诱导前A2TAP2PBD；2：诱导后A2TAP2PBD。

[0019] 图5为1A6与鸭瘟感染雏鸭组织的免疫组织化学反应性结果。

[0020] 图6为1A6与鸭肠粘膜细胞的冷冻电镜检测结果。

具体实施方式

[0021] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

[0022] 实施例1重组TAP2蛋白的制备

[0023] 1.鸭TAP基因的扩增与原核表达

[0024] 提取HBK-SPF鸭A2单倍型鸭脾脏总RNA，反转录成cDNA，作为 PCR反应模板，扩增鸭A2TAP2PBD基因片段。克隆入原核表达载体 pET-30a载体，构建成功pET-A2TAP2PBD原核表达质粒。

[0025] 2.目的蛋白纯化条件的优化

[0026] IPTG诱导pET-30aA2TAP2PBD原核表达质粒，菌体超声破碎后，离心弃上清，沉淀用含尿素的结合缓冲液重悬，过镍柱。用含有不同浓度的咪唑洗脱液洗脱目的蛋白，SDS-PAGE结果显示主要在100mM咪唑浓度时，A2TAP2PBD蛋白被洗脱下来，100mM(1)为第一次洗脱后洗脱液制样，100mM(2)为第二次洗脱后洗脱制样。在250mM(1)洗脱浓度时条带也较明显，但鉴于250mM(2)和250mM(3)随着洗脱次数增大蛋白降低，所以250mM咪唑浓度不是最佳洗脱浓度。500、800和1000mM 咪唑浓度时，只有少量蛋白被洗脱下来，因此，最终确定咪唑的最佳洗脱浓度为100mM。

[0027] 实施例2鸭抗原转运相关蛋白TAP2单克隆抗体的制备及鉴定

[0028] 1动物免疫及细胞融合

[0029] 取7周龄的BALB/c雌性小鼠，用纯化的A2TAP2PBD蛋白进行免疫，50μg/小鼠,腹腔注射。每隔2周免疫一次，第3次免疫后一周对免疫鼠断尾采血，37℃放置1h，4℃离心10min分离血清。将血清倍比稀释，用间接ELISA检测血清效价，选择血清效价最高的小鼠于融合前3天加强免疫。

[0030] 用纯化后的A2TAP2PBD蛋白免疫小鼠后获得的阳性鼠多抗血清作为一抗，检测纯化前后的A2TAP2PBD重组菌，在22kD位置出现目的条带(图2)。阴性鼠血清不能检测出条带。

[0031] 2间接ELISA方法的建立及阳性杂交瘤株的筛选

[0032] 根据棋盘法，确定间接ELISA的包被浓度为1.25ug/ml。A2TAP2PBD 蛋白用碳酸盐缓冲液稀释成10μg/mL，2倍倍比稀释，6个稀释度，每孔 100μL分别包被酶标板中，设置2个重复。封口膜密封后4℃包被过夜。 PBST洗板3次，每次浸泡5min，拍干。用PBS配制5％的脱脂乳封闭酶标板，250μL/孔，37℃作用3h封闭非结合位点，之后用PBST洗板3 次，每次浸泡5min，拍干。从1：800的稀释度开始，加入2×系列PBS稀释后的血清，100μL/孔，同时设空白对照和阴性对照，封口膜封闭后37℃作用1h，之后用PBST洗板3次，每次浸泡5min，拍干。加入1：8000 稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG，100μL/孔，封口膜封闭后37℃作用 1h，之后用PBST洗板3次，每次浸泡5min，拍干。加入TMB基质显色液，75μL/孔，37℃，避光反应3min，加入等体积的2M硫酸终止液，用酶标仪测定OD450nm的吸光值。

[0033] 用统计学的方法判定阳性标准：(样品孔OD450nm值－空白对照 D450nm值)/(阴性对照孔OD450nm值－空白对照D450nm值)>2.1。

[0034] 最初获得6A、4F、3A、10D、9C、6F、10H、6H和7H共9孔阳性细胞孔。但经过连续4次扩大培养并检测，结果表明，只有6A和4F的衍生细胞仍保持阳性，其它7株逐渐失去分泌特异性抗体的能力，且6A 始终表现为强阳性，4F的EILSA OD450值较低(表1)。

[0035] 表1 6A和4F 5次检测的OD值

[0036]

[0037] 分别利用6A和4F扩大孔对A2TAP2PBD重组菌进行Western-blot，结果表明，在相同稀释倍数和反应条件下，4F反应较弱(图3)，而6A 能清晰检测到与分子量符合的特异性条带(图4)。表明6A的结合力强于4F。保留6A，继续做亚克隆化。经过4次亚克隆，最终筛选获得特异性抗体分泌最高的单克隆株，命名为1A6。进一步制备了腹水。

[0038] 3 1A6的亚类

[0039] 根据 Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit说明书对6A进行亚类鉴定，结果为1A6单抗蛋白的重链亚类类型为IgM，轻链为Kappa 链。

[0040] 4 1A6表位鉴定

[0041] 通过截短表达的方式，确定了1A6针对的TAP蛋白表位。先后设计并合成两对引物，鉴定1A6的表位，最终确定1A6针对的段肽的氨基酸序列为NARHQMLQQAVLDATAGTGMVAQEAI。Blast分析表明，与 NCBI登录的鸭TAP蛋白序列同源性为96％(AAQ62605.1) -88％(AAZ30019.1)。

[0042] 实验例1 1A6与鸭瘟感染雏鸭组织的免疫组织化学反应性实验

[0043] 将鸭瘟强毒株感染雏鸭的大肠、肾脏、盲肠扁桃体和法氏囊组织， -20度冻存后制备冰冻切片。将实施例制备的1A6用PBS稀释10倍，HRP 标记鼠IgG为二抗，进行免疫组织化学检测。结果表明，在大肠的粘膜、肾小球、法氏囊的生发中心等部位，检测到特异性很强的阳性信号，而在气管、心脏和小肠组织，未检测到特异性显色(图5)。特异性显色部位与鸭瘟主要引起消化道症状相符合，表明1A6能特异地检测鸭体内表达的TAP蛋白。

[0044] 实验例2 1A6与鸭肠粘膜细胞的冷冻电镜检测结果

[0045] 采集3周龄商品化鸭瘟疫苗免疫后攻击鸭肠炎病毒(DEV)强毒株 CSC后的鸭大肠组织，2.5％戊二醛固定2h，用0.1M PBS漂洗3次，每次15min。再加入1％锇酸4℃固定1-2h，用0.1M PBS漂洗3次，每次 15min；用50％、70％、90％、100％丙酮逐级脱水。加入Epon812树脂，室温浸透过夜。将样品块挑出放在包埋模具中80℃聚合48h，修块、切片，切片、染色。结果表明，在肠粘膜细胞的细胞核核膜上，可清晰看到特异性的标记(图6)。这是首次利用鸭TAP蛋白特异性单抗检测到TAP蛋白在亚细胞水平的表达。