一种聚乙二醇修饰的胰高血糖素样肽-1类似物

摘要

本发明提供一种聚乙二醇修饰的胰高血糖素样肽‑1类似物，所述胰高血糖素样肽‑1类似物具有SEQ ID NO:1‑19所示的氨基酸序列，而且所述氨基酸序列的半胱氨酸残基上修饰聚乙二醇基团。本发明还提供了所述类似物或其组合物在制备治疗糖尿病、肥胖、阿尔兹海默病的药物中的应用。本发明的多肽具有较好的代谢稳定性，体内半衰期显著延长，克服了天然GLP‑1半衰期短的问题，可大幅提高临床应用依从性，具有较好的应用价值。

权利要求

1.一种聚乙二醇修饰的胰高血糖素样肽-1类似物，其特征在于，所述胰高血糖素样肽-

1类似物的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 4、6-7、12、14所示的氨基酸序列之一，而且所述氨基酸序列的半胱氨酸残基上修饰聚乙二醇基团；

其中，所述聚乙二醇的分子量在20000-50000道尔顿之间。

2.如权利要求1所述的类似物，其特征在于，所述聚乙二醇为经修饰的聚乙二醇。

3.如权利要求2所述的类似物，其特征在于，所述聚乙二醇选自单甲氧基聚乙二醇、分枝聚乙二醇、分叉聚乙二醇。

4.如权利要求3所述的类似物，其特征在于，所述聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇。

5.如权利要求1-4中任一项所述的类似物，其特征在于，所述聚乙二醇基团经马来酰亚胺基活化。

6.一种组合物，其包含如权利要求1-5中任一项所述的类似物或其盐。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料。

8.如权利要求1-5中任一项所述的类似物，如权利要求6或7所述的组合物在制备治疗糖尿病、肥胖的药物中的应用。

说明书

一种聚乙二醇修饰的胰高血糖素样肽-1类似物

[0001] 本申请要求2016年4月6日提交的名称为“一种聚乙二醇修饰的胰高血糖素样肽-1类似物”，申请号为20161021111440的发明专利申请的优先权。

技术领域

[0002] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰的胰高血糖素样肽-1类似物及其医药用途。

背景技术

[0003] 胰高血糖素样肽1(GLP-1)是一种肠源性激素，主要在末端空场、回肠和结肠的L细胞合成，进餐反应中释放到循环。GLP-1(7-36,7-37)是体循环中GLP-1的主要活性形式，通过复杂的机制控制血糖，包括胰岛素和胰高血糖素的分泌，胃的排空以及外周胰岛素的调节。GLP-1(7-36,7-37)降血糖作用是葡萄糖依赖性的，可避免低血糖发生，而且具有抑制胰岛β-细胞的凋亡，促进胰岛β-细胞增生的作用，可逆转病情发展。但天然GLP-1的血浆半衰期仅为1-2分钟，代谢不稳定性限制其作为药物的应用。

[0004] 酶降解和肾清除是多肽类物质体内代谢的主要途径。研究表明，体内的二肽激肽酶(DPPIV)特异性识别并降解GLP-1结构中受体结合活性部位N端His-Ala片段而使其快速失活，同时其他蛋白水解酶如内肽酶等也参与多肽体内降解过程。肾脏在消除肽、蛋白等物质中起重要作用，血浆中分子量小于5KD并且有效半径小于 的游离部分分子易被肾小球滤过，而且在肾循环中肽类激素(如降钙素、GLP-1)被肾皮质中的代谢酶降解，进一步排泄到尿中。研究报道肾脏负责清除至少80％的Exendin-4(CN1372570)。

[0005] 提高代谢稳定性，延长血浆半衰期，从而提高临床用药依从性是基于GLP-1的药物开发领域的技术目标。现有的基于人源GLP-1序列的专利技术中针对酶降解关键位点的结构改造(CN00806548.9、CN99814187.9、CN200410017667.9等)只考虑了酶降解一个消除因素，达不到理想的长效；而通过在母体肽链结构中引入脂肪酰基团，提高与血浆蛋白结合力以避免多肽在体内快速清除(CN201210513145.2、CN200810124641.2、CN20118000352.1等)的技术虽可一定程度上延长半衰期(如已上市的利拉鲁肽每日给药一次)，其用药依从性仍有待提高，而且肽链中引入脂肪链溶解性降低，制剂中需使用有机溶剂，制剂难度加大。

[0006] 聚乙二醇(PEG)化技术是当前蛋白质/多肽类给药领域一项较适用的技术。通常采用线性直连或分枝状的聚乙二醇对蛋白质/多肽进行修饰，可以使蛋白质/多肽物理和化学性质稳定性得到提高，免疫原性显著下降，抗蛋白酶降解能力显著提高，随着聚乙二醇分子量的增加，能显著降低肾清除作用对药物的代谢，从而药物的体内半衰期显著延长，药物溶解度提高以及对细胞膜的穿透力增强。偶联的PEG链产生空间位阻效应，减少血浆蛋白水解酶的水解作用，从而有效延长了其在循环系统内的储留时间，使药物半衰期延长和系统药物暴露增加并提高疗效。

[0007] 现有专利技术(CN1372570A,CN101125207A等)公开了Exendin-4的聚乙二醇修饰技术，这些已有的技术虽然可以延长Exendin-4的体内半衰期，可达到长效化，但这些缀合物最终都是通过在体内释放游离Exendin-4产生药效，而Exendin-4本身的免疫原性带来的产生抗体(用药30周的人群中45％产生抗体)等耐药性仍无法解决。

发明内容

[0008] 针对现有技术的局限性，本发明提供一种聚乙二醇修饰的GLP-1类似物，其具有较长的体内半衰期和较好的降血糖活性，而且与内源性GLP-1(7-36/37)高度同源，可避免安全性风险。

[0009] 本发明人等在研究中发现对GLP-1(7-36,7-37)序列中易被酶降解的位点进行改构的同时在适当活性氨基酸残基上缀合适当分子量的聚乙二醇，可保持药效、有效延长体内半衰期，而且因改造序列与人源GLP-1高度同源(≥90％)可以避免产生抗体，溶解性好，便于制剂，有更好的应用潜力。

[0010] 本发明所述的胰高血糖素样肽-1类似物是GLP-1(7-36/37)的人工修饰形式。GLP-1(7-36/37)的天然序列为：HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR-NH2/G。本发明对该序列中X8或X9和X35进行适当的氨基酸替换以避免酶降解失活，为进一步提高多肽的稳定性，如不做特殊说明本发明实施方案中肽链的C-端一般是酰胺化的；同时在X30位点或C端延长序列X39位引入半胱氨酸残基，在该半胱氨酸残基上通过马来酰亚氨基活化修饰适当分子量的聚乙二醇基团，避免目标多肽在体内的快速消除。

[0011] 一方面，本发明提供了一种聚乙二醇修饰的胰高血糖素样肽-1类似物，所述胰高血糖素样肽-1类似物具有以下通式Ⅰ结构，而且在通式Ⅰ氨基酸序列中X3或X5单个位点上修饰有聚乙二醇基团：

[0012] 通式Ⅰ：HX1X2GTFTSDVSSYLEGQAAKEFIX3WLVKAibRX4X5X6

[0013] 优选地，本发明所述的聚乙二醇修饰的胰高血糖素样肽-1类似物，所述的通式Ⅰ结构的胰高血糖素样肽-1类似物氨基酸序列中位点X3或X5为半胱氨酸残基；

[0014] 优选地，本发明所述具有通式Ⅰ结构的胰高血糖素样肽-1类似物具有SEQ ID NO：1-19所示的氨基酸序列；

[0015] SEQ ID NO:1 H(d-A)EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFICWLVKAibRNH2

[0016] SEQ ID NO:2 H(d-A)EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFICWLVKAibRG

[0017] SEQ ID NO:3 H(d-A)EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibGCG

[0018] SEQ ID NO:4 H(d-A)EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibRGCA

[0019] SEQ ID NO:5 HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFICWLVKAibRNH2

[0020] SEQ ID NO:6 HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibRGCG

[0021] SEQ ID NO:7 HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibRGCA

[0022] SEQ ID NO:8 HAPGTFTSDVSSYLEGQAAKEFICWLVKAibRNH2

[0023] SEQ ID NO:9 HAPGTFTSDVSSYLEGQAAKEFICWLVKAibRG

[0024] SEQ ID NO:10 HAPGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibRGCG

[0025] SEQ ID NO:11 HAPGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibRGCA

[0026] SEQ ID NO:12 HAFGTFTSDVSSYLEGQAAKEFICWLVKAibRNH2

[0027] SEQ ID NO:13 HAFGTFTSDVSSYLEGQAAKEFICWLVKAibRG

[0028] SEQ ID NO:14 HAFGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibRGCG

[0029] SEQ ID NO:15 HAFGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibRGCA

[0030] SEQ ID NO:16 HAYGTFTSDVSSYLEGQAAKEFICWLVKAibRNH2

[0031] SEQ ID NO:17 HAYGTFTSDVSSYLEGQAAKEFICWLVKAibRG

[0032] SEQ ID NO:18 HAYGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibRGCG

[0033] SEQ ID NO:19 HAYGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibRGCA

[0034] 优选地，所述聚乙二醇修饰的胰高血糖素样肽-1类似物中聚乙二醇的分子量在20000-50000道尔顿之间；

[0035] 优选地，所述聚乙二醇选自经修饰的PEG；

[0036] 更优选地，所述聚乙二醇选自单甲氧基PEG、分枝PEG、分叉PEG。

[0037] 优选地，所述聚乙二醇基团是通过马来酰亚氨基活化；

[0038] 本发明所述的聚乙二醇是通过多种途径可以得到，包括商业途径获得或者根据本领域中已知的方法自行制备。不同分子量大小PEG修饰对多肽性质和生物活性都有影响。本发明优选PEG分子量范围在20000-50000道尔顿之间，包括20000和500000道尔顿。

[0039] 多肽的聚乙二醇修饰是通过马来酰亚胺基活化的聚乙二醇与半胱氨酸残基侧链上的巯基连接而实现的。马来酰亚胺基聚乙二醇可以通过市售途径获得或根据本领域公知技术自行制备。

[0040] 本发明的另一个目的是提供了一种组合物，所述组合物包含至少一种通式Ⅰ所表示的胰高血糖素样肽-1类似物的PEG修饰物。

[0041] 优选地，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂等辅料。

[0042] 优选地，本发明所述的组合物是由所述胰高血糖素样肽-1类似物与一种或多种药学上可接受的辅料组成。所述药用辅料包括水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水、渗透压调节剂等。

[0043] 优选地，所述水溶性填充剂包括但不限于甘露醇、低分子右旋糖酐、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等；所述pH调节剂包括但不限于枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸等有机或无机酸以及氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵、碳酸氢钾、碳酸氢钠、碳酸氢铵盐等生理上可接受的无机碱或盐；所述稳定剂包括但不限于EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物如HPC、HPC-SL、HPC-L或HPMC、环糊精、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等；所述渗透压调节剂包括但不限于氯化钠或氯化钾。

[0044] 本发明的再一个目的是提供了PEG修饰的通式Ⅰ所示胰高血糖素样肽-1类似物或其组合物在制备用于治疗糖尿病、肥胖、阿尔兹海默病的药物中的应用。

[0045] 优选地，本发明所述的组合物可以静脉、肌肉或皮下注射剂形式或口服、直肠、鼻腔给药。剂量范围可以为5μg-10mg/次，这取决于治疗对象、给药方式、适应症以及其他因素等。

[0046] 在本发明提供的具有通式Ⅰ结构的胰高血糖素样肽-1类似物是通过本领域公知的方法制备得到：

[0047] 1)通过常规固相或液相方法逐步或通过片段组装合成；

[0048] 2)在宿主细胞中表达编码多肽的核酸构建体，并从宿主细胞培养物回收表达产物；

[0049] 3)影响编码多肽的核酸构建体的无细胞体外表达，并回收表达产物；

[0050] 或通过方法1)、2)或3)的任意组合来获得肽片段，随后连接这些片段以获得目标肽。

[0051] 本发明提供的实施方案中优选地，使用Fmoc固相合成方法制备得到目标肽。

[0052] 本发明提供的具体实施方案中通过以下方法完成目标多肽的聚乙二醇化修饰：将经过活化的PEG与本发明的SEQ ID NO:1-19目标多肽在pH5.0-7.0,PEG与肽的摩尔比值为1-10，反应时间为0.5-12小时，反应温度为4-37℃。

[0053] 缀合反应之后，可以通过本领域公知的合适方法将目标产物分离。适用的方法包括但不限于超滤法、透析法或色谱法等。

[0054] 本发明的实施方案中采用db/db糖尿病小鼠模型评价了所述PEG修饰GLP-1类似物的降血糖作用，结果表明本发明提供的聚乙二醇修饰的胰高血糖素样肽-1类似物具有显著的降血糖作用而且给药后144小时仍显示活性，说明所设计的序列多肽具有较好的代谢稳定性，体内半衰期显著延长，克服了天然GLP-1半衰期短的问题，可大幅提高临床应用依从性，具有较好的应用价值。在体外对GLP-1受体的激动活性试验表明，本发明提供的经过修饰的改构肽显示了优于内源性受体激动剂GLP-1(7-36-NH2)的活性，说明更适合通过大分子修饰长效化。

附图说明

[0055] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

[0056] 图1为实施例4中直线型单甲氧基PEG(40000道尔顿)修饰SEQ ID NO:5和直线型单甲氧基PEG(42000道尔顿)修饰SEQ ID NO:12、PEG(45000道尔顿)修饰SEQ ID NO:7的降血糖作用评价结果；

[0057] 图2为实施例5中直线型单甲氧基PEG(40000道尔顿)修饰SEQ ID NO:9和直线型单甲氧基PEG(42000道尔顿)修饰SEQ ID NO:11、PEG(45000道尔顿)修饰SEQ ID NO:14的降血糖作用评价结果。

具体实施方式

[0058] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

[0059] 实施例1

[0060] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本实施例仅为解释本发明，不以任何方式限制本发明内容。为了更好的理解本发明，所用试剂的缩写与中文名对照详见表1。

[0061] 表1试剂缩写与中文名对照

[0062]

[0063] 实施例1

[0064] A.胰高血糖素样肽-1类似物的制备

[0065] 1)合成：采用Fmoc策略，用CS 336型多肽合成仪(CS Bio)，按照如下步骤逐步合成：

[0066] a)在活化剂系统存在下由树脂固相载体和Fmoc保护的C-端氨基酸偶联得到Fmoc-氨基酸-树脂；其中，合成C-端酰胺化多肽采用氨基树脂，如Rink Amide AM，Rink Amide，Rink MBHA等。

[0067] b)肽链的延长：通过固相合成法按照肽序列氨基酸顺序连接氨基酸，得到N-端和侧链保护的肽－树脂偶联物；带侧链氨基酸采取如下保护措施：色氨酸用Boc(叔丁氧羰基)，谷氨酸用OtBu(氧叔丁基)，赖氨酸用Boc(叔丁氧羰基)，谷氨酰胺用Trt(三苯甲基)，酪氨酸用tBu(叔丁基)，丝氨酸用Trt(三苯甲基)或tBu(叔丁基)，天冬氨酸用OtBu(氧叔丁基)，苏氨酸用tBu(叔丁基)，组氨酸用Trt(三苯甲基)或Boc(叔丁氧羰基)保护。使用的偶联活化剂为HOBT/HBTU/DIEA和HOBT/HATU/DIEA，茚三酮法检测反应效率。

[0068] c)树脂上多肽的裂解：TFA/EDT/TIS/H2O(92.5:2.5:2.5:2.5v/v)溶液，置室温下反应90min,脱保护和脱树脂。抽滤得滤液，用过量乙醚沉淀粗多肽，离心，收集沉淀，再用少量乙醚洗涤沉淀，真空下干燥，得粗品多肽。同时脱除保护基和树脂，得到粗品胰高血糖素样肽-1类似物；

[0069] 2)纯化：将粗品胰高血糖素样肽-1类似物溶解于水或10-15％乙腈(10-50mg/ml)，加入50-100mM的二硫基苏糖醇DTT或β-巯基乙醇进行变性，采用制备型HPLC法，C18色谱柱，乙腈－水－三氟乙酸系统分离纯化，浓缩，冻干，得巯基游离的纯品多肽。

[0070] 采用上述方法制备了SEQ ID NO:1-19所表示的胰高血糖素样肽-1类似物。

[0071] 实施例2

[0072] 直线型单甲基PEG(21000道尔顿)修饰SEQ ID NO:1

[0073] 1)连接：SEQ ID NO:1多肽溶解于含有5mM EDTA的pH6的50mM磷酸钠缓冲溶液中，浓度为2mg/mL。加入1.2-1.5倍摩尔量的固态的PEG-马来酰亚胺，搅拌溶解，于室温反应2hr。反应以HPLC监控，以5mMβ-巯基乙醇终止反应，置室温30min后纯化。

[0074] 2)纯化:采用制备型离子交换柱层析，以SP SepharoseHP填料，以0-500mM氯化钠溶液线性梯度洗脱。流出液以HPLC和SDS-电泳检测，收集PEG-多肽流分，超滤浓缩或用Sephadex G-25等方法脱盐，冻干而得。

[0075] 所得PEG修饰多肽采用RP-HPLC检测纯度，采用MALDI-TOF测定分子量。

[0076] 实施例3

[0077] 直线型单甲基PEG(30000道尔顿)修饰SEQ ID NO:8

[0078] 按实施例2方法制备直线型单甲基PEG(30000道尔顿)修饰SEQ ID NO:8以及下列胰高血糖素样肽-1类似物的PEG缀合物。

[0079] 直线型单甲氧基PEG(45000道尔顿)修饰SEQ ID NO:7

[0080] 直线型单甲氧基PEG(43000道尔顿)修饰SEQ ID NO:8

[0081] 直线型单甲氧基PEG(45000道尔顿)修饰SEQ ID NO:9

[0082] 直线型单甲氧基PEG(41000道尔顿)修饰SEQ ID NO:10

[0083] 直线型单甲氧基PEG(42000道尔顿)修饰SEQ ID NO:11

[0084] 直线型单甲氧基PEG(35000道尔顿)修饰SEQ ID NO:13

[0085] 直线型单甲氧基PEG(42000道尔顿)修饰SEQ ID NO:14

[0086] 直线型单甲氧基PEG(22000道尔顿)修饰SEQ ID NO:16

[0087] 直线型单甲氧基PEG(45000道尔顿)修饰SEQ ID NO:18

[0088] 直线型单甲氧基PEG(46000道尔顿)修饰SEQ ID NO:19

[0089] 直线型单甲氧基PEG(20000道尔顿)修饰SEQ ID NO:7

[0090] 直线型单甲氧基PEG(40000道尔顿)修饰SEQ ID NO:7

[0091] Y型PEG(40000道尔顿)修饰SEQ ID NO:7

[0092] 4臂型PEG(40000道尔顿)修饰SEQ ID NO:7

[0093] 直线型单甲氧基PEG(20000道尔顿)修饰SEQ ID NO:3

[0094] Y型PEG(40000道尔顿)修饰SEQ ID NO:3

[0095] 直线型单甲氧基PEG(20000道尔顿)修饰SEQ ID NO:3

[0096] 直线型单甲氧基PEG(40000道尔顿)修饰SEQ ID NO:4

[0097] Y型PEG(40000道尔顿)修饰SEQ ID NO:4

[0098] 4臂型PEG(40000道尔顿)修饰SEQ ID NO:4

[0099] Y型PEG(40000道尔顿)修饰SEQ ID NO:5

[0100] 4臂型PEG(40000道尔顿)修饰SEQ ID NO:5

[0101] 4臂型单甲氧基PEG(40000道尔顿)修饰SEQ ID NO:6

[0102] Y型PEG(40000道尔顿)修饰SEQ ID NO:6

[0103] 实施例4

[0104] 直线型单甲氧基PEG(30000道尔顿)修饰SEQ ID NO:5(样品8)和PEG(45000道尔顿)修饰SEQ ID NO:7(样品14)和12(样品12)的降血糖作用评价

[0105] 采用db/db模型小鼠评价本发明GLP-1类似物PEG修饰物的降血糖作用。方法：db/db小鼠40只(购自中科院上海实验动物中心，血糖水平至少为250mg/dL)随机分成4组(空白对照组、2个试验组)，每组10只；称取适量GLP-1类似物的PEG修饰物0.1mg/ml的样品溶液。试验组小鼠，每只皮下注射200μl样品溶液；空白对照组小鼠，每只皮下注射200μl生理盐水。试验期间不限制摄食。分别测定注射后2、4、8、24、72、96、120小时的血糖值。结果如图1所示。

[0106] 实施例5

[0107] 直线型单甲氧基PEG(45000道尔顿)修饰SEQ ID NO:9(样品17)和直线型单甲氧基PEG(42000道尔顿)修饰SEQ ID NO:11(样品21)、PEG(42000道尔顿)修饰SEQ ID NO:14(样品26)的降血糖作用评价

[0108] 评价方法同实施例4，结果见图2。

[0109] 实施例6

[0110] 对GLP-1受体激动活性评价

[0111] 通过对GLP-1受体介导的体外cAMP产生的影响评价本发明所述多肽对GLP-1受体的激动活性。

[0112] 将转染有人GLP-1受体的中国豚鼠肺细胞接种到96孔培养板，(200000个/孔)，以Hanks’平衡盐缓冲液洗涤后，与不同浓度的受试多肽样品(10-5-10-12mol/L)，在200μmol/L 3-异丁基-1-甲基茜草黄素存在下于37℃共孵20min。去除介质，溶解细胞，测定cAMP值，测定方法参照分析试剂盒说明。用Origin软件计算50％有效浓度。结果见表2。

[0113] 表2多肽对cAMP的诱导产生作用

[0114] 肽序号 GLP-1R(nM EC50)GLP-1 0.17±0.21
SEQ ID NO:1 0.07±0.14
SEQ ID NO:3 0.10±0.26
SEQ ID NO:4 0.08±0.33
SEQ ID NO:5 0.09±0.19
SEQ ID NO:6 0.16±0.20
SEQ ID NO:7 0.06±0.09
SEQ ID NO:8 0.18±0.22
SEQ ID NO:11 0.08±0.13
SEQ ID NO:12 0.13±0.17
SEQ ID NO:14 0.16±0.14
SEQ ID NO:19 0.20±0.31

[0115] 结论：所示多肽序列中SEQ ID NO:1、4、7、11显示了强于内源性GLP-1的受体激动活性。

[0116] 实施例7

[0117] 不同分子量和不同结构PEG修饰SEQ ID NO:7的降血糖作用和长效性评价[0118] 采用正常小鼠糖负荷模型评价了SEQ ID NO:7的不同PEG修饰物的降血糖作用和长效性.

[0119] 样品:

[0120] 分别用mPEG(20KD)、mPEG(40KD)、Y型PEG(40KD)、4臂型PEG(40KD)修饰的SEQ ID NO:.7(C-末端酰胺化)样品按实施例3方法制备、表征，纯度(HPLC)＞98.0％；(37C)GLP-1(7-36)的mPEG(20KD)修饰物，按实施例3方法制备、表征，纯度(HPLC)＞98.0％；

[0121] 阳性药：利拉鲁肽(诺和诺德公司产)

[0122] 方法：

[0123] 采用正常小鼠糖负荷模型评价：正常小鼠(n＝6)，禁食12小时，药前测定血糖值，皮下给药，药后不同时间点腹腔注射葡萄糖(4mg/kg)(给糖前禁食4小时)，糖后0.5小时测定小鼠血糖值，计算样品对糖负荷正常小鼠血糖升高的抑制率，计算公式为抑制率％＝(1-给药组血糖平均值/模型对照组血糖平均值)％，利拉鲁肽为阳性对照药。

[0124] 给药剂量：阳性药利拉鲁肽和样品均为100nmol/kg。

[0125] 结果：见下表3

[0126] 表3.PEG修饰SEQ.7系列样品的不同时间段降血糖作用

[0127]

[0128] 结论：阳性药利拉鲁肽和mPEG(20KD)修饰的37CGLP-1在给药24hr后降血糖作用基本消失，而PEG修饰的SEQ.7的样品系列在不同时间段显示了优于阳性药的降血糖作用，mPEG(20KD)、mPEG(40KD)、YPEG(40KD)、4Arm PEG(40KD)4个样品药效持续时间分别为48、120、144小时,分支型PEG修饰样品药效波动小，其中4臂型PEG(40KD)修饰样品显著优于其他样品。mPEG(20KD)-37CGLP-1与mPEG(20KD)SEQ.7相比，活性衰减更快，前者24小时的活性仅为33.1％，48hr无活性，而后者药效可平稳持续到48hr,显著优于前者。说明对序列的一系列替换改造有效避免了酶降解，提高裸肽的稳定性和活性更有利于修饰物的药效发挥和延长体内半衰期。

[0129] 实施例8

[0130] 按实施例7的方法,评价了SEQ ID NO:4、5、6的Y型PEG(40KD)修饰体的降血糖作用和长效性。结果见表4。

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[0133] 结论：SEQ ID NO:4和6的Y型PEG(40KD)修饰体降血糖作用和药效持续时间相近，而SEQ ID NO:5与前两组相比活性以及其持续时间有较大差异。说明不同位点的PEG修饰对活性的发挥和持续时间有很大影响。