一种大菱鲆ZW全雌苗种的制种方法

摘要

一种大菱鲆ZW全雌苗种的制种方法，属于鱼类养殖技术领域，它包括如下步骤：(1)采用遗传失活鱼类异源精子诱导有丝分裂雌核发育的方法获得大菱鲆有丝分裂雌核发育卵；(2)对所获有丝分裂雌核发育卵进行孵化和苗种培育，得到有丝分裂雌核发育苗种；(3)将所获有丝分裂雌核发育苗种养殖成为有丝分裂雌核发育后备亲鱼；(4)对有丝分裂雌核发育后备亲鱼进行促熟培育和产卵调控，选择超雌亲鱼；(5)对大菱鲆WW超雌亲鱼和正常ZZ雄鱼进行人工授精，获得遗传型全部是ZW的受精卵；(6)对ZW受精卵进行卵孵化和苗种培育，获得规模化的大菱鲆全雌苗种；本发明证明了大菱鲆WW超雌鱼可以成活和繁殖，并利用超雌亲鱼和普通雄鱼受精实现了大菱鲆全雌苗种的规模化生产，大幅度地缩短了制种周期和降低了制种成本。

权利要求

1.一种大菱鲆ZW全雌苗种的制种方法，其特征在于它包括如下步骤：（1）采用遗传失活鱼类异源精子诱导有丝分裂雌核发育的方法获得大菱鲆有丝分裂雌核发育卵；（2）对所获有丝分裂雌核发育卵进行孵化和苗种培育，得到有丝分裂雌核发育苗种；（3）将所获有丝分裂雌核发育苗种养殖成为有丝分裂雌核发育后备亲鱼；（4）对有丝分裂雌核发育后备亲鱼进行促熟培育和产卵调控，能够正常成熟和采卵的雌鱼即为大菱鲆WW超雌亲鱼；（5）对大菱鲆WW超雌亲鱼和正常ZZ雄鱼分别进行产卵调控， 正常ZZ雄鱼开始进行繁殖调控的时间要比大菱鲆WW超雌亲鱼推迟一个月，采集卵子和精液进行人工授精，获得遗传型全部是ZW的受精卵；（6）对ZW受精卵进行孵化和苗种培育，获得规模化的大菱鲆全雌苗种；

选择步骤（1）所述遗传失活鱼类异源精子的标准：1）遗传失活后与大菱鲆卵人工授精的受精率高于70%，保证有较高的诱导效率；2）杂种仔鱼不能成活，保证即使精子的遗传失活处理失败，所形成的杂种胚胎也不能培育出苗种，以节省后续苗种筛选工序；

所述步骤（2）中的苗种培育方法：雌核发育初孵仔鱼布池时水温与孵化水温相同13-15℃，每天升温1℃，水温上升至18℃时停止，以后整个苗种培育过程直至苗种全长达到50mm以前，苗种培育水温严格控制在18±0.5℃；

所述步骤（4）所述对有丝分裂雌核发育后备亲鱼进行促熟培育和产卵调控，具体方法为雌核发育后备亲鱼年龄达到4龄以后，预定产卵期前3个月，开始进行促熟和产卵调控，控制条件为光照强度300-500lx，光照周期16h光照：8h黑暗，水温13±0.5℃；经过3个月的促熟和产卵调控培育，部分雌核发育雌鱼达到性成熟，将发育成熟和可以产卵的雌鱼挑选出来，就是大菱鲆WW超雌亲鱼；

所述步骤（6）：ZW受精卵孵化后初孵仔鱼布池时水温与孵化水温相同，即均为13 15℃，~

5d内将水温缓慢升至18℃，苗种规格达到20～50mm期间，苗种培育水温严格控制水温在18±0.5℃。

2.根据权利要求1所述的一种大菱鲆ZW全雌苗种的制种方法，其特征在于所述的遗传失活鱼类异源精子为真鲷冷冻精子；真鲷冷冻精子遗传失活处理：将解冻后的真鲷精液用4℃预冷的Hank’s液稀释至原始精液的20倍，用剂量为6480 7200erg mm-2的紫外线将真鲷精~子遗传物质灭活，取灭活后的真鲷精液与大菱鲆卵子按体积比1:20-30比例进行授精。

3.根据权利要求1所述的一种大菱鲆ZW全雌苗种的制种方法，其特征在于步骤（1）中遗传失活鱼类异源精子与大菱鲆卵子受精后85-90min，将受精卵置于静水压机的压力舱中，在75MPa压力强度下进行休克处理，持续处理6min后泄压，取出受精卵，置于孵化器中继续孵化；压力处理过程中海水温度14.5±0.5℃。

4.根据权利要求1所述的一种大菱鲆ZW全雌苗种的制种方法，其特征在于，步骤（3）中有丝分裂雌核发育后备亲鱼培育方法为大菱鲆有丝分裂雌核发育苗种全长达到100mm后，逐尾采用PIT和荧光双重标记后，与普通健康苗种同池混养。

说明书

一种大菱鲆ZW全雌苗种的制种方法

技术领域

[0001] 本发明属于鱼类养殖技术领域，具体地涉及一种大菱鲆ZW全雌苗种的制种方法。

背景技术

[0002] 大菱鲆(Scophthalmus maximus)是世界性鲆鲽类养殖良种，养殖范围遍及欧、美、亚洲十几个沿海国家，其中，中国年养殖产量达到6万t，占世界养殖产量的80％，苗种的年需求量约为1.2亿尾(FEAP，2016；国家鲆鲽类产业技术体系年度报告，2015)。与牙鲆和半滑舌鳎等鲆鲽类一样，大菱鲆雌雄生长速度差异显著，全同胞苗种同池养殖2年后雌鱼的体重是雄鱼的1.8倍(Imsland et al.,1997，Aquaculture Research,28:101–114)，与雌雄混群的苗种相比，全雌苗种的养殖可以提高生产效率40％以上，全雌苗种的制备技术因此成为许多大菱鲆养殖国家的研究热点。从20世纪90年代开始，英国、法国、西班牙和我国等先后立项对大菱鲆全雌苗种生产技术进行研究，但到目前为止，还没有成功的报道。Martínez等2014年(Front Genet.2014；5:340.doi:10.3389/fgene.2014.00340)和MariBaroiller&D’Cotta 2016年(Sex Dev 10:242-266,2016)提出一条通过激素诱导和测交筛选相结合的方法制备大菱鲆超亲鱼，然后利用超雌鱼与普通雄鱼交配规模化生产全雌苗种的技术路线，也因为制种周期长和成本高至今还没有得到完整实施。

发明内容

[0003] 本发明公布了一种大菱鲆ZW全雌苗种的制种方法，以解决目前大菱鲆养殖产业缺乏全雌苗种的难题。

[0004] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0005] 一种大菱鲆ZW全雌苗种的制种方法，它包括如下步骤：(1)采用遗传失活鱼类异源精子诱导有丝分裂雌核发育的方法获得大菱鲆有丝分裂雌核发育卵；(2)对所获有丝分裂雌核发育卵进行孵化和苗种培育，得到有丝分裂雌核发育苗种；(3)将所获有丝分裂雌核发育苗种养殖成为有丝分裂雌核发育后备亲鱼；(4)对有丝分裂雌核发育后备亲鱼进行促熟培育和产卵调控，能够正常成熟和采卵的雌鱼即为超雌亲鱼；(5)对大菱鲆WW超雌亲鱼和正常ZZ雄鱼分别进行产卵调控，采集卵子和精液进行人工授精，获得遗传型全部是ZW的受精卵；(6)对ZW受精卵进行孵化和苗种培育，获得规模化的大菱鲆全雌苗种。选择步骤(1)所述遗传失活鱼类异源精子的标准：1)遗传失活后与大菱鲆卵人工授精的受精率高于70％，保证有较高的诱导效率；2)杂种仔鱼不能成活，保证即使精子的遗传失活处理失败，所形成的杂种胚胎也不能培育出苗种，节省了后续苗种筛选工序。

[0006] 进一步，所述的遗传失活鱼类异源精子为真鲷冷冻精子；真鲷冷冻精子遗传失活处理：将解冻后的真鲷精液用4℃预冷的Hank’s液稀释至原始精液的20倍，用剂量为6480～7200erg mm-2的紫外线将真鲷精子遗传物质灭活，取灭活后的真鲷精液与大菱鲆卵子按1:
20-30比例进行授精。

[0007] 进一步，步骤(1)中遗传失活鱼类异源精子与大菱鲆卵子受精后85-90min，将受精卵置于静水压机的压力舱中，在75MPa压力强度下进行休克处理，持续处理6min后泄压，取出受精卵，置于孵化器中继续孵化；压力处理过程中海水温度14.5±0.5℃。

[0008] 进一步，步骤(2)和步骤(6)所述的苗种培育，在大菱鲆苗种全长20-50mm期间，培育水温严格控制在18±0.5℃，以便抑制苗种性别表型雄性化。

[0009] 进一步，步骤(3)中有丝分裂雌核发育后备亲鱼培育方法为大菱鲆有丝分裂雌核发育苗种全长达到100mm后，逐尾采用PIT和荧光双重标记后，与普通健康苗种同池混养。

[0010] 上述有丝分裂雌核发育后备亲鱼生长速度慢，人工养殖条件下，普通雌鱼3龄就能达到性成熟，而有丝分裂雌核发育雌鱼成熟年龄比普通雌鱼晚1年，至少需要达到4龄才能达到性成熟。

[0011] 进一步，步骤(4)所述对有丝分裂雌核发育后备亲鱼进行促熟培育和产卵调控，具体方法为雌核发育后备亲鱼年龄达到4龄以后，预定产卵期前3个月，开始进行促熟和产卵调控，控制条件为光照强度300-500lx，光照周期16h光照：8h黑暗，水温13±0.5℃。经过3个月的促熟和产卵调控培育，部分雌核发育雌鱼达到性成熟，将发育成熟和可以产卵的雌鱼挑选出来，就是超雌亲鱼，可以直接用于大菱鲆全雌苗种的商业化生产。

[0012] 进一步，步骤(5)大菱鲆WW超雌亲鱼和正常ZZ亲鱼进行产卵调控的时候，由于超雌鱼的成熟比普通雌鱼晚一个月，因此为保持超雌鱼和普通ZZ雄鱼同步成熟，ZZ普通雄鱼开始进行繁殖调控的时间要比超雌亲鱼推迟一个月。

[0013] 本发明与现有技术相比的有益效果：

[0014] (1)WW超雌鱼不是一个自然存在的基因型，目前尚未发现有关拥有该种性别决定机制的鱼类WW雌鱼可以成活和繁殖的报道。本发明证明了大菱鲆WW鱼可以成活和繁殖，为利用超雌鱼进行规模化生产全雌苗种奠定了基础。

[0015] (2)本发明对有丝分裂雌核发育苗种与普通健康苗种进行同池混养的方法，是因为严重近交，大菱鲆有丝分裂雌核发育苗种成活率低、体质弱，单独长期养殖，会因苗种数量较少，养殖水槽面积小了环境不稳定，面积大了会因密度太小难于管理，标记后与普通健康苗种混养，这样既可以保证养殖环境的相对稳定，同时又方便了投喂和换水等正常管理，可以提高雌核发育苗种的养殖成活率。

[0016] (3)Martínez等2014年、Baroiller&D'Cotta 2016年提出一条通过激素诱导和测交筛选相结合的方法制备大菱鲆超亲鱼，然后利用超雌鱼与普通雄鱼交配规模化生产全雌苗种的技术路线，该技术路线包括两代亲鱼培育和两次测交筛选，从开始制种到获得可以成熟繁殖的超雌亲鱼，时间至少需要8年时间(两代亲鱼培育分别需要4年时间：亲鱼成熟3年+测交筛选1年，2代亲鱼培育和测交合计8年)，工作量上制备10尾WW雌鱼至少需要建立32个测交家系(2个ZW/ZZ雄鱼+30个ZW/WW雌鱼)。本发明提出的超雌鱼制种技术，从相同的起点开始，最多只需5年时间，而且中间不需要任何激素诱导处理和测交验证，大幅度地缩短了制种周期和降低了制种成本。

[0017] (4)大菱鲆是全球性养殖鱼类，其中，中国大菱鲆年养殖产量达到6万t，苗种的年求量约为1.2亿尾。本发明实现了全雌苗种的规模化生产，可以提高大菱鲆养殖效率40％以上，可以极大地促进我国大菱鲆养殖产业的发展，同时使我国的大菱鲆全雌苗种生产研究处于世界领先水平。

附图说明

[0018] 图1为本发明的大菱鲆ZW全雌苗种制种技术路线。

具体实施方式

[0019] 以下结合图1具体说明大菱鲆ZW全雌苗种制种方法，具体按以下步骤实施，其中没有交代的技术细节为本领域的普通技术常识：

[0020] 实施例1

[0021] (一)采用遗传失活鱼类异源精子诱导有丝分裂雌核发育的方法获得大菱鲆有丝分裂雌核发育卵。

[0022] (1)鱼卵采集：人工养殖大菱鲆亲鱼经过2个月左右的光温调控促熟培育后，性腺开始发育成熟，采用挤卵的方法定期对排卵亲鱼进行人工采卵，从获得的卵子中选择卵质好、每尾单次排卵量超过250mL的卵，置于干燥洁净的器皿内，于14.5±0.5的室温下避光保存备用。

[0023] (2)真鲷冷冻精子遗传失活处理：装有真鲷冷冻精液的冻存管从液氮中取出后，采用快速水浴解冻(水温37-40℃)，解冻过程中轻轻摇动冷存管，至冷存管中样品溶解，取出。用4℃预冷的Hank’s保护液将解冻后的精液稀释至原始精液浓度的20倍(原始精液:保护液＝1:19)。取稀释后的精液20μL置于干净的载玻片上，用吸管滴加2滴海水，镜检精子活力，取同一视野下快速直线运动精子比例高于70％的稀释精液备用。将稀释的真鲷精液平铺在直径12-15cm的细胞培养皿中(厚度0.4mm)，采用紫外交联仪(型号SCIENT Z03-Ⅱ，宁波新芝生物科技有限公司)进行照射处理，照射剂量为7200erg·mm-2，照射后的精液迅速避光转移至干燥洁净的黑色玻璃杯中，镜检精子活力，并于4℃避光保存备用。

[0024] (3)人工授精：灭活精液与卵子体积比按1:20-30比例混合均匀，添加精卵体积2倍体积的新鲜海水进行授精，受精后2min，加入5倍体积的新鲜海水静置，受精后7-10min，以160目网袋收集上浮卵并用10-20倍体积新鲜海水冲洗受精卵，将网袋置于微流水的孵化缸中孵化。新鲜海水盐度28‰-32‰，受精和孵化水温保持在14.5±0.5℃。

[0025] (4)静水压处理：受精后85-90min，将受精卵置于静水压机的压力舱中，在75MPa压力强度下进行休克处理，持续处理6min中后泄压，取出受精卵，置于孵化器中继续孵化。压力处理过程中海水温度14.5±0.5℃。

[0026] (二)对所获有丝分裂雌核发育卵进行孵化和苗种培育，得到有丝分裂雌核发育苗种。

[0027] (1)雌核发育卵的孵化：静水压处理完毕后将鱼卵取出放入14.5±0.5℃的海水中流水孵化。

[0028] (2)苗种培育：雌核发育初孵仔鱼布池时水温与孵化水温相同(13-15℃)，每天升温1℃，水温上升至18℃时停止，以后整个苗种培育过程直至苗种全长达到50mm以前，苗种培育水温严格控制在18±0.5℃。苗种培育其他操作为大菱鲆苗种培育常规操作。

[0029] 表1为大菱鲆有丝分裂雌核发育诱导和苗种培育结果。其中，遗传失活的真鲷精液与大菱鲆卵的受精率为84.6％，孵化后1-40日龄的成活率为2.46％，40-60日龄的成活率为51.1％。最终获得150日龄有丝分裂雌核发育苗种94尾，其中雌鱼47尾。

[0030] 表1大菱鲆有丝分裂型雌核发育诱导和苗种培育结果

[0031]

[0032] (三)将所获有丝分裂雌核发育苗种养殖成为有丝分裂雌核发育后备亲鱼。

[0033] 雌核发育苗种全长超过100mm后，分别用荧光和PIT双重标记对雌核发育苗种进行标记，其中，荧光标记选择红色荧光，标记位置选择大菱鲆下颌部肌肉，注射剂量10μL/尾，PIT标记选择规格为1.4mm×8mm的小型电子芯片，注射到大菱鲆背鳍最高点下方肌肉中，以PIT射频扫码仪扫描，记录个体编号。标记后的大菱鲆有丝分裂型雌核发育幼鱼放入原养殖池中暂养1周时间，检查荧光标记是否脱落、PIT标记能否正常读取，对于荧光标记脱落或者PIT标记无法读取的个体，重新进行标记，确保每尾苗种均保有双重标记，这样，有丝分裂雌核发育幼鱼与普通苗种可通过荧光标记直观的区分，有丝分裂雌核发育幼鱼个体间则可以通过PIT标记逐尾区分。

[0034] 标记后的94尾雌核发育幼鱼与200尾同规格的普通健康苗种同池养殖，养殖水槽的面积为16m2，此后按照正常的养殖方法，将雌核发育幼鱼培育成大菱鲆后备亲鱼，1龄后，随鱼个体增加，将雌核发育苗种和普通苗种分池培育。

[0035] (四)对有丝分裂雌核发育后备亲鱼进行促熟培育和产卵调控，能够正常成熟和采卵的雌鱼即为超雌亲鱼。

[0036] 有丝分裂雌核发育后备亲鱼达4龄后进行产卵调控，调控的条件为光照强度500-800lx，光周期16h光照:8h黑暗，温度13±0.5℃，经3个月光温调控，将卵巢发育成熟且可以进行采卵操作的有丝分裂雌核发育亲鱼挑选出来，即为大菱鲆超雌亲鱼，可直接与普通ZZ雄鱼交配，生产大菱鲆全雌苗种。

[0037] (五)对大菱鲆WW超雌亲鱼和正常ZZ雄鱼分别进行产卵调控，采集卵子和精液进行人工授精，获得遗传型全部是ZW的受精卵；

[0038] (1)普通ZZ雄鱼繁殖调控：有丝分裂雌核发育亲鱼启动产卵调控一个月后，对用于受精的普通雄鱼开始进行繁殖调控，调控的条件为光照强度500-800lx，光周期16h光照:8h黑暗，温度13±0.5℃，经2个月光温调控后，普通ZZ雄鱼发育成熟并可以采集精液。

[0039] (2)超雌亲鱼卵的人工授精和孵化：超雌亲鱼卵和普通雄鱼的精液采用干法人工授精，授精时每尾超雌亲鱼的卵加入2尾普通雄鱼的精液，以羽毛或玻璃棒搅拌均匀后加入2倍卵量体积的新鲜海水，静止5分钟后将受精卵收集起来，用新鲜海水冲洗干净，置于孵化网箱中流水孵化，孵化水温13～15℃。

[0040] (六)对ZW受精卵进行孵化和苗种培育，获得规模化的大菱鲆全雌苗种。

[0041] ZW受精卵孵化后初孵仔鱼布池时水温与孵化水温相同(13～15℃)，5d内将水温缓慢升至18℃，苗种规格达到20～50mm期间，苗种培育水温严格控制水温在18±0.5℃。

[0042] (七)对照组构建：选取性腺发育成熟的普通雌鱼与雄鱼，按照ZW苗种的培育方法，建立对照组家系。

[0043] (八)对照组和ZW苗种的性别鉴定：对照组和ZW苗种规格达到150mm以上，随机选取60尾苗种，麻醉后通过解剖和肉眼观察的方法鉴定苗种性别。此时，大菱鲆幼鱼卵巢为左右对称的囊状结构，呈倒戟状且中部向后突出；精巢位于膀胱表面，左右两侧各有1条白色细带状结构，很容易用肉眼区分。

[0044] 重复上述方法，本实施例重复构建3个ZW苗种和2个对照组家系，并跟踪检测各家系苗种性别比例。结果表明，对照组2个家系的雌性比例分别为65％和40％，3个ZW全雌苗种家系的雌性比例均为100％，结果如表2所示。

[0045] 表2大菱鲆全雌苗种生产结果

[0046]

[0047] 至此建立了大菱鲆ZW全雌苗种的制种技术。