一种催化合成辛伐他汀的酰基转移酶及其突变体

摘要

本发明提供一种催化合成辛伐他汀的酰基转移酶及其制备方法。所述酰基转移酶为SEQID NO：2所示的氨基酸序列在161位，163位，180位，235位进行的突变的突变体；该新型酰基转移酶酶活为野生型酶的12倍，本发明构建的酰基转移酶具有酶成本低，转化时间短、工艺操作简单等特点，具有大规模工业应用的广泛前景。

权利要求

1.一种催化合成辛伐他汀酰基转移酶的突变体，其特征在于：该突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；与核苷酸序列SEQ ID NO.2相比，在所述核苷酸序列SEQ ID NO：4中携带D161N、Y163F、G180S、A235S四个突变体；其中，D161N代表第161位的氨基酸残基从天冬氨酸变成天冬酰胺，Y163F代表第163位氨基酸残基从酪氨酸变成苯丙氨酸，G180S代表第180位氨基酸残基从甘氨酸变成丝氨酸，A235S代表第235位氨基酸残基从丙氨酸变成丝氨酸；

该催化合成辛伐他汀的酰基转移酶的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种采用权利要求1所述辛伐他汀酰基转移酶的突变体催化合成辛伐他汀的方法，步骤包括：合成辛伐他汀侧链：向反应釜中加入3-巯基丙酸甲酯、乙酸乙酯、三乙胺、上述制备的酰基转移酶；开启搅拌，降温至0～5℃，滴加2,2-二甲基丁酰氯，合成辛伐他汀侧链；

（2）酰基转移酶催化合成反应：向反应釜中加入莫那克林酸、上述步骤中所述的辛伐他汀侧链、酸性溶液，控制反应体系pH值在9.0～10.0；加入权利要求1所述的酰基转移酶的突变体，温度控制在25～45℃，搅拌反应48～60h；将反应液过滤；过滤完毕，温度控制在30～50℃，减压，真空度≤-0.09MPa，干燥，得中间体；（3）辛伐他汀粗品制备：将上述步骤制得的中间体加入二氯甲烷中溶解；温度控制在0～25℃下，往滤液中滴加入二氯甲烷与甲烷磺酸混合溶液；滴加完毕，0～25℃搅拌1～4h；反应完毕，将反应液温度调至25～45℃，减压浓缩至固体，得到辛伐他汀粗品。

3.根据权利要求2所述的辛伐他汀酰基转移酶的突变体催化合成辛伐他汀的方法，其特征在于：所述酸性溶液为盐酸、硫酸、醋酸中的一种。

说明书

一种催化合成辛伐他汀的酰基转移酶及其突变体

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程与酶工程领域，涉及一种用于催化合成辛伐他汀的酰基转移酶及其突变体。

背景技术

[0002] 辛伐他汀，商品名为舒降之（Zocor），英文名为Simvastatin，辛伐他汀是他汀类（statin）的降血脂药物，为羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-COA）还原酶抑制剂，抑制内源性胆固醇的合成，为血脂调节剂。文献资料表明，有降低高脂血症家兔血清、肝脏、主动脉中总胆固醇（TC的含量，）降低极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平的作用。临床用于治疗高胆固醇血症、冠心病，控制血液中蛋白醇的含量以及预防血管疾病。

[0003] 辛伐他汀由美国默克公司开发，该品于1988年首次上市，1991年12月获美国FDA批准。2000年美国默克的舒降之（Zocor）在全球销售榜上排在第二名，销售额为52.8亿美元，2001年达到66.7亿美元的巅峰，2002年为55.8亿美元，具有巨大的市场需求。

[0004] 目前工业界生产辛伐他汀的方法主要为化学合成法，发酵法和生产转化法，主要中间体可以通过发酵获得红麴素J（又称红曲素、Monacolin J，CAS号：132748-10-8）。

[0005] 化学合成法，由中间体红麴素J（又称红曲素、Monacolin J）出发，通过化学催化的保护、脱保护、水解、酯化等一系列反应获得辛伐他汀，显而易见的是，该类方法受限于步骤繁多，试剂种类多消耗大，产品分离复杂等缺陷，并非生产辛伐他汀的最佳方法。

[0006] 发酵法主要采用构建的基因工程改造的土曲霉菌株，采用发酵法生产辛伐他汀，但辛伐他汀的产量与传统的发酵方法比较并没有表现出明显的效果。

[0007] 生物转化法，目前利用已有的商品化酯酶催化的反应区域选择性较低，仍然会造成反应的产物的纯化步骤复杂等问题。

发明内容

[0008] 为了解决以上问题，本发明的第一个目的在于提供一种催化合成辛伐他汀的酰基转移酶。

[0009] 本发明第二个目的是提供一种编码所述催化合成辛伐他汀的酰基转移本科的核苷酸序列。

[0010] 本发明第三个目的是提供一种催化合成辛伐他汀的酰基转移酶的突变体。

[0011] 本发明第四个目的是提供一种编码所述催化合成辛伐他汀的酰基转移酶的突变体的核苷酸序列。

[0012] 本发明第五个目的是提供一种制备催化合成辛伐他汀的酰基转移酶突变体的方法。

[0013] 本发明第六个目的是提供采用酰基转移酶催化合成辛伐他汀的方法。

[0014] 本发明的技术解决方案如下：

[0015] 一种催化合成辛伐他汀的酰基转移酶，所述酰基转移酶为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

[0016] 一种如上述的催化合成辛伐他汀的酰基转移酶，其核苷酸序列如SEQ NO：1所示。

[0017] 一种如上述的催化合成辛伐他汀的酰基转移酶的突变体，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；与氨基酸序列SEQ ID NO.2相比，在所述氨基酸序列SEQ ID NO：4中携带D161N、Y163F、G180S、A235S四个突变体；其中，D161N代表第164位的氨基酸残基从天冬氨酸变成天冬酰胺，Y163F代表第163位氨基酸残基从酪氨酸变成苯丙氨酸，G180S代表第180位氨基酸残基从甘氨酸变成丝氨酸，A235S代表第235位氨基酸残基从丙氨酸变成丝氨酸。

[0018] 根据上述催化合成辛伐他汀的酰基转移酶的突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0019] 一种制备上述催化合成辛伐他汀的酰基转移酶突变体的方法，包括如下步骤：

[0020] （1）首先构建酰基转移酶的基因工程菌株，将全基因合成的SEQID NO：1核苷酸序列的生物酶基因片段克隆到高效表达载体中pET29a（+），构建酰基转移酶的基因工程菌株，将该酰基转移酶经酶切重组到表达载体pET29a（+），转化到宿主细胞BL21（DE3）中；

[0021] （2）将阳性克隆挑入LB液体培养基中活化后转入LB液体培养基中，培养，最后经发酵培养，收集菌体细胞；

[0022] （3）破碎菌体细胞，得到所述的酰基转移酶。

[0023] 作为优选，所述的酶切重组为以引物F1和R1分别为正反向引物，进行易错PCR，构建突变体库，该引物核苷酸序列如下：F1: 5'-GGAATTCCATATGCAGGATATCGAAC-3'；R1：5'- CCCAAGCTTTCAGTCGTTGCGCAGT-3'，该引物两端分别带有NdeI和HindIII限制性酶切位点。

[0024] 一种采用上述酰基转移酶制备辛伐他汀的方法：步骤包括：

[0025] （1）合成辛伐他汀侧链：向反应釜中加入3-巯基丙酸甲酯、乙酸乙酯、三乙胺、上述制备的酰基转移酶；开启搅拌，降温至0～5℃，滴加2,2-二甲基丁酰氯，合成辛伐他汀侧链；

[0026] （2）酰基转移酶催化合成反应：向反应釜中加入莫那克林酸、上述步骤中所述的辛伐他汀侧链、酸性溶液，控制反应体系pH值在9.0～10.0；加入上述的酰基转移酶，温度控制在25～45℃，搅拌反应48～60h；将反应液过滤；过滤完毕，温度控制在30～50℃，减压，真空度≤-0.09MPa，干燥，得中间体；

[0027] （3）辛伐他汀粗品制备：将上述步骤制得的中间体加入二氯甲烷中溶解；温度控制在0～25℃下，往滤液中滴加入二氯甲烷与甲烷磺酸混合溶液；滴加完毕，温度控制在0～25℃搅拌1～4h；反应完毕，将反应液温度调至25～45℃，减压浓缩至固体，得到辛伐他汀粗品。

[0028] 作为优选，所述酸性溶液为盐酸、硫酸、醋酸中的一种。

[0029] 有益的效果：本发明采用新型酰基转移酶的生物酶活为野生型酶的12倍，合成转化率达到75%。该酰基转移酶热稳定性和贮存稳定性更好，活性高，将该酶应用于生产辛伐他汀，而且反应环境友好，生产成本低，转化时间短、工艺操作简单，反应体系杂质含量低，提高产率，易后处理，具有大规模工业应用的广泛前景。

[0030] 具体实施方法

[0031] 实施例1 酰基转移酶的筛选

[0032] 以已报道的酰基转移酶LovD（来源于A. terreus）为模板，在NCBI上进行BLAST比对，从中选择相似性在40-70%之间的序列来进行基因合成和诱导表达，并用于辛伐他汀的酶法筛选。筛选体系如下：反应体系（底物浓度1g/L）

[0033] 成功筛选到一个可用于辛伐他汀酶法合成的酶，该酶为来源于fungal sp. NO.14919的某一未知蛋白，其编码核苷酸序列如SEQ NO：2所示，编码的氨基酸序列如SEQ NO：1所示。

[0034] 然而该酶的反应活性较低，需要进行定向进化来满足工业化应用需求。

[0035] 实施例2、突变体库的建立

[0036] 以全基因合成的表达质粒（由常州基宇生物技术有限公司合成，质粒上克隆有编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列）为模板，以引物F1和R1分别为正反向引物，进行易错PCR，构建突变体库。

[0037] 引物序列如下：F1: 5'-GGAATTCCATATGCAGGATATCGAAC-3'；R1：5'- CCCAAGCTTTCAGTCGTTGCGCAGT-3'，两端分别带有NdeI和HindIII限制性酶切位点。

[0038] 易错PCR反应体系如下：10* PCR buffer 2.5μL，10mM dGTP 0.5μL，10mM dTTP 0.5μL，10mM dCTP 2.5μL，10mM dATP 2.5μL，1mM MnCl2 2.5μL，55mM MgCl2 2.5μL，10μM F1 
1μL，10μM R1 1μL，Template（10ng/μL） 1μL，Taq DNA polymerase（5U/μL，takara） 0.2μL，ddH2O 补至 25μL。

[0039] 易错PCR在Bio-Rad T100 thermal cycler上进行，PCR程序如下：94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃1 5 min，30个循环；72℃ 10min；15℃ forever。

[0040] 将上述PCR反应液进行1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收1200bp大小的片段（具体操作见天根生化科技（北京）有限公司琼脂糖凝胶回收试剂盒操作规程），并经限制性内切酶NdeI和HindIII酶切后，与经过同样双酶切的pET29a（+）（Novagen）载体进行连接，并转化BL21（DE3）（购自天根生化科技（北京）有限公司），于37℃倒置过夜培养后，即得到酰基转移酶突变体库，长出的单克隆用于活性筛选。

[0041] 实施例3 突变体库的活化和诱导表达

[0042] 从上述培养过夜的平板上挑取单克隆至装有1mL 含终浓度为50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基的96深孔板中，于37℃、220rpm振荡培养过夜。次日，从上述过夜培养的96空板中吸取100μL 培养液，加入到新鲜的1mL 含终浓度为50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基的96深孔板中，37℃、220rpm振荡培养4h后，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导，随后在30℃继续培养20h。一共挑取了400个单克隆，用于活性筛选。

[0043] 将上述诱导后的菌液在4℃、4000rpm离心15min，弃上清。菌体用100μL 50mM 磷酸钠缓冲液（pH7.0）悬浮，加入终浓度为0.5g/l的溶菌酶，于37℃处理1h， 4℃、4000rpm离心30min，取50μL上清转移至新的96孔板，用作活性筛选的模板。

[0044] 实施例4 HPLC法测定辛伐他汀含量

[0045] 色谱柱ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为甲醇/水（梯度：75%甲醇升至95%甲醇，15min），流速1.0ml/min；检测波长238nm；柱温30℃。以Monconlin J、 DMB-S-MMP和辛伐他汀标准品为对照。

[0046] 实施例5 突变体的活性筛选

[0047] 在上述含50μL突变体酶上清的96孔板中，依次加入10%DMSO，5mmol Monconlin J和10mmol DMB-S-MMP，于30℃反应30min，然后在100℃处理10min灭活酶，4000rpm离心10min，取上清稀释10倍后进行HPLC检测，以辛伐他汀的生成量来筛选突变体，野生型酶生成的辛伐他汀作为对照。

[0048] 经HPLC分析发现，有1个突变体的辛伐他汀的生成量要明显高于野生型对照，该突变体编号为克隆280号。随后将这个克隆进行扩大培养，以验证其活性是否显著提高。

[0049] 实施例6 酶突变体的扩大培养和活性验证

[0050] 将突变体克隆280号接种到5mL 含终浓度为50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基的试管中，37℃、220rpm振荡培养过夜。次日，按1%比例转接到100mL 含终浓度为50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养3～4h，加入终浓度为1mM的IPTG，随后在30℃、200rpm诱导过夜。

[0051] 诱导后的菌液于4℃、8000rpm离心10min，菌体用20mL pH7.0 50mM 磷酸钠缓冲液洗涤两次后，加入10mL pH7.0 50mM 磷酸钠缓冲液进行悬浮。随后在冰浴条件下进行超声破碎（超声功率200W，超声3S/间歇5S，超声10min）。超声后的样品在4℃、12000rpm离心20min，上清进行冷冻干燥，得到冻干粉用作活性检测。

[0052] 反应条件同例5，HPLC检测条件同实施例4，冻干粉用缓冲液溶解成1mg/mL浓度，反应体系为100mL。结果显示，克隆280号生成的辛伐他汀的量要显著高于野生型酶生成的产物的量，活性约为野生型的12倍。

[0053] 随后将这三个克隆送测序，并与野生型DPE 氨基酸序列进行比对，发现克隆280携带D161N、Y163F、G180S、A235S四个突变（如SEQ ID NO.3所示，其基因序列如SEQ ID NO.4所示）。其中，D161N代表第164位的氨基酸残基从天冬氨酸变成天冬酰胺，Y163F代表第163位氨基酸残基从酪氨酸变成苯丙氨酸，G180S代表第180位氨基酸残基从甘氨酸变成丝氨酸，A235S代表第235位氨基酸残基从丙氨酸变成丝氨酸。

[0054] 实施例7：生物酶的发酵制备

[0055] 本发明所应用

[0056] A）摇瓶发酵

[0057] 摇瓶种子培养基成分：酵母提取物：5g/L；蛋白胨：10g/L，NaCl：10g/L；卡那霉素（简称卡那）50ug/ml。

[0058] 摇瓶种子培养基制备：取5g酵母粉提取物，10g蛋白胨，10gNaCl，溶解在800ml蒸馏水中，调节pH到7，用蒸馏水定容至1000ml，121℃保持15min，在121℃保持15min，溶液冷却到60℃以下后加入卡那至终浓度50ug/ml。

[0059] 发酵步骤：

[0060] 取原种菌种在LB平板上划线，37℃，倒置培养过夜。在平板上挑取单克隆接种于至3ml种子培养基（10ml试管）中，37℃，200rpm振荡培养16-20小时后OD600长到0.5-1。以1%接种量接种至300ml种子培养基（1L三角瓶）中，37℃，200rpm振荡培养4-8小时后OD600长到1-
2。

[0061] B）发酵培养

[0062] 培养基分为发酵培养基和流加培养基

[0063] 发酵培养基为M9培养基成分如下：Na2HPO4 6 g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4▪7H2O 0.246g/L，(NH4)2SO4 2.24 g/L，NaCl 0.5g/L，葡萄糖20g/L。

[0064] 发酵培养基配置：Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4▪7H2O、(NH4)2SO4、NaCl、葡萄糖搅拌溶解，121℃下保持30min，冷却后待用，卡那霉素采用无菌膜过滤除菌。。然后将无菌的卡那霉素加入发酵培养基中。

[0065] 流加培养基成分如下：葡萄糖600g/L

[0066] 流加培养基配置：葡萄糖加水溶解，115℃保持30min，冷却后待用。

[0067] 发酵罐发酵控制

[0068] 整个过程控制DO 20%以上，通风比为1:1-4（VVM），发酵培养控温37℃，pH7.0，培养8小时溶氧突变，开始补料，OD600=30左右诱导，IPTG终浓度为1mM，诱导温度控制30℃，培养
21小时放罐。

[0069] C）发酵液处理和酶制备

[0070] 发酵完毕后，将发酵液送入离心机进行菌液分离，浓缩菌体使用均质机破碎，菌液浓度控制在50～200g/L，破碎压力控制在30～60Mpa，细胞破碎液离心后获得上清，上清经过超滤浓缩后，得到酶液，进行冻干后，获得酰基转移酶干粉。

[0071] 实施例8：酶催化合成辛伐他汀方法，包括如下步骤：

[0072] （1）合成辛伐他汀侧链：向反应釜中加入3-巯基丙酸甲酯、乙酸乙酯、三乙胺、上述制备的酰基转移酶；开启搅拌，降温至0～5℃，滴加2,2-二甲基丁酰氯，合成辛伐他汀侧链；

[0073] （2）酰基转移酶催化合成反应：向反应釜中加入莫那克林酸、上述步骤中所述的辛伐他汀侧链、酸性溶液，控制反应体系pH值在9.0～10.0；加入上述的酰基转移酶，温度控制在25～45℃，搅拌反应48～60h；将反应液过滤；过滤完毕，温度控制在30～50℃，减压，真空度≤-0.09MPa，干燥，得中间体；

[0074] （3）辛伐他汀粗品制备：将上述步骤制得的中间体加入二氯甲烷中溶解；温度控制在0～25℃下，往滤液中滴加入二氯甲烷与甲烷磺酸混合溶液；滴加完毕，温度控制在0～25℃搅拌1～4h；反应完毕，将反应液温度调至25～45℃，减压浓缩至固体，得到辛伐他汀粗品。

[0075] 本实施例中，所述酸性溶液为盐酸、硫酸、醋酸中的一种。

[0076] 本发明采用新型酰基转移酶的生物酶活为野生型酶的12倍，合成转化率达到75%。该酰基转移酶热稳定性和贮存稳定性更好，活性高，将该酶应用于生产辛伐他汀，而且反应环境友好，生产成本低，转化时间短、工艺操作简单，反应体系杂质含量低，提高产率，易后处理，具有大规模工业应用的广泛前景。