一种协同抗胰腺癌的药物组合物

摘要

本发明提供了一种协同抗胰腺癌的药物组合物。该药物包含活性成分和药物学上可接受的辅料，其特征在于，所述的活性成分包含吉西他滨和三萜化合物，所述的三萜化合物为3α，11α‑二羟基‑羽扇豆‑20(29)‑烯‑28‑酸或3α‑羟基‑羽扇豆‑20(29)‑烯‑23，28‑二酸。对胰腺癌细胞生长状态、细胞生长抑制百分率、细胞周期和凋亡的影响等各方面判断联合用药对胰腺癌细胞产生的协同作用。因吉西他滨的耐药性，联合用药不仅提供更多用药安全性，而且降低了吉西他滨的临床使用剂量，减少大剂量使用吉西他滨所产生的毒副作用，提高临床治疗安全指数，为吉西他滨临床应用提供了更多的可能性。

权利要求

1.一种协同抗胰腺癌的药物组合物，该药物包含活性成分和药物学上可接受的辅料，其特征在于，所述的活性成分包含吉西他滨和三萜化合物，所述的三萜化合物为3α，11α-二羟基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸或3α-羟基-羽扇豆-20(29)-烯-23，28-二酸；所述的三萜化合物和吉西他滨的摩尔比为（100 4550）：（1 10）。

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2.根据权利要求1中所述协同胰腺癌的药物组合物，其特征在于，所述的三萜化合物和吉西他滨的摩尔比为（300 1500）：（1.5 8）。

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3.根据权利要求2中所述协同抗胰腺癌的药物组合物，其特征在于，所述的三萜化合物和吉西他滨的摩尔比为170：1。

4.根据权利要求1中所述协同抗胰腺癌的药物组合物，其特征在于，所述的抗胰腺癌的药物组合物为口服制剂。

5.根据权利要求4中所述协同抗胰腺癌的药物组合物，其特征在于，所述的口服制剂为胶囊剂、片剂或颗粒剂。

6.权利要求1-5任一项所述药物组合物在制备抗胰腺癌细胞药物中的应用。

说明书

一种协同抗胰腺癌的药物组合物

技术领域

[0001] 本发明属于联合药物技术领域，更具体地，涉及一种协同抗前列腺癌的药物组合物。

背景技术

[0002] 胰腺癌是常见的致死率极高的消化道恶性肿瘤，全世界每年约有22万人死于此病，其发病率和死亡率近年来明显上升。在我国，胰腺癌的年发病率约为5.1例/10万人，每年新增约5-6万例。其死亡率亦迅速升高，占恶性肿瘤死因的第7-8位。为进一步提高吉西他滨治疗晚期胰腺癌的效果，许多药物与吉西他滨联合治疗晚期胰腺癌，包括顺铂、卡培他滨、多西紫杉醇等。虽然联合化疗的有效率得到一定提高，肿瘤相关症状也有一定的改善，但上述药物与吉西他滨联合的大规模随机临床研究都未能显示出比吉西他滨单药具有更好的生存获益，胰腺癌的化疗走到了一个平台期，如何实现治疗效果上的突破是国内外肿瘤界面临的一个严峻挑战。

[0003] 吉西他滨是美国FDA批准的治疗胰腺癌的一线药物，它能明显改善胰腺癌患者的生活质量并延长生存期，被誉为胰腺癌治疗的金标准。同时吉西他滨也越来越多地被用作手术切除患者的辅助治疗药物。吉西他滨是一种脱氧核苷类似物类的前体药，需要细胞吸收后经过相关酶的代谢产生其活性代谢产物来发挥抗肿瘤活性。吉西他滨的活性代谢产物主要通过干扰DNA复制，造成DNA损伤并阻滞细胞周期进程，从而抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡发生。但是，在临床治疗中，很多的胰腺癌患者对吉西他滨有先天的或者后天获得的化疗抗性，限制了吉西他滨在临床上的应用效果。因此，患者对化疗药物产生耐药性也是胰腺癌难以治愈的一个重要原因。基于上述原因，找到更有效的胰腺癌治疗具有重要性和迫切性。

发明内容

[0004] 本发明的目的是为了克服现有技术的缺陷，提供一种协同抗胰腺癌的药物组合物。该药物组合物通过将簕菜中两个三萜化合物分别和吉西他滨进行联合用药，以胰腺癌中的Pcan-1细胞作为研究对象，该药物组合物对胰腺癌细胞的增值迁移，侵袭等具有显著的抑制作用，有望获得较为安全可靠的新型治疗治疗胰腺癌的候选药物。

[0005] 本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

[0006] 一种协同抗胰腺癌的药物组合物，该药物包含活性成分和药物学上可接受的辅料，所述的活性成分包含吉西他滨和三萜化合物，所述三萜化合物为3α，11α-二羟基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸(E12-1)或3α-羟基-羽扇豆-20(29)-烯-23，28-二酸(E13-1)。

[0007] 优选地，所述的三萜化合物和吉西他滨的摩尔比为(100～4550)∶(1～10)。

[0008] 进一步优选，所述的三萜化合物和吉西他滨的摩尔比为(300～1500)∶(1.5～8)。

[0009] 更为优选地，所述的三萜化合物和吉西他滨的摩尔比为170∶1。

[0010] 优选地，所述的胰腺癌的药物组合物为口服制剂。

[0011] 更为优选地，所述的口服制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂或液剂。

[0012] 上所述药物组合物在制备抗癌细胞药物中的应用。

[0013] 优选地，所述癌细胞为胰腺癌细胞。

[0014] 本发明的药物组合物依靠所述的三萜化合物和吉西他滨作为活性成分发挥抗胰腺癌的协同作用，发明人通过大量试验对这三种组分的用量比进行了筛选，结果是所述三萜化合物和吉西他滨的摩尔比在(100～4550)∶(1～10)的范围内时，其抗胰腺癌的增值效果较好：为了降低吉西他滨的毒副作用以及耐药性，本发明减少了该药物的用量，因此在本发明最优选的体外实施例中，3α，11α-二羟基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸(E12-1)与吉西他滨的摩尔比为170∶1。

[0015] 在本发明的实施例中，所述抗胰腺癌的药物组合物中含有的三萜化合物和吉西他滨均可以通过肠道以较快的速度吸收并发挥生物活性，因此本发明的药物组合物优选为口服制剂。药物单位制剂可以是常规的制剂工艺制成的药物学上可接受的任意常规口服制剂，如胶囊剂、片剂、颗粒剂或液剂，为使上述制剂型能够实现，需在制备的过程中加入药学上可接受的辅料，所述药物学上可接受的辅料为填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂或甜味剂。在本发明的实施例中用到填充剂为淀粉、乳糖、微晶纤维素或蔗糖中的一种，也可以使用上述填充剂的任意混合物；使用的崩解剂为淀粉、羧甲基淀粉钠或预胶化淀粉中的一种，也可使用其他已知的崩解剂如低取代羟丙纤维素或交联羧甲基纤维素钠，还可以使用上述崩解剂的任意混合物，使用的润滑剂为硬脂酸镁或二氧化硅，也可使用其他已知的中的润滑剂如十二烷基硫酸钠，还可以使用上述润滑剂的任意混合物；所述助悬剂为聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖或羟丙基甲基纤维素中的一种以上；所述粘合剂为羟丙基甲基纤维素、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮中的一种以上；所述甜味剂为糖精钠、甘草次酸、蔗糖、阿斯帕坦或甜蜜素中的一种以上。

[0016] 本发明以胰腺癌中的Pcan-1细胞作为研究对象，通过将三萜化合物E12-1和E13-1分别与吉西他滨进行联合用药，对Pcan-1细胞进行体外抗癌活性测试。结果表明，簕菜中三萜化合物E12-1和E13-1分别与吉西他滨的联合使用对胰腺癌细胞的生长状态、细胞生长抑制百分率、细胞周期和凋亡的影响。本发明因吉西他滨是疗胰腺癌的标准一线化疗药物，但易发生耐药现象，凋亡抑制是吉西他滨产生耐药的重要原因之一。研究发现Bcl家族相关蛋白在调控胰腺癌细胞凋亡中起到关键作用，抑制Bcl-2可增强肿瘤细胞对化疗药物敏感性。因而，发明以体外培养的人胰腺癌细胞从整体水平上探讨吉西他滨和簕菜中三萜类化合物的抑制作用及可能机制，旨在为吉西他滨联合3α,11α-二羟基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸(E12-1)和3α-羟基-羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸(E13-1)临床治疗胰腺癌提供理论和实验依据。

[0017] 本发明三萜化合物E12-1和E13-1是簕菜的分离提取物。簕菜，学名为白簕(Acanthopanax trifoliatus(Linn.)Merr.)，又称鹅掌簕、三叶五加、三加皮、苦刺、刺三加，为五加科(Araliaceae)五加属(Acanthopanax)的一种攀援状灌木。簕菜是药食同源植物，我国资料对其早有记载，李时珍曰：“五加治风湿痪库，壮筋骨，其功良深”；明代《食物本草》中记载“五加，叶作蔬食，去皮肤风湿”《；广东药用植物简编》记载“其根、茎叶均可入药，根，祛风除湿、消瘀止痛；叶，疏风，消肿，止痒，有舒筋活血、消肿解毒之功效”。簕菜全株均可入药,味苦、辛、凉，具有清热解毒、祛风利湿、舒筋活、止咳平喘之功效。有文献报导，簕菜中含有白簕中含有黄酮、皂苷、香豆素、多糖、强心苷等药用成分。

[0018] 发明人经过长期的研究，对簕菜进行了很多基础研究，从簕菜中分离出多种活性较强的化合物，研究其抗氧化能力，抗癌活性，抗炎活性等等。本研究从簕菜中分离到两个三萜类化合物3α,11α-二羟基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸和3α-羟基-羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸(如图1所示)，并且对其进行了基础活性的测试，结果表明，此类化合物具有抗肿瘤，抗炎，抑制α-葡萄糖苷酶(专利CN104922173A)等作用。

[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0020] 1.本发明通过将从簕菜中分离出的两个活性较强的三萜类化合物E12-1和E13-1分别与抗胰腺癌一线临床药物吉西他滨进行联合用药，对胰腺癌细胞生长状态、细胞生长抑制百分率、细胞周期和凋亡的影响等各方面判断联合用药对胰腺癌细胞产生的协同作用。本发明中E12-1，E13-1和吉西他滨细胞的生存率分别为80.3％，75.5％和77.9％。而当E12-1和E13-1分别与吉西他滨药物联用后，Pcan-1细胞的生存率分别仅为49.7％和44.2％。细胞生存率通过药物联合后下降了31％-36％左右。由此说明在同等浓度下联合用药可以更有效的抑制Pcan-1细胞的生长，发生了协同增效的作用。

[0021] 2.本发明中三萜化合物E12-1，E13-1分别与吉西他滨联用诱导凋亡相关基因Bcl-2、IL-6、NF-κB和P-State3等蛋白表达量的变化，发现三萜化合物E12-1和E13-1可增强吉西他滨杀伤胰腺癌细胞。

[0022] 3.本发明三萜化合物E12-1，E13-1分别与吉西他滨联用的药物组合物，不仅提供更多用药安全性，而且降低了吉西他滨的临床使用剂量，减少大剂量使用吉西他滨所产生的毒副作用，提高临床治疗安全指数，降低吉西他滨的耐药性。为吉西他滨临床应用提供了更多的可能性。

[0023] 4.本发明三萜化合物E12-1，E13-1分别与吉西他滨联用的药物组合物与传统的单药治疗相比，细胞凋亡率大幅度提高，分别为44.3％和48.2％。说明药物联用促进细胞凋亡的作用比单药给药的效果提高，使细胞凋亡增加了21％-26％。进一步说明，药物联用的效果强于单药给药。可同时靶向多种重要信号通路、克服肿瘤耐药、降低毒副作用等。

附图说明

[0024] 图1是3α,11α-二羟基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸(E12-1)(a)，3α-羟基-羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸(E13-1)(b)和吉西他滨(c)的化学结构式。

[0025] 图2是三萜化合物E12-1、E13-1和吉西他滨对Pcan-1细胞生长的影响。

[0026] 图3是三萜化合物E12-1、E13-1和吉西他滨被PI染色代表性的显微照片。

[0027] 图4是三萜化合物E12-1、E13-1和吉西他滨对Pcan-1细胞处理后凋亡细胞形态学比率。

[0028] 图5是三萜化合物E12-1和吉西他滨对Pcan-1细胞处理后0h，5h和24h细胞划痕愈合细胞形态显微照片。

[0029] 图6是三萜化合物E13-1和吉西他滨对Pcan-1细胞处理后0h，5h和24h细胞划痕愈合细胞形态显微照片。

[0030] 图7是三萜化合物E12-1和E13-1分别与吉西他滨对Pcan-1细胞处理后三萜化合物和吉西他滨对Pcan-1细胞处理后迁移结果。

[0031] 图8是三萜化合物E12-1和E13-1分别与吉西他滨对Pcan-1细胞中相关信号通路和凋亡蛋白表达的影响。

具体实施方式

[0032] 下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0033] 在下面实施例中所采用的实验仪器有Thermo Scientific Series 8000 CO2培养箱(美国Thermo公司)；Class IIA/B3水平流净化工作台(美国Thermo公司)；MDF-382E超低温冰箱(日本Sanyo公司)；CPKR高速离心机(美国Beckman Coulter公司)；Allegra X-22R冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)；Locator 4型液氮罐(美国Thermo公司)；Hotpack型高温消毒柜(美国Thermo公司)；移液枪(德国Eppendorf公司)；Nikon Optiphot光学显微镜(日本Nikon公司)；Nikon Eclipse TE200荧光显微镜(日本Nikon公司)；Nikon EFD-3显微镜(日本Nikon公司)；Infinite M200PRO多功能酶标仪(奥地利TECAN公司)；Sirius单管式化学发光检测仪(德国Berthold Detection Systems公司)；ChemiDocTMXRS Imager成像系统(美国Bio-Rad公司)。

[0034] 所采用的实验试剂有DMEM培养基(美国Gibco公司)：将DMEM干粉(1L用)溶于约800mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解，加入青霉素和链霉素混合液(终浓度：青霉素100units/mL，链霉素100μg/mL)，加入2g碳酸钠，定容至1000mL。然后加入10％胎牛血清，过滤除菌后分装到无菌血清瓶中，4℃保存备用。胎牛血清(FBS)(美国Serum Source International公司)；胰蛋白酶-EDTA溶液(1×)(美国Sigma-Aldrich公司)；0.4％台盼蓝溶液(美国Cambrex Bio Science公司)；蛋白测定试剂盒(美国Bio-Rad公司)；荧光素酶检测试剂盒(美国Promega公司)；SuperSignal West Femto最高灵敏度化学发光底物(美国Thermo公司)；
MTT、PI、DMSO(美国Sigma-Aldrich公司)；一抗：β-actin，p-STAT3，IL-6，Bcl-2，Cox-2(美国Cell Signaling公司)；HRP标记的抗IgG二抗(美国Santa Cruz公司)；其他试剂均为美国Sigma公司分析纯以上等级。

[0035] 实施例1

[0036] 一种协同抗胰腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E12-1200份，吉西他滨1份，微晶纤维素600份，充分混匀后，灌装1号胶囊100粒。

[0037] 实施例2

[0038] 一种协同抗胰腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E12-11000份，吉西他滨10份，微晶纤维素300份，充分混匀后，灌装1号胶囊100粒。

[0039] 实施例3

[0040] 一种协同抗胰腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E13-1600份，吉西他滨1份，乳糖650份，混合均匀后，加入300份淀粉制成的10％的淀粉浆，进行喷雾制粒。再加入硬脂酸镁100份和PVP 130份，混合均匀后，压片制成500片。

[0041] 实施例4

[0042] 一种协同抗胰腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E13-1100份，吉西他滨1份，乳糖350份，混合均匀后，加入800份淀粉制成的10％的淀粉浆，进行喷雾制粒。再加入硬脂酸镁60份和PVP 80份，混合均匀后，压片制成500片。

[0043] 实施例5

[0044] 一种协同抗胰腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E12-1300份，吉西他滨1份，淀粉300份，羧甲基纤维素250份，真空干燥，混合均匀，过100目筛，制成颗粒剂。

[0045] 实施例6

[0046] 一种协同抗胰腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E12-1340份，吉西他滨2份，淀粉350份，羧甲基纤维素250份，真空干燥，混合均匀，过80目筛，制成颗粒剂。

[0047] 实施例7

[0048] 一种协同抗胰腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E13-14550份，吉西他滨1份，二氧化硅700份，淀粉浆280份，蔗糖460份，混匀，直至均匀的液体，过滤灭菌，分装，制成口服液。

[0049] 实施例8

[0050] 一种协同抗胰腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E13-1455份，吉西他滨1份，二氧化硅450份，淀粉浆90份，蔗糖500份，混匀，直至均匀的液体，过滤灭菌，分装，制成口服液。

[0051] 实施例9

[0052] 一种协同抗胰腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E12-1300份，吉西他滨1.5份，羧甲基淀粉钠500份，预胶化淀粉750份，混匀，过120目筛，制粒，干燥，整粒，加入300份硬脂酸镁混合，压片制成200粒。

[0053] 实施例10

[0054] 一种协同抗胰腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E12-1300份，吉西他滨8份，羧甲基淀粉钠300份，预胶化淀粉500份，混匀，过60目筛，制粒，干燥，整粒，加入200份硬脂酸镁混合，压片制成200粒。

[0055] 实施例11

[0056] 一种协同抗胰腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E13-11500份，吉西他滨1.5份，预胶化淀粉250份，乳糖650份，混合均匀，制粒，干燥，加入二氧化硅320份作为润滑剂，再次混匀，过120目筛，填充，制成50粒胶囊。

[0057] 实施例12

[0058] 一种协同抗胰腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E13-1750份，吉西他滨4份，预胶化淀粉250份，乳糖130份，混合均匀，制粒，干燥，加入二氧化硅250份作为润滑剂，再次混匀，过60目筛，填充，制成50粒胶囊。

[0059] 上述实施例1-12中添加的药物学上可接受的辅料可有效防潮，同时也利于药物成型。

[0060] 实施例13MTT比色法

[0061] MTT是一种能接收H+的黄色染料。在活细胞线粒体呼吸链中，琥珀酸脱氢酶和细胞色素C可使MTT的四氮唑环开裂，生成蓝紫色的甲瓒结晶，而死细胞中不含这种脱氢酶。甲瓒结晶的生成量与活细胞数成正比，可通过检测甲瓒结晶的量来评价药物对细胞增殖的影响。Pcan-1细胞以接种浓度1×105个/mL的浓度接种于96孔板(100μL/孔)，同时设置空白调零孔(培养基铺板孔)和对照孔二甲基亚砜(DMSO)处理孔，5％CO2，37℃培养过夜，加入浓度梯度的化合物以及吉西他滨进行处理，每个样品设4个复孔，5％CO2，37℃孵育72h后小心吸出培养液，每孔加入100μL培养基配制的MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)；继续培养1h后，小心吸去孔内培养液。每孔加入100μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解；用酶标仪测量570nm处各孔的吸光值，用式(1)计算药物对细胞生长的抑制率，结果如表1所示。

[0062] 细胞生长抑制率(％)＝(1-A样品组/A对照组)×100％   式(1)

[0063] 表1三萜化合物和吉西他滨对Pcan-1细胞的增值抑制作用(MTT法)

[0064]   E12-1 E13-1 吉西他滨GemcitabineIC50 66.13±5.65μM 98.38±6.40μM 2.78±3.39μM

[0065] 采用MTT法测定了三萜类化合物3α,11α-二羟基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸(E12-1)和3α-羟基-羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸(E13-1)对Pcan-1细胞增殖的抑制活性。结果表明，所有的化合物具有较强的抑制胰腺癌细胞生长的活性，IC50分别为：66.13，98.38和
2.78μM。

[0066] 实施例14台盼蓝拒染法

[0067] 台盼蓝染色检测原理：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡，这与中性红作用相反。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。Pcan-1细胞以接种浓度0.2×105个/mL的浓度接种于直径35mm培养皿(2mL/培养皿)(6孔板，2mL/孔)，5％CO2，37℃培养过夜。加入溶解于二甲基亚砜(DMSO)中的高、中、低浓度的化合物以及吉西他滨，并且将其进行联合给药，对Pcan-1细胞进行处理72h后，使用台盼蓝染色的方法测定化合物对细胞生长和死亡的影响。具体方法为：使用胰酶消化贴壁生长的细胞，将80μL细胞悬液与20μL 0.4％的台盼蓝溶液均匀混合，静置2min后，使用显微镜观察和计数。视野下，光亮透明细胞计为活细胞，台盼蓝染为蓝色细胞计为死细胞。每次实验二甲基亚砜浓度不超过0.1％。结果如表2所示。

[0068] 表2三萜化合物和吉西他滨对Pcan-1细胞存活率的影响

[0069]

[0070] 用台盼蓝拒染法测试了化合物E12-1，E13-1与吉西他滨对Pcan-1细胞的致死率，选择药物联用所需的浓度根据其IC50，选择细胞致死率约为20％时药物的浓度值，确定E12-1，E13-1所需浓度为10uM，35uM，吉西他滨浓度为0.2uM。确定给药浓度之后，对其进行药物联用。图2是三萜化合物和吉西他滨对Pcan-1细胞生长的影响。从图2可知，联合用药对Pcan-1细胞的致死率比单药给药的致死率效果好。单药时，E12-1，E13-1，吉西他滨细胞的生存率分别是80.3％，75.5％和77.9％。而药物联用后，Pcan-1细胞的生存率分别仅为
49.7％和44.2％。细胞生存率通过药物联合后下降了31％-36％左右。由此证明，在同等浓度下联合用药可以更有效的抑制Pcan-1细胞的生长，发生了协同增效的作用。

[0071] 实施例15细胞凋亡检测

[0072] 将台盼蓝拒染实验中联用化合物处理72h后的Pcan-1细胞悬浮液，用细胞离心涂片器制成细胞涂片，经丙酮/甲醇(1:1)溶液固定10min后，用碘化丙啶(PI)PBS溶液(10μg/mL)染色，使用荧光显微镜对其进行观察和形态分析，DNA呈红色荧光。细胞凋亡是由经典的形态特征确定，包括核固缩，细胞收缩，和凋亡小体的形成。观察时细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。每个样品于显微镜下随机观察数个视野，总共不少于200个细胞，计数每个视野(×200)中包含的凋亡细胞的百分比。

[0073] 实验通过单药和药物联用进行对比，对Pcan-1细胞进行72h处理后，经固定并通过PI染色后，使用荧光显微镜对其进行观察。图3是三萜化合物和吉西他滨被PI染色代表性的显微照片。其中，(A)为以DMSO为阳性对照，作用于细胞后被PI染色后的显微照片，(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分别为E12-1、E13-1和吉西他滨单药给药和联合用药后，细胞被PI染色后的显微照片。从图3可知，凋亡细胞细胞核呈红色(图3中灰色部分)致密浓染，或呈红色碎块状致密浓染，细胞核部分发生异变。联合药物的细胞凋亡情况较单药较为严重。图4是三萜化合物和吉西他滨对Pcan-1细胞处理后凋亡细胞形态学比率。从图4可知，单药时，E12-1、E13-1和吉西他滨细胞的凋亡率分别是25.4％，22.4％和24.3％。药物联合时，细胞凋亡率大幅度提高，E12-1，E13-1分别与吉西他滨联用，结果分别提高到44.3％和48.2％。结果说明，E12-1和E13-1分别与吉西他滨药物联用促进细胞凋亡的作用比单药给药的效果提高，使细胞凋亡增加了21％-26％。进一步说明，E12-1和E13-1分别与吉西他滨药物联用的效果强于单药给药。

[0074] 实施例16细胞迁移实验

[0075] Pcan-1细胞以接种浓度4×106个/mL的浓度接种于直径35mm培养皿(2mL/培养皿)(6孔板，2mL/孔)，5％CO2，37℃培养36-48h。观察培养皿的细胞融合度达到90％-100％时，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，加入溶解于DMSO中的化合物以及吉西他滨，并且将其进行联合给药，对Pcan-1细胞进行处理后，观察0h，5h和24h时，细胞的愈合情况。具体方法为：用微量枪头在培养皿中细胞生长的中央区域划线，确保划线部位粗细均匀，用PBS洗两遍细胞，去除中央部分的细胞和部分漂浮细胞，换成无血清培养基对细胞进行继续培养，根据设定好的药物浓度加入培养基中。在药物加入后，分别于0h，5h和24h时，观察并拍照，记录下细胞形态和其迁移情况。

[0076] 采用细胞划痕实验，可以测定E12-1和E13-1分别与吉西他滨药物对Pcan-1细胞的愈合能力以及细胞运动的形态，实验通过单药和药物联用进行对比，使Pcan-1细胞生长融合到90％-100％后，对其进行划痕处理。图5和6分别是三萜化合物E12-1和E13-1分别与吉西他滨联合后对Pcan-1细胞处理后0h，5h和24h细胞划痕愈合细胞形态显微照片。由图5和图6通过不同时间段的跟踪观察，细胞的形态与其愈合程度，分析药物对细胞的愈合能力。结果表明，随着细胞生长时间的增加，被划伤的细胞逐渐恢复原来的形态，一些不能恢复的细胞不断死去，细胞的愈合程度不断增强，划痕面积逐渐变小。但是联合用药组的细胞，愈合能力明显比单药给药的愈合能力弱。图7是三萜化合物E12-1和E13-1分别与吉西他滨对Pcan-1细胞处理后三萜化合物和吉西他滨对Pcan-1细胞处理后迁移结果。从图7可知，E12-
1和E13-1分别与吉西他滨药物联合后对Pcan-1细胞的愈合能力明显低于单药给药，其愈合能力较单药给药降低了20％-35％左右。即药物联用的效果更能使细胞无法正常生长。

[0077] 实施例17免疫印迹法

[0078] 蛋白质印迹法(免疫印迹法)，是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

[0079] 1.细胞全蛋白提取：Pcan-1细胞以1×105个/mL的密度接种在100mm培养皿中，37℃培养24h。然后加入溶解于DMSO中的化合物以及吉西他滨，并且将其进行联合给药处理24h，DMSO为对照处理组。然后吸弃所有溶液，使用冰浴的PBS清洗细胞后，然后加入200μLRIPA裂解缓冲液，完全裂解细胞，使用细胞刮棒将贴壁细胞从培养皿中刮取下来，收集细胞悬液，使用注射器针头反复吹打使细胞完全裂解，在4℃离心，取上清液待用。

[0080] 2.蛋白浓度测定：在1mL反应液A中加入20μL反应液S配制反应液A’；以PBS配制牛血清白蛋白BSA 16mg/mL，并依次用水稀释成0.1，0.2，0.4，0.8，1.6mg/mL系列BSA标准溶液；各取5μL蛋白样品(如果蛋白浓度过高，进行适当稀释)和BSA标准溶液于96孔板中，依次加入25μL反应液A’，200μL反应液B，混匀，室温振摇反应15min；于波长650nm处读取吸光度值，绘制标准曲线。根据标准曲线计算待测蛋白质样品浓度。

[0081] 取上清液5μL与25μL的底物混合后立即用Sirius单管式化学发光检测仪测定发光强度。每个样品设定3个复孔，每孔测定5次，取平均值。荧光素酶活性用发光强度与蛋白浓度的比值表示，并且换算为空白对照组(DMSO处理)的百分比表示。

[0082] 3.SDS-PAGE电泳：取上述蛋白样品30μg，加入2×蛋白电泳样品缓冲液，沸水浴5min，然后离心30s，置冰上备用；按说明书安装电泳装置；取出Minin-protean TGT预制胶梳子，清洗加样孔，放入电泳槽中，加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液；在上样孔中小心加入样品及标准蛋白分子量Marker；接通电源，100V，110min；电泳至上样缓冲液染料到达凝胶前沿约1cm处，停止电泳。

[0083] 4.免疫印迹试验：

[0084] (1)转膜：电泳结束后，截取适当大小的PVDF膜和2张滤纸，将PVDF膜先在甲醇中浸润10s，然后于去离子水中浸润2min，再同滤纸一同浸于转移缓冲液中，平衡10-15min，同时将凝胶浸于适量的转移缓冲液中，按照装置说明书装好夹子，按顺序：海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵，每层放好后，用试管赶去气泡，形成三明治结构。将转移槽置于冰浴中，放入三明治结构，加转移缓冲液，插上电极，恒流90V转膜90min。

[0085] (2)封闭：将转有蛋白的膜浸于5％BSA封闭液中封闭1h。用含0.05％Tween-20的Tris缓冲盐溶液(TBST)洗膜3次，每次5mim。

[0086] (3)杂交：取出已封闭的膜，然后置于相应的一抗溶液中，4℃过夜。Actin作为加样对照蛋白。用TBST洗膜4次，每次15mim。再置于HRP标记的通用抗IgG二抗(1：5000)稀释)溶液中，室温避光振摇l h。用TBST洗膜4次，每次15min。使用的SuperSignal West Femto试剂盒进行化学发光检测，Quantity One系统进行扫描。运用Image Studio Lite Ver 4.0软件进行分析。

[0087] 已有研究表明STAT3和NF-κB两条信号通路互相连通，它们可以共同调节一些与肿瘤及炎症相关的基因表达，如NF-κB，IL-6，P-State3和Bcl-2。因此，本发明通过Western blot方法对3α,11α-二羟基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸，3α-羟基-羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸和吉西他滨以及分别药物联用作用后Pcan-1细胞中相关凋亡蛋白的水平进行了检测。图8是三萜化合物E12-1和E13-1分别与吉西他滨对Pcan-1细胞中相关信号通路和凋亡蛋白表达的影响。结果表明，对于Bcl-2抗体，药物联用效果较强于单药给药，尤其是3α,11α-二羟基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸，色带颜色明显较浅，即Bcl-2表达明显降低。IL-6抗体，单药表达较高，而吉西他滨相对于三萜类化合物表达较低，而E12-1和E13-1分别与吉西他滨联用后IL-6表达较单药更低。NF-κB抗体，E12-1和E13-1分别与吉西他滨药物联用效果较强于单药给药，尤其是3α-羟基-羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸，即NF-κB表达明显降低。
P-state3抗体，色带的变化非常明显，药物联用效果明显强于单药给药，说明药物联用后，P-state3抗体表达降低很多。3α,11α-二羟基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸，3α-羟基-羽扇豆-
20(29)-烯-23,28-二酸分别和吉西他滨药物联用抑制作用越强，IL-6表达降低，P-tate3表达亦降低。说明E12-1和E13-1分别与吉西他滨的药物联用抑制Pcan-1细胞的生长可能的信号通路。间接说明NF-κB和P-state3之间存在相互影响，这两条信号传导通路之间存在交互关系，药物联用可以影响这两条信号传导通路。

[0088] 实施例18统计学分析

[0089] 对实验结果进行方差分析，结果用means±SD的形式表示。样品处理组与对照组间数据差异性分析均采用Student's t检验进行。P<0.05(*)和P<0.001(**)分别代表差异显著和差异极显著。

[0090] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。