FBN1基因在制备检测先天性单纯性晶状体异位制品中的应用

摘要

本发明的目的是提供一种FBN1基因在制备检测先天性单纯性晶状体异位诊断制品中的应用，本发明提供了FBN1基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行先天性单纯性晶状体异位疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行FBN1基因突变位点的快速检测。

权利要求

1.检测FBN1基因的试剂在制备用于检测先天性单纯性晶状体异位诊断制品中的应用，其特征在于，所述的检测FBN1基因的试剂，是检测FBN1基因与先天性单纯性晶状体异位疾病相关的SNP位点，所述的SNP位点为FBN1基因c.2420至IVS20-8位的碱基，为缺失TCTGAAACA而插入CGAAAC。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测，是通过引物对扩增待检测的样品，进行测序确定是否存在所述的SNP位点。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的引物对，其序列的信息如下：FBN1-2F: AGAAGGCGGGAGGAGCC             SEQ ID NO:1FBN1-2R: CTTGCCAAGGAGTCTTCCAC          SEQ ID NO:2FBN1-3F: TTGGCCATCTCTTCCTCTTC           SEQ ID NO:3FBN1-3R: GCCACATTCTAAGGCTCCC            SEQ ID NO:4FBN1-4F: ctcattTGAGGATTGGTCCC            SEQ ID NO:5FBN1-4R: TGCAGGAAAGAGGAAAGCC           SEQ ID NO:6FBN1-5F: CAACTCCTGTGAGCTGTTGC           SEQ ID NO:7FBN1-5R: GAAAATCCATCAGCACTTATCTC       SEQ ID NO:8FBN1-6F: TCCTTCCAGAGGACCACAAG          SEQ ID NO:9FBN1-6R: GTAGCCATGCAGACCCAATG          SEQ ID NO:10FBN1-7F: TTCCTCTGCATGATGGTTCC           SEQ ID NO:11FBN1-7R: TGGCTCTCCAGAGCAAATAAG         SEQ ID NO:12FBN1-8F: TGATGGACAAATAACTCACCG          SEQ ID NO:13FBN1-8R: TTCACAGGGATGACAAAGACAG        SEQ ID NO:14FBN1-9F: GAGTCCTTCTACTGACGAATGG        SEQ ID NO:15FBN1-9R: GAAAGTTGTTTGTTATGGAACTGAC     SEQ ID NO:16FBN1-10F: GAAGTATGGAGCTGCTCGG           SEQ ID NO:17FBN1-10R: GGCTTGTGAGGGCTGGG             SEQ ID NO:18FBN1-11F: ATGGGAATCCAGTCAGTTGG        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说明书

FBN1基因在制备检测先天性单纯性晶状体异位制品中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种原纤维蛋白1(FBN1)在制备检测先天性单纯性晶状体异位基因诊断制品中的应用。

[0002] 发明背景

[0003] 先天性单纯性晶状体异位以晶状体悬韧带部分或全部缺损或离断，引起对晶状体的悬挂力不平衡或丧失，导致晶状体离开正常的生理位置为特征。有较明显的遗传倾向，多为常染色体显性遗传，少数为常染色体隐性遗传，常为双眼对称性发病。根据悬韧带缺损或离断的程度(部分或完全)，晶状体异位分为不全脱位和全脱位。晶状体不全脱位产生的症状取决于晶状体移位的程度。如果晶状体的轴仍在视轴上，则仅出现由于悬韧带松弛、晶状体弯曲度增加引起的晶状体性近视。如果晶状体轴发生水平性、垂直性或斜性倾斜，可导致用眼镜或接触镜难以矫正的严重散光。更常见的不全脱位是晶状体纵向移位可出现单眼复视。晶状体全脱位比不全脱位后果更严重，晶状体完全离开瞳孔区后，视力相当于无晶状体眼视力，前房变深虹膜震颤，脱位的晶状体早期可随着体位的改变发生移动。如果晶状体脱入前房，则沉于变深的前房下方。晶状体通过瞳孔脱入前房过程中可发生瞳孔阻滞，引起急性青光眼。更常出现晶状体反复与角膜及虹膜睫状体接触引起严重的虹膜睫状体炎、角膜营养不良和急性青光眼。

[0004] 晶状体异位的治疗是困难的。因为摘除异位的晶状体比一般白内障摘除风险大，盲目手术可能导致视力的损害甚至眼球的丧失。因此应慎重决定治疗方案。晶状体异位的治疗取决于晶状体的位置、晶状体的硬度、患眼的视力和对侧眼的视力、年龄、有无先天异常、有无出现并发症及手术的条件等。晶状体异位造成视力下降的原因是多方面的，如屈光间质混浊、继发性青光眼、先天性眼底异常等，因此晶状体摘除术后并不一定能改善视力。建立先天性单纯性晶状体异位的相关的基因突变检测系统，并应用于临床工作和优生优育，有助于遗传性先天性单纯性晶状体异位的基因诊断和相应的基因治疗，有助于突变基因携带者的检出，有助于通过产前检查降低疾病的发生率，有助于有效地控制这种疾病的发生。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种FBN1基因在制备检测先天性单纯性晶状体异位诊断制品中的应用，从而弥补现有技术的不足。

[0006] 申请人从一个4代呈常染色体显性遗传的先天性单纯性晶状体异位家系中，对该家系全部成员进行了FBN1基因的测序，找到了该家系的致病基因FBN1存在遗传上的致病突变，从而促成了本发明。

[0007] 本发明首先提供FBN1基因新的用途，是在制备用于检测先天性单纯性晶状体异位诊断制品中的应用；

[0008] 所述的检测，是用于检测FBN1基因上与先天性单纯性晶状体异位疾病相关的SNP位点，为FBN1基因c.2420(E21)至IVS20-8位的碱基。

[0009] 上述的诊断制品，作为实施例的优选，是检测先天性单纯性晶状体异位的引物或探针。

[0010] 所述的检测，是通过引物对扩增待检测的样品，进行测序确定是否存在上述的SNP位点；

[0011] 所使用的引物对，其引物信息如下：

[0012]

[0013]

[0014]

[0015]

[0016]

[0017] 本发明还提供一种用于检测先天性单纯性晶状体异位的试剂盒，包含有上述的引物对中一种或以上。

[0018] 其中用于检测上述SNP位点的引物信息如下：

[0019] FBN1-21-22F:AGCCCAGCTTTACTGTGTGG      SEQ ID NO:39

[0020] FBN1-21-22R:TTTGACACTTCTTATTTCCCATTC  SEQ ID NO:40。

[0021] 本发明提供了FBN1基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行先天性单纯性晶状体异位疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行FBN1基因突变位点的快速检测。

附图说明

[0022] 图1：实施例1的先天性单纯性晶状体异位家系内患者FBN1测序图，其中第一列：参考序列；第二列：先证者序列。该家系中6名患者FBN1基因c.2420(E21)至IVS20-8:缺失TCTGAAACA插入CGAAAC。

具体实施方式

[0023] 申请人在一个先天性单纯性晶状体异位家系中发现FBN1基因的突变位点，并证实该基因的突变是该病的致病基因，从而促成了本发明。

[0024] FBN1基因位于染色体15q21.1，可转录成大约11695bp的mRNA(NCBI登录号为NM_000138)，直接翻译形成2871个氨基酸组成的蛋白质。

[0025] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

[0026] 实施例1：从先天性单纯性晶状体异位家系中筛选FBN1基因的突变位点[0027] 1、提取外周血基因组DNA：

[0028] 在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取家系成员外周静脉血2-5ml，放入EDTA抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μL放于离心管，加入等体积TE(pH8.0)，混匀，4℃，10000rpm离心10分钟，弃上清。

[0029] 加入180μL TE、20μLSDS(10％)、8μL蛋白酶K(l0mg/ml)混匀，置于37℃水浴过夜。从水浴中取出样品，瞬时离心沉淀样本。在反应管中加入等体积的Tris-饱和酚(约300μL)，充分混匀，室温下10000rpm离心10分钟，吸取上清液(约300μL)至一新离心管中。重复酚抽提一次，吸取上清液至一新离心管中。

[0030] 加入等体积的Tris饱和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。

[0031] 加入等体积的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇混合液(酚、氯仿、异戊醇各100μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。

[0032] 加入l/10体积3mol/L、pH5.2醋酸钠(约30μL)，2倍体积预冷100％乙醇，轻轻混合，可见白色絮状沉淀。室温10000rpm离心10分钟，使DNA沉淀于管底，弃上清。

[0033] 向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室温7000rpm离心5分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μL TE(pH8.0)，4℃过夜溶解DNA。

[0034] 对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA纯度及浓度。

[0035] 2、直接测序法寻找该家系内患者FBN1基因的突变

[0036] PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：

[0037] (1)PCR反应条件：94℃3min；94℃40sec，53℃40se，72℃60sec，30-35cycles；72℃10min。

[0038] (2)反应体系：(TAKARA LA Taq polymerase)

[0039]

[0040] 应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板与该FBN1引物的扩增反应。

[0041] PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，其中应用引物对[0042] FBN1-21-22F:AGCCCAGCTTTACTGTGTGG，FBN1-21-22R:TTTGACACTTCTTATTTCCCATTC，在该家系中六名患者FBN1基因c.2420(E21)至IVS20-8:缺失TCTGAAACA插入CGAAAC(图1)。多次测序结果表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引进的。该突变为一新生突变。该突变不存在于下面的四个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因组计划(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，Hapmap8数据库(http://
hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)，表明该突变非常罕见，经预测该突变导致了FBN1蛋白长度截短，从而引起了患者先天性单纯性晶状体异位的发生。而在200例正常当地人群的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。

[0043] 通过上述的分析，证明FBN1基因可以用来检测患者是否具有潜在患先天性单纯性晶状体异位的危险。通过将检测者的FBN1基因的各外显子片段于正常的对应片段比较，确定待检测者的患病风险。

[0044] 根据FBN1的基因组序列设计扩增其各外显子的引物对，其正反引物的序列信息如下：

[0045] FBN1-2F:AGAAGGCGGGAGGAGCC

[0046] FBN1-2R:CTTGCCAAGGAGTCTTCCAC

[0047] FBN1-3F:TTGGCCATCTCTTCCTCTTC

[0048] FBN1-3R:GCCACATTCTAAGGCTCCC

[0049] FBN1-4F:ctcattTGAGGATTGGTCCC

[0050] FBN1-4R:TGCAGGAAAGAGGAAAGCC

[0051] FBN1-5F:CAACTCCTGTGAGCTGTTGC

[0052] FBN1-5R:GAAAATCCATCAGCACTTATCTC

[0053] FBN1-6F:TCCTTCCAGAGGACCACAAG

[0054] FBN1-6R:GTAGCCATGCAGACCCAATG

[0055] FBN1-7F:TTCCTCTGCATGATGGTTCC

[0056] FBN1-7R:TGGCTCTCCAGAGCAAATAAG

[0057] FBN1-8F:TGATGGACAAATAACTCACCG

[0058] FBN1-8R:TTCACAGGGATGACAAAGACAG

[0059] FBN1-9F:GAGTCCTTCTACTGACGAATGG

[0060] FBN1-9R:GAAAGTTGTTTGTTATGGAACTGAC

[0061] FBN1-10F:GAAGTATGGAGCTGCTCGG

[0062] FBN1-10R:GGCTTGTGAGGGCTGGG

[0063] FBN1-11F:ATGGGAATCCAGTCAGTTGG

[0064] FBN1-11R:TGCAATAGGAAAATTGAGACATAC

[0065] FBN1-12F:CCTCTTTCCTTTCTGATTCAAC

[0066] FBN1-12R:GCAATAGAAAACCAGTAGAGTCAAGG

[0067] FBN1-13F:GAAAGTCTTAGAATTATGAGGTATTGC

[0068] FBN1-13R:AACTCCTTTGAAGCCAACCC

[0069] FBN1-14F:AGTTTGCAAATGGAGGGAG

[0070] FBN1-14R:TCACTCATTATTTGGTCTTGTTAAAG

[0071] FBN1-15F:ATCCAGATTGGTTTCCTTCG

[0072] FBN1-15R:ACCTCTAAACAACATAAGGAGGAG

[0073] FBN1-16F:TCCTATCTTCCCCATTTTCAAG

[0074] FBN1-16R:CCATTGGGCTTTATTGAGTG

[0075] FBN1-17F:GCCCTCTTCAACTTTGACTTG

[0076] FBN1-17R:AAAGACCTCAATGGTGGCAG

[0077] FBN1-18F:AAGGGCAGGATCTACCTGTTC

[0078] FBN1-18R:ACCCACAAGAAAGCCTGATG

[0079] FBN1-19F:TCCTCCTGTAGCTCCTAAGGTC

[0080] FBN1-19R:AAGTGTCCATTTGCCCAGTC

[0081] FBN1-20F:AAGTAGATACAGGCAAAGTTTGGG

[0082] FBN1-20R:TGGCATAACTGTCTAAAATACAGGAG

[0083] FBN1-21-22F:AGCCCAGCTTTACTGTGTGG

[0084] FBN1-21-22R:TTTGACACTTCTTATTTCCCATTC

[0085] FBN1-23F:TGTCAGAACTGCAAAGTCTGG

[0086] FBN1-23R:TGACAGCTTTATCCAGTCCG

[0087] FBN1-24F:TTACCAGGTTCAAAATGGGG

[0088] FBN1-24R:TGTCTGTACCTGAAGCTAAGTGC

[0089] FBN1-25F:CAGAGTGTTGGCAGTTTGGG

[0090] FBN1-25R:CCATGCTGGGATGATCAAG

[0091] FBN1-26-27F:GAGACCTCCTGACTGCTTGC

[0092] FBN1-26-27R:CAGCAGGAAGAACCTGGAAC

[0093] FBN1-28-29F:GTCTGGTGGAGGAGATGAGG

[0094] FBN1-28-29R:TCAGAGTACATAGAGTGTTTTAGGGAG

[0095] FBN1-30F:GGCCCTGCCTCTTAAATAGTG

[0096] FBN1-30R:AAGCCTGCTTGACTCCAAAG

[0097] FBN1-31F:GGCTAAGTTTATTTGACTGCGG

[0098] FBN1-31R:TGGAATCTTTCTATCACTGACCC

[0099] FBN1-32F:CTAAACTCAGCATGGAGCCC

[0100] FBN1-32R:GAAGGGCCATGAATATTTGG

[0101] FBN1-33-34F:ATGGGAAGTTTGAAGGCAAG

[0102] FBN1-33-34R:TGAGAAATGTGGAATGCCTG

[0103] FBN1-35F:TTATGCCAAAACATTGCTGC

[0104] FBN1-35R:AAATGAAGCTAAAACACACCTCAG

[0105] FBN1-36F:GCCCAGATTGGTGTTAGATACTC

[0106] FBN1-36R:CTTGTGTAGTCCCAGGGAGG

[0107] FBN1-37F:TGATGTCTGCCTACACTGGC

[0108] FBN1-37R:GGTGCTGTTTTCAAAATAATACACAG

[0109] FBN1-38F:TGAACAGTTCCTGAAGTGGG

[0110] FBN1-38R:GAAAGGAGAACTGGCTGGAG

[0111] FBN1-39-40F:TCAGACGGGCAGAGTAACAAC

[0112] FBN1-39-40R:GGTTTTGCAGGTCAGTTCTTG

[0113] FBN1-41F:GGCCATTCCAAAATGTGAAG

[0114] FBN1-41R:TGAACTTGTGAGCTCTCTTCCTC

[0115] FBN1-42F:GATTTCCCACATGGCATCAC

[0116] FBN1-42R:TCGCTAAGACTGATTTCCCC

[0117] FBN1-43F:GACAAATACCTTTCAAGAATGCTTAC

[0118] FBN1-43R:GGTGTTTGCACAGTTTGTTTC

[0119] FBN1-44F:CCATCTTGTCTTACCCTGCAC

[0120] FBN1-44R:GCCAAGTGTGTATCAAGTAGCTC

[0121] FBN1-45F:GGCTTTGTTGACTGGACACC

[0122] FBN1-45R:TGAAAATATCTCATCCAGAAAGAGG

[0123] FBN1-46F:CTCCTGAGAATGATAGCTAGAAGTAAG

[0124] FBN1-46R:ATCCATATTTAGAATCAAATGAAGC

[0125] FBN1-47F:CCTGGTGAACCCTAAAATGC

[0126] FBN1-47R:GCACATTGTATTTGACAAGTCCC

[0127] FBN1-48F:TGCTGGGATTATGACATCTTTG

[0128] FBN1-48R:AGACTGCATGATTCCTTGAGTG

[0129] FBN1-49F:TTTGATGGAAGTCATGCCAG

[0130] FBN1-49R:CCTTGCATTTGTTTCTGATAAAG

[0131] FBN1-50F:CCCTTTGTGTGTCCACATTG

[0132] FBN1-50R:TCTTCCTGTTCACAAAGAAACAG

[0133] FBN1-51F:TTTGCTATGGTGCAATACGG

[0134] FBN1-51R:TTACATCATGGCCAGTCTGC

[0135] FBN1-52-53F:GCACAGCATGTAGCAATTTTC

[0136] FBN1-52-53R:AACTTATTTCAGTGCCATCTTGG

[0137] FBN1-54F:AACAAAATTACAGTTTAAAATCCTCTG

[0138] FBN1-54R:ATCAACCAATTGTTCCCAGG

[0139] FBN1-55F:GGTTCCCTTTTGTTGCTGTC

[0140] FBN1-55R:AGGGACATCTCCCCTCACAG

[0141] FBN1-56F:AGCAGAAGGAAATACAGCCAG

[0142] FBN1-56R:ATCCCAAGAACTCAGAGCCC

[0143] FBN1-57F:TCCATCCTCTATAAAATGGTCAG

[0144] FBN1-57R:AAGTCTGGGTTTCCAGCATC

[0145] FBN1-58F:TTCTCACCCAGGGTAAAGTG

[0146] FBN1-58R:GTGCAATTCAACCTAGGCAC

[0147] FBN1-59-60F:TTAGTATTTACACTGAAGTGACCCC

[0148] FBN1-59-60R:AATGCAGCCATGTGTCAGG

[0149] FBN1-61F:GCTTCCCTGATCCTGTTTTG

[0150] FBN1-61R:TCCCAACAGCAGAGGAAATAG

[0151] FBN1-62F:CTTATTTGGCCTTTTCCGAG

[0152] FBN1-62R:TGATGAAGGTGCCAATAGCC

[0153] FBN1-63F:AGAATCCATCTGGCTTCAGAG

[0154] FBN1-63R:AGCAAGCAGTGTTTTGCTTC

[0155] FBN1-64F:GGCCAGATCCAATGTCCTC

[0156] FBN1-64R:TCTGCTAGGACAGGTAATTTTGAG

[0157] FBN1-65F:ACCACCTACCTTGTCTTCCC

[0158] FBN1-65R:TGGAGGAAACCACAGGAATC

[0159] FBN1-66F:GCAGCATAAGGCAGAAAATTG

[0160] FBN1-66R:TGATATGATGATTCTGATTGGG

[0161] 分别应用上述的每一对引物进行FBN1基因的检测。

[0162] 另在山东地区收集诊断明确的先天性单纯性晶状体异位散发患者一名，提取其外周血基因组DNA，应用该患者的DNA模板与FBN1-21-22F和FBN1-21-22R引物进行PCR扩增，应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，该患者的FBN1基因存在本发明中发现的SNP突变，即FBN1基因c.2420(E21)至IVS20-8:缺失TCTGAAACA插入CGAAAC。通过上述的分析，证明FBN1基因可以用来检测患者是否具有潜在患先天性单纯性晶状体异位的危险。通过将检测者的FBN1基因的扩增片段于正常的对应片段比较，确定待检测者的患病风险。