培养基及其用途与间充质干细胞向汗腺样细胞转化的方法

摘要

本发明涉及干细胞分化技术领域，尤其涉及培养基及其用途与间充质干细胞向汗腺细胞转化的方法。采用本发明提供的培养基诱导间充质干细胞，4天细胞形态发生改变，所获得的细胞经检测符合间汗腺样细胞的特性，数量较大，活率较高。所述间充质干细胞由尿细胞诱导获得，其来源广泛，不受伦理限制。

权利要求

1.一种诱导间充质干细胞转化为汗腺样细胞的方法，其特征在于，将间充质干细胞培养至融合度为70% 80%时，更换培养基为汗腺样细胞诱导培养基，诱导4天获得汗腺样细胞，~然后以增殖、传代培养基进行增殖和传代培养；

所述汗腺样细胞诱导培养基由DMEM培养基和如下组分组成：FBS                   10vol%；

EGF                   50 ng/mL；

HGF                   40 ng/mL ；

牛垂体提取物          55 mg/mL ；

氯化乙酰胆碱          5×10-5mol/L；

KGF                   50 ng/mL；

胰岛素                0.1ng/mL；

转铁蛋白              15μg/mL；

所述增殖、传代的培养基由DMEM培养基和如下组分组成：FBS                   10vol%；

EGF                   20 ng/mL；

氢化可的松            100 μg/mL ；

ITS                   1 ng/mL ；

青霉素                100μg/mL；

链霉素                100μg/mL；

所述间充质干细胞的制备方法为：将转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28导入尿液细胞，培养获得IPS细胞；

将IPS细胞以mTesR培养基培养至融合度为60% 80%时，更换培养基进行诱导，诱导5 7~ ~天获得间充质干细胞；

所述进行诱导的培养基包括基础培养基和：FBS                  10vol%；

胰岛素               80 160pmol/L；

~

L-谷氨酰胺           5 10mmol/L；

~

bFGF                 50 200μg/L；

~

SCF                  5 50μg/L；

~

地塞米松             2×10-8  5×10-8 mol/L。

~

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述汗腺样细胞的诱导的温度为37℃，每两天更换新鲜培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述IPS细胞的诱导的温度为37℃，每天更换新鲜培养基。

4.根据权利要求1 3任一项所述的方法，其特征在于，所述尿液细胞的制备方法为：离~心尿液，沉淀经灭菌后，以含有Primocin 的REGM培养基培养，获得尿液细胞。

说明书

培养基及其用途与间充质干细胞向汗腺样细胞转化的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及干细胞分化技术领域，尤其涉及培养基及其用途与间充质干细胞向汗腺细胞转化的方法。

背景技术

[0002] 皮肤是人体最大的器官，具有保护身体，排汗，感觉冷热和压力等功能。其中汗腺作为重要的功能性皮肤附属器，在调节体温，分泌汗液及排出人体部分代谢产物的过程中发挥着重要的作用。轻度烧伤汗腺细胞可以靠未受伤部位的细胞增殖而进行修复；而大面积烧伤，汗腺被严重破坏或被瘢痕组织阻隔而丧失了分泌汗液的功能，汗腺的缺失不仅会导致大量汗液不能排出体外，滞留在肌肉内刺激疤痕结缔组织增生，严重影响皮肤损伤的愈合质量。这不仅给患者的生理与心理带来严重障碍，而且对其后期的生活与工作质量产生严重影响。因此，研究皮肤损伤后汗腺组织的修复与再生，不仅是创(烧、战)伤治疗本身的需要，而且也是重塑人体生理与心理的需要，值得人们关注。换言之也是目前亟待解决的医学和社会问题。

[0003] 随着组织工程学的发展，目前研究表明，模拟汗腺的发生机制来诱导干细胞向汗腺细胞定向分化，可能是重建汗腺的唯一途径。汗腺的发生是一个非常复杂的过程，目前对其形态发生、生长调控及相关基因表达等机制尚未完全明确。而体外诱导干细胞向汗腺分化，能够模拟体内的这一过程，为汗腺重建提供理论基础。而目前的干细胞分化方法中，需要采用汗腺细胞与干细胞进行共培养，不仅加大了研究的工作量，汗腺细胞有限的来源也限制了研究工作的快速发展。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供培养基及其用途与间充质干细胞向汗腺细胞转化的方法，本发明提供的培养基能够将间充质干细胞转化为汗腺细胞，且无需与汗腺细胞共培养。

[0005] 本发明提供的汗腺样细胞诱导培养基包括基础培养基和：

[0006]

[0007] 一些实施例中，汗腺样细胞诱导培养基包括基础培养基和：

[0008]

[0009] FBS是胎牛血清；EGF是表皮生长因子，本发明采用的是hEGF，即人体表皮生长因子；HGF为肝细胞生长因子；牛垂体提取物即Bovine Pituitary Extract；KGF为角化细胞生长因子。本发明中，在基础培养基中添加FBS、EGF、HGF、牛垂体提取物、氯化乙酰胆碱、KGF、胰岛素和转铁蛋白，该培养基能够诱导间充质干细胞向汗腺样细胞转化。所述基础培养基为DMEM培养基。

[0010] 本发明还提供了一种诱导间充质干细胞转化为汗腺样细胞的方法，将间充质干细胞培养至融合度为70％～80％时，更换培养基为本发明提供的汗腺样细胞诱导培养基，诱导4天获得汗腺样细胞。

[0011] 诱导的温度为37℃，每两天更换新鲜培养基。

[0012] 一些实施例中，诱导条件为37℃，饱和湿度，5％CO2。所述诱导在以matrigel包被的培养板中进行。

[0013] 实验表明，以该方法诱导汗腺样细胞，4d细胞发生形变。

[0014] 本发明获得汗腺样细胞后，还包括增殖、传代的步骤；所述增殖、传代的培养基包括基础培养基和：

[0015]

[0016] 一些实施例中，所述汗腺样细胞的增殖、传代的培养基包括基础培养基和：

[0017]

[0018] FBS是胎牛血清；ITS为胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠。本发明中，在基础培养基中添加FBS、EGF、氢化可的松、ITS、青霉素和链霉素，该培养基能够诱导用于汗腺样细胞的增殖和传代。所述基础培养基为DMEM培养基。

[0019] 本发明中，所述间充质干细胞由尿液细胞制得。

[0020] 本发明中，间充质干细胞的制备方法为：

[0021] 将转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28导入尿液细胞，培养获得IPS细胞；

[0022] 将IPS细胞以mTesR培养基培养至融合度为60％～80％时，更换培养基进行诱导，诱导5～7天获得间充质干细胞；

[0023] 所述进行诱导的培养基包括基础培养基和：

[0024]

[0025]

[0026] 所述进行诱导IPS细胞向间充质肝细胞转化的培养基包括基础培养基和：

[0027]

[0028] FBS是胎牛血清；bFGF为碱性成纤维细胞生长因子；SCF为干细胞因子。本发明中，在基础培养基中添加FBS、L-谷氨酰胺、胰岛素、bFGF和SCF，该培养基能够诱导IPS细胞向间充质干细胞转化。所述基础培养基为DMEM培养基。

[0029] 一些实施例中，诱导IPS细胞向间充质干细胞转变的条件为37℃，饱和湿度，5％CO2。所述诱导在以matrigel包被的培养板中进行。所述培养过程中每天更换新鲜培养基。

[0030] 实验表明，以该方法诱导IPS细胞，5～7d细胞发生形变。

[0031] 本发明中，所述获得间充质干细胞还包括增殖、传代的步骤；所述增殖、传代的培养基包括基础培养基和：

[0032]

[0033] 一些实施例中，所述间充质干细胞增殖、传代的培养基包括基础培养基和：

[0034]

[0035]

[0036] HGF是肝细胞生长因子、PDGF为血小板衍生因子，TGF-β为转化生长因子-β。本发明将FBS、EGF、HGF、bFGF、PDGF和TGF-β添加入基础培养基，所得培养基能够用于间充质干细胞的培养。所述基础培养基为DMEM培养基。

[0037] 本发明中，尿液细胞的制备方法为：离心尿液，沉淀经灭菌后，以含有Primocin的REGM培养基培养，获得尿液细胞。

[0038] 本发明中，尿液细胞的具体制备方法为：

[0039] 步骤1：在含有青霉素/链霉素双抗的容器中收集尿液，400g离心10min，沉淀以含有青霉素/链霉素的PBS(每95mL PBS加入5mL青霉素/链霉素)清洗一次后，转移至经0.1％明胶包被的培养板；

[0040] 步骤2：含有Primocin的REGM培养基(每2mLREGM培养基添加3μL Primocin)培养，培养条件为37℃，饱和湿度，5％CO2；待细胞贴壁后，吸去培养基，用PBS洗一遍，再进行换液处理；当尿液细胞融合度达到80％，进行传代培养。

[0041] 所述转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28导入尿液细胞后，细胞以REGM与MEF的混合培养基(体积比1:1)在用明胶包被后的培养板上进行培养；导入转录调控因子后第2天，将培养基更换为IPS培养基mTesR，每天更换新鲜培养基，使克隆继续增殖；导入转录调控因子后第7天，镜下观察形态与人胚胎干细胞相近的挑取单克隆，并接种于用明胶包被的培养板，培养基mTesR培养获得诱导多能干细胞(IPS细胞)。

[0042] IPS细胞用0.03％～0.3％胶原酶IV将细胞消化成单个细胞后，再诱导形成间充质干细胞。

[0043] 免疫荧光法对本发明提供方法制备得到的汗腺细胞进行检测，CK14和CEA的表达量极高为阳性表达，说明诱导出的细胞为汗腺细胞。而通过流式细胞仪分析显示，在汗腺细胞中CK14蛋白的阳性表达量为85％以上，CEA蛋白的阳性表达量为65％以上，而MSX-1蛋白的阴性表达量在5％以下，符合汗腺细胞表面标记物的表达结果。

[0044] 本发明提供了培养基以及使用该培养基诱导间充质干细胞成为汗腺样细胞的方法，采用本发明提供的培养基，4天细胞形态发生改变，所获得的细胞经检测符合间汗腺样细胞的特性，数量较大，活率较高。所述间充质干细胞由尿细胞诱导获得，其来源广泛，不受伦理限制。

附图说明

[0045] 图1示实施例1制备汗腺样细胞的免疫荧光检测情况；

[0046] 图2示实施例1制备汗腺样细胞的表面标志物表达检测情况。

具体实施方式

[0047] 本发明提供了培养基及其用途与间充质干细胞向汗腺细胞转化的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0048] 本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

[0049] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0050] 实施例1

[0051] 1、培养基的制备

[0052] IPS诱导培养基(配置培养基A)：REGM与MEF培养基按体积比的比例混合(1:1)；

[0053] 间充质干细胞诱导培养基(配置培养基B)：450mLDMEM基础培养基、50mLFBS、80pM胰岛素、5mM L-谷氨酰胺、100μg/L bFGF、30μg/L SCF、3×10-8mol/L地塞米松；

[0054] 间充质干细胞培养基(配置培养基C)：450mL DMEM基础培养基、50mL FBS、10ng/mL hEGF、10ng/mL bFGF、15ng/mL HGF、8ng/mLPDGF、10ng/mLTGF-β；

[0055] 汗腺细胞诱导培养基(配置培养基D)：450mLDMEM基础培养基、50mL FBS、50ng/mL hEGF、40ng/mLHGF、55mg/mL牛垂体提取物、5×10-5mol/L氯化乙酰胆碱、50ng/mLKGF、0.1ng/mL胰岛素、15μg/mL转铁蛋白；

[0056] 汗腺细胞培养基(配置培养基E)450mL DMEM基础培养基、50mL FBS、20ng/mL hEGF、100μg/mL氢化可的松、1ng/mL胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠、100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素

[0057] 2、尿液细胞的获取

[0058] 1)收集杯每个加2mL青霉素/链霉素双抗。

[0059] 2)收集尿液，如不立刻进行后续操作，则将尿液存储于4℃冰箱并于当天完成后续操作。

[0060] 3)每份尿液准备六孔板1孔，将此孔用0.1％明胶包被20min以上，使用前吸去孔内液体。

[0061] 4)把尿液倒到合适数量的50mL离心管里，离心400g，10min。

[0062] 5)吸去上清，每管留下约1-5mL，混合到一个离心管内。

[0063] 6)加入含有青霉素/链霉素的PBS(PBS 95mL加入5mL青霉素/链霉素混匀)约10-30mL。轻轻混匀。

[0064] 7)离心400g，10min。

[0065] 8)吸去上清至剩余0.5-1mL液体。

[0066] 9)把剩余的液体加入包被好的孔中，加入2mLREGM培养基加入3μL Primocin。

[0067] 10)将培养皿放置于37℃培养箱内培养，待尿液细胞贴壁后，吸去培养基，用PBS洗一遍，再进行换液处理。

[0068] 11)当尿液细胞融合度达到80％，则可进行传代培养。

[0069] 3、尿液细胞重编程为ips细胞

[0070] 1)将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28或其它转录因子的各种组合共同导入尿细胞，将细胞分至预先用matrigel包被的6孔板中，用培养液A培养；

[0071] 2)转染后第2天，将培养基更换为IPS培养基mTesR，每天更换新鲜培养基；使克隆继续增殖

[0072] 3)转染后第7天，镜下观察形态与人胚胎干细胞相近的挑取单克隆，并接种于用matrigel包被的12孔板中，培养基mTesR培养获得诱导多能干细胞。

[0073] 4、IPS诱导间充质干细胞

[0074] 1)将制备好的ips细胞，0.25％的胰酶进行消化，收集细胞按1：3的比例接种至Matrigel包被好六孔板中，mTesR培养基进行培养。

[0075] 2)待六孔板中的ips细胞融合度达到70％时，PBS清洗将ips培养基清除干净，加入培养液B进行诱导培养，每天更换培养液。

[0076] 3)培养5-7d细胞发生形变，更换培养液C进行培养。

[0077] 5、IPS来源的间充质干细胞诱导分化为汗腺细胞

[0078] 1)将间充质干细胞培养基中的培养基C去除，加1mLDMEM/F12培养液清洗一遍后，加含0.5mM EDTA的DPBS消化5min，400g，离心5min，收集细胞沉淀，加入培养基C以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被好的六孔板中；

[0079] 2)待间充质干细胞长至六孔板的70％-80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基D，每两天更换一次培养基。

[0080] 3)培养4天后，得到汗腺样细胞，更换培养液E进行增殖与传代。

[0081] 实施例2

[0082] 1、培养基的制备

[0083] IPS诱导培养基(配置培养基A)：REGM与MEF培养基按体积比的比例混合(1:1)；

[0084] 间充质干细胞诱导培养基(配置培养基B)：450mLDMEM基础培养基、50mLFBS、160pM胰岛素、10mM L-谷氨酰胺、200μg/L bFGF、50μg/LSCF、5×10-8mol/L地塞米松；

[0085] 间充质干细胞培养基(配置培养基C)：450mLDMEM基础培养基、50mLFBS、100ng/mL hEGF、100bFGF、50ng/mL HGF、20ng/mLPDGF、25ng/mL TGF-β

[0086] 汗腺细胞诱导培养基(配置培养基D)：450mLDMEM基础培养基、50mLFBS、150ng/mL hEGF、100ng/mLHGF、100mg/mL牛垂体提取物、58×10-5mol/L氯化乙酰胆碱、150ng/mL KGF、0.5ng/mL胰岛素、50μg/mL转铁蛋白

[0087] 汗腺细胞培养基(配置培养基E)450mLDMEM基础培养基、50mLFBS、50ng/mL hEGF、200μg/mL氢化可的松、10ng/mL胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠、150μg/mL青霉素、150μg/mL链霉素

[0088] 2、尿液细胞的获取

[0089] 1)收集杯每个加2mL青霉素/链霉素双抗。

[0090] 2)收集尿液，如不立刻进行后续操作，则将尿液存储于4℃冰箱并于当天完成后续操作。

[0091] 3)每份尿液准备六孔板1孔，将此孔用0.1％明胶包被20min以上，使用前吸去孔内液体。

[0092] 4)把尿液倒到合适数量的50mL离心管里，离心400g，10min。

[0093] 5)吸去上清，每管留下约1-5mL，混合到一个离心管内。

[0094] 6)加入含有青霉素/链霉素的PBS(PBS 95mL加入5mL青霉素/链霉素混匀)约10-30mL。轻轻混匀。

[0095] 7)离心400g，10min。

[0096] 8)吸去上清至剩余0.5-1mL液体。

[0097] 9)把剩余的液体加入包被好的孔中，加入2mLREGM培养基加入3μL Primocin。

[0098] 10)将培养皿放置于37℃培养箱内培养，待尿液细胞贴壁后，吸去培养基，用PBS洗一遍，再进行换液处理。

[0099] 11)当尿液细胞融合度达到80％，则可进行传代培养。

[0100] 3、尿液细胞重编程为ips细胞

[0101] 1)将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28或其它转录因子的各种组合共同导入尿细胞，将细胞分至预先用matrigel包被的6孔板中，用培养液A培养；

[0102] 2)转染后第2天，将培养基更换为IPS培养基mTesR，每天更换新鲜培养基；使克隆继续增殖

[0103] 3)转染后第7天，镜下观察形态与人胚胎干细胞相近的挑取单克隆，并接种于用matrigel包被的12孔板中，培养基mTesR培养获得诱导多能干细胞。

[0104] 4、IPS诱导间充质干细胞

[0105] 1)将制备好的ips细胞，0.25％的胰酶进行消化，收集细胞按1：3的比例接种至Matrigel包被好六孔板中，mTesR培养基进行培养。

[0106] 2)待六孔板中的ips细胞融合度达到70％时，PBS清洗将ips培养基清除干净，加入培养液B进行诱导培养，每天更换培养液。

[0107] 3)培养5-7d细胞发生形变，更换培养液C进行培养。

[0108] 5、IPS来源的间充质干细胞诱导分化为汗腺细胞

[0109] 1)将间充质干细胞培养基中的培养基C去除，加1mLDMEM/F12培养液清洗一遍后，加含0.5mM EDTA的DPBS消化5min，400g，离心5min，收集细胞沉淀，加入培养基C以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被好的六孔板中；

[0110] 2)待间充质干细胞长至六孔板的70％-80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基D，每两天更换一次培养基。

[0111] 3)培养4天后，得到汗腺样细胞，更换培养液E进行增殖与传代。

[0112] 实施例3

[0113] 1、培养基的制备

[0114] IPS诱导培养基(配置培养基A)：REGM与MEF培养基按体积比的比例混合(1:1)；

[0115] 间充质干细胞诱导培养基(配置培养基B)：450mLDMEM基础培养基、50mLFBS、1pM胰岛素、1mM L-谷氨酰胺、50μg/LbFGF、5μg/LSCF、2×10-8mol/L地塞米松[0116] 间充质干细胞培养基(配置培养基C)：450mLDMEM基础培养基、50mL FBS、1ng/mL hEGF、1bFGF、1ng/mL HGF、2ng/mL PDGF、1ng/mLTGF-β

[0117] 汗腺细胞诱导培养基(配置培养基D)：450mLDMEM基础培养基、50mLFBS、10ng/mL hEGF、1ng/mLHGF、10mg/mL牛垂体提取物、2×10-5mol/L氯化乙酰胆碱、10ng/mLKGF、0.01ng/mL胰岛素、5μg/mL转铁蛋白

[0118] 汗腺细胞培养基(配置培养基E)450mLDMEM基础培养基、50mLFBS、10ng/mL hEGF、50μg/mL氢化可的松、0.5ng/mL胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠、50μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素

[0119] 2、尿液细胞的获取

[0120] 1)收集杯每个加2mL青霉素/链霉素双抗。

[0121] 2)收集尿液，如不立刻进行后续操作，则将尿液存储于4℃冰箱并于当天完成后续操作。

[0122] 3)每份尿液准备六孔板1孔，将此孔用0.1％明胶包被20min以上，使用前吸去孔内液体。

[0123] 4)把尿液倒到合适数量的50mL离心管里，离心400g，10min。

[0124] 5)吸去上清，每管留下约1-5mL，混合到一个离心管内。

[0125] 6)加入含有青霉素/链霉素的PBS(PBS 95mL加入5mL青霉素/链霉素混匀)约10-30mL。轻轻混匀。

[0126] 7)离心400g，10min。

[0127] 8)吸去上清至剩余0.5-1mL液体。

[0128] 9)把剩余的液体加入包被好的孔中，加入2mLREGM培养基加入3μL Primocin。

[0129] 10)将培养皿放置于37℃培养箱内培养，待尿液细胞贴壁后，吸去培养基，用PBS洗一遍，再进行换液处理。

[0130] 11)当尿液细胞融合度达到80％，则可进行传代培养。

[0131] 3、尿液细胞重编程为ips细胞

[0132] 1)将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28或其它转录因子的各种组合共同导入尿细胞，将细胞分至预先用matrigel包被的6孔板中，用培养液A培养；

[0133] 2)转染后第2天，将培养基更换为IPS培养基mTesR，每天更换新鲜培养基；使克隆继续增殖

[0134] 3)转染后第7天，镜下观察形态与人胚胎干细胞相近的挑取单克隆，并接种于用matrigel包被的12孔板中，培养基mTesR培养获得诱导多能干细胞。

[0135] 4、IPS诱导间充质干细胞

[0136] 1)将制备好的ips细胞，0.25％的胰酶进行消化，收集细胞按1：3的比例接种至Matrigel包被好六孔板中，mTesR培养基进行培养。

[0137] 2)待六孔板中的ips细胞融合度达到70％时，PBS清洗将ips培养基清除干净，加入培养液B进行诱导培养，每天更换培养液。

[0138] 3)培养5-7d细胞发生形变，更换培养液C进行培养。

[0139] 5、IPS来源的间充质干细胞诱导分化为汗腺细胞

[0140] 1)将间充质干细胞培养基中的培养基C去除，加1mLDMEM/F12培养液清洗一遍后，加含0.5mM EDTA的DPBS消化5min，400g，离心5min，收集细胞沉淀，加入培养基C以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被好的六孔板中；

[0141] 2)待间充质干细胞长至六孔板的70％-80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基D，每两天更换一次培养基。

[0142] 3)培养4天后，得到汗腺样细胞，更换培养液E进行增殖与传代。

[0143] 实施例4

[0144] 对实施例1～3制得的间充质干细胞进行检测：

[0145] 1、免疫荧光检测

[0146] 1、0.25％胰酶消化汗腺细胞，以1×105的接种量接种于12孔板中，待其贴壁，4％的多聚甲醛固定2h，PBS洗三遍；

[0147] 2、加200μL的一抗稀释液(PBS+10％血清+0.3％TritonX-100)常温封闭1-2h；

[0148] 3、弃去一抗稀释液，加入200μL鼠源CK14、CEA一抗抗体(稀释度为1:100)，4℃孵育过夜，PBS冲洗3次，每次5min；

[0149] 4、加200μLFITC标记羊抗鼠二抗(1：400)，常温避光反应1h，PBS冲洗；加入DAPI染核，在荧光显微镜下观察，拍照。其中，对实施例1制得汗腺细胞的检测结果如图1。从图1可以看出，CK14和CEA蛋白是汗腺细胞的特异性标记蛋白，CK14和CEA的表达量极高为阳性表达，说明诱导出的细胞为汗腺细胞。实施例2～3制得汗腺细胞的检测结果与此相似。

[0150] 2、流式细胞仪表型检测

[0151] 1、0.25％胰酶消化汗腺细胞并收集细胞，细胞数为2×105个；

[0152] 2、细胞胞重悬于1mLDPBS中洗涤2次，200g，离心5min，得到的细胞沉淀加入1mL70％预冷的酒精重悬固定2h；

[0153] 3、离心弃去固定液，加入200μL鼠源CK14、CEA、MSX-1一抗抗体(稀释度为1:100)常温下孵育30min；

[0154] 4、1mLPBS洗涤，分别与FITC标记二抗(稀释度为1:200)常温避光孵育1h；

[0155] 5、PBS洗两次后，弃去PBS，根据细胞量加入适量的PBS重悬细胞，利用流式细胞仪检测。其中，对实施例1制得汗腺细胞的检测结果如图2。通过流式细胞仪分析显示，在汗腺细胞中CK14蛋白的阳性表达量为85％以上，CEA蛋白的阳性表达量为65％以上，而MSX-1蛋白的阴性表达量在5％以下，符合汗腺细胞表面标记物的表达结果。实施例2～3制得汗腺细胞的检测结果与此相似。

[0156] 3、细胞活力检测

[0157] 采用MTT法对各实施例制得细胞的活率进行检测，结果表明，实施例1～3制得间充质干细胞的活力依次为96.8％、87.6％、85％，说明各实施例均能获得较高获利的汗腺细胞，其中实施例1制得的干细胞的活力显著高于实施例2～3(p<0.05)，效果更佳。

[0158] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。