一种用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液及其制备方法

摘要

本发明属于临床医学病理技术领域，具体涉及一种用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液及其制备方法。其包括以下成分及其浓度：NaCl 60‑100mmol/L、KCl 2‑10mmol/L、乙二胺四乙酸二钠1‑5mmol/L、尿素30‑50mmol/L、柠檬酸钠1‑5mmol/L、蔗糖5‑20mmol/L、PEG‑400 4‑10mmol/L、多聚甲醛2％‑3％、甘油2‑10mmol/L和二硫苏糖醇10‑20mmol/L。本发明保存液不仅适用于传统的液基细胞制片、染色，还适用于宫颈液基细胞p16INK4a蛋白免疫标记染色，避免了传统非特异性巴氏染色的缺陷。

权利要求

1.一种用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液，其特征在于，由以下成分及其浓度组成:NaCl 60-100mmol/L、KCl 2-10mmol/L、乙二胺四乙酸二钠1-5mmol/L、尿素30-

50mmol/L、柠檬酸钠1-5mmol/L、蔗糖5-20mmol/L、PEG-400 4-10mmol/L、多聚甲醛2％-3％、甘油2-10mmol/L和二硫苏糖醇10-20mmol/L，余量为纯化水；调节pH值至7.5-8.0。

2.根据权利要求1所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液，其特征在于，包括以下成分及其浓度：NaCl 75-90mmol/L、KCl 6-8mmol/L、乙二胺四乙酸二钠3-4mmol/L、尿素40-45mmol/L、柠檬酸钠2.5-4mmol/L、蔗糖12-17mmol/L、PEG-400 5.6-8.4mmol/L、多聚甲醛2％-3％、甘油7.5-9mmol/L和二硫苏糖醇13-18mmol/L。

3.根据权利要求1所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液，其特征在于，包括以下成分及其浓度：NaCl 85mmol/L、KCl 7.5mmol/L、乙二胺四乙酸二钠3.5mmol/L、尿素

42mmol/L、柠檬酸钠3.6mmol/L、蔗糖16mmol/L、PEG-400 6.5mmol/L、多聚甲醛2％、甘油

8.4mmol/L和二硫苏糖醇16.5mmol/L。

4.根据权利要求1-3任一所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.准确称取NaCl、KCl和尿素，依次溶于纯化水中，搅拌使其全部溶解，得溶液I；

S2.准确称取乙二胺四乙酸二钠并溶于纯化水中，加热使其完全溶解后冷却至室温，得溶液II；

S3.准确称取柠檬酸钠、蔗糖溶于纯化水中，搅拌使其全部溶解，得溶液III；

S4.将上述溶液I、溶液II和溶液III混合均匀后，然后加入PEG-400、多聚甲醛和甘油，搅拌使其混合均匀，得溶液IV；

S5.将上述溶液IV调节pH值至7.5-8.0，得溶液V；

S6.向上述溶液V中添加二硫苏糖醇，搅拌使其完全溶解，即得。

5.根据权利要求4所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中用乙酸/NaOH调节pH值至7.8。

说明书

一种用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液及其制备

方法

技术领域

[0001] 本发明属于临床医学病理技术领域，具体涉及一种用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液及其制备方法。

背景技术

[0002] 宫颈癌是妇科最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌，位居女性恶性肿瘤第二位，严重威胁着女性的身体健康和生活质量。中国是宫颈癌的高发国家，发生率及死亡率约占全世界的1/3。宫颈癌也是目前唯一病因明确，通过有效的早期诊断及治疗可以完全治愈的癌症。

[0003] 当前宫颈癌及癌前的病变的早期诊断分为“三阶梯”。第一步为阴道脱落细胞学检查，筛查出可疑病例。第二步为阴道镜检查，在阴道镜下对可疑病例取活检组织。然后进行第三步活体组织检查，最终确诊。做为宫颈癌及癌前病变诊断的第一步，阴道脱落细胞学检查起着非常重要的门户作用，当前脱落细胞学的主要检查技术为液基薄层制片技术。液基薄层细胞制片术改良自传统“巴氏涂片法”，使用独特的细胞保存液和液基薄层制片机器，代替传统巴氏的手工涂片法，可制出均匀薄层的细胞有利于病理医院镜下观察，降低了传统巴氏的漏诊率和假阳性、假阴性率。

[0004] 然而液基薄层细胞制片术采用的依旧是非特异性的巴氏/HE染色，并未从根源上弥补细胞学检查的技术缺陷。受取材、染色、及病理医生的主观判断等因素的影响，仍存在假阴性率高、灵敏度和特异性不理想等缺点。特别是对病理医生的要求较高，且我国病理医生缺乏、病理医生的工作量大，易出现人为因素导致漏检的情况。

[0005] 寻找新的灵敏度和特异度更好的分子生物标志物用于宫颈癌的早期诊断具有重要意义。

[0006] 液基细胞学的技术缺陷促进了宫颈癌及癌前病变筛查辅助技术的发展，当前主要的辅助筛查技术为HPV检测，目前HPV的检测方法有多种，灵敏度和特异度较高的有杂交捕获二代检测系统(HC-II)、荧光定量PCR技术等。

[0007] 研究己揭示高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的持续感染是导致宫颈癌的主要原因。目前已知的HPV亚型有近200种，大多数不会引起宫颈癌，只有14种高危型，是引起宫颈癌的主要原因。女性的一生中，感染HPV的风险超过50％，而这些感染者有90％以上可在一至两年内通过人体自身的免疫力清楚掉HPV，即转阴自愈。因而HPV检测作为一个筛查指标明显缺乏特异性，易导致病人的心理恐慌和过渡医疗。且HPV分子生物学检测技术对实验环境和人员的要求较高，检测价格较贵，限制了其在临床上的广泛应用。

[0008] 已知宫颈癌发生的主要原因是持续性的人乳头瘤病毒(HPV)感染(99％以上)。HPV的持续感染会导致病毒的致癌基因蛋白E6和E7含量升高，E6和E7作用是可分别与人体抑癌基因蛋白p53和pRB结合，E6通过抑制P53而阻断凋亡，E7通过抑制pRB使细胞周期失控，并导致p16INK4a表达上调。

[0009] 任力等人在“p16INK4a和人乳头瘤病毒检测在液基细胞学筛查宫颈病变中的应用”中通过选取8933名宫颈炎患者进行液基薄层细胞学检查，其中有64例呈不良反应，应用免疫组织化学SP方法检测其p16INK4a表达，同时采用实时定量PCR法检测HPV表达，实验结果证明的p16INK4a表达与宫颈癌的发生、发展相关，并与宫颈病变分级及HPV感染高度相关，是筛查液基细胞学组织标本宫颈病变的一个有用指标(任力，狄文，何以丰等.P16～(INK4A)和人乳头瘤病毒检测在液基细胞学筛查宫颈病变中的应用[J].诊断学理论与实践，2008，7(1):80-82.)

[0010] 韩雪松等人在“宫颈薄层液基细胞中p16INK4a的表达在宫颈癌筛查中的意义”中通过选择96例HPV阳性的宫颈液基层细胞学剩余标本，制作液基薄片，利用SP免疫组化法检测LCT标本中p16蛋白，并与组织活检结果进行对照，最终结果证明，p16蛋白异常表达与宫颈上皮内瘤病变的发生有关，其可以作为宫颈上皮内瘤的标志物，辅助细胞学筛查(韩雪松，INK4a王钫，徐琳等.宫颈薄层液基细胞中p16 的表达在宫颈癌筛查中的意义[J].中国实验诊断学，2011，15(4):656-659.)

[0011] 目前，p16INK4a做为高危HPV的代表和宫颈癌前病变的发展密切相关，具有较高的特异性和灵敏度，在宫颈组织活检样本中，已经得到普遍被认可与应用。

[0012] 液基细胞p16INK4a免疫标记染色即是利用p16INK4a蛋白抗原与抗体的特异性结合原理，可从根本解决当前液基细胞学的非特异性染色问题，避免宫颈癌前筛查易受病理医生经验和人员缺乏等影响因素。

[0013] p16INK4a在细胞学中的应用，首先需要一种合适的细胞保存液，传统的液基细胞保存液具有裂解红细胞、稀释粘液、固定细胞等作用，可满足液基薄层的制技术的要求，然而所使用的化学试剂易导致p16INK4a抗原决定簇的封闭，对p16INK4a抗原不能起到很好的保护作用，易导致染色结果的假阴性。

发明内容

[0014] 为解决上述问题，本发明提供了一种用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液。本发明保存液不仅适用于传统的液基细胞制片、染色，还适用于宫颈液基细胞p16INK4a蛋白免疫标记染色，利用抗原抗体的特异性结合，为液基细胞学技术提供特异性的染色方法，避免了传统非特异性巴氏染色的缺陷。本发明还提供了用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液的制备方法。

[0015] 本发明通过以下技术方案实现的：

[0016] 一种用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液，包括以下成分及其浓度：NaCl 60-100mmol/L、KCl 2-10mmol/L、乙二胺四乙酸二钠1-5mmol/L、尿素30-50mmol/L、柠檬酸钠1-5mmol/L、蔗糖5-20mmol/L、PEG-400 4-10mmol/L、多聚甲醛2％-3％、甘油2-10mmol/L和二硫苏糖醇10-20mmol/L。

[0017] 优选地，所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液包括以下成分及其浓度：NaCl 75-90mmol/L、KCl 6-8mmol/L、乙二胺四乙酸二钠3-4mmol/L、尿素40-45mmol/L、柠檬酸钠2.5-4mmol/L、蔗糖12-17mmol/L、PEG-400 5.6-8.4mmol/L、多聚甲醛2-3％、甘油7.5-9mmol/L和二硫苏糖醇13-18mmol/L。

[0018] 优选地，所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液包括以下成分及其浓度：NaCl 85mmol/L、KCl 7.5mmol/L、乙二胺四乙酸二钠3.5mmol/L、尿素42mmol/L、柠檬酸钠3.6mmol/L、蔗糖16mmol/L、PEG-400 6.5mmol/L、多聚甲醛2％、甘油8.4mmol/L和二硫苏糖醇16.5mmol/L。

[0019] 一种用于液基层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液的制备方法，包括以下步骤：

[0020] S1.准确称取NaCl、KCl和尿素，依次溶于纯化水中，搅拌使其全部溶解，得溶液I；

[0021] S2.准确称取乙二胺四乙酸二钠并溶于纯化水中，加热使其完全溶解后冷却至室温，得溶液II；

[0022] S3.准确称取柠檬酸钠、蔗糖溶于纯化水中，搅拌使其全部溶解，得溶液III。

[0023] S4.将上述溶液I、溶液II和溶液III混合均匀后，然后加入PEG-400、多聚甲醛和甘油，搅拌使其混合均匀，得溶液IV；

[0024] S5.将上述溶液IV调节pH值至7.5-8.0，得溶液V；

[0025] S6.向上述溶液V中添加二硫苏糖醇，搅拌使其完全溶解，即得。

[0026] 优选地，所述步骤(5)中用乙酸/NaOH调节pH值至7.8，所述步骤(6)所得溶液pH为7.0-8.0。

[0027] 在本发明用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液中，NaCl和KCl作为渗透压稳定剂，能够有效维持体系渗透压；尿素作为红细胞处理剂，使本发明保存液中其无需添加裂解液即可将全部红细胞彻底清除，同时完美保存有诊断价值的各种有核细胞形态；二硫苏糖醇是本发明主要的粘液处理剂，其与其它成分有效结合，使本发明保存液分解粘液能力强，能够最大限度释放有诊断价值的细胞，并能防止堵塞膜孔。

[0028] 本发明使用多聚甲醛固定液代替了传统液基的乙醇/甲醇固定液，从而对p16INK4a抗原具有更好的保护效果；乙二胺四乙酸二钠是一种抗聚集试剂，能避免细胞堆积，PEG-400不仅能保护细胞骨架的完整性，防止细胞水肿，而且作为保湿增容剂，其还能够有效调和本发明保存液体系中其它成分，在本发明保存液体系浓度范围内，二者相互作用能够发挥很好的稳定和分散作用，保证保存液的稳定性。

[0029] 保存液体系中的化学物质往往容易导致p16INK4a抗原决定簇封闭，从而导致染色结果的假阴性。本发明保存液体系中添加有柠檬酸钠、蔗糖和甘油，其与本发明体系中其它成分共同作用，能够保护p16INK4a抗原决定簇不受其它化学试剂的影响而封闭。

[0030] 本发明保存液中各成分能够有效结合在一起，使本发明保存液与现有技术相比具有以下优势：

[0031] (1)本发明保存液在普通液基薄层制片中不仅能够很好的保存细胞的形态，对粘液样本和血液样本的也有很好的处理效果；

[0032] (2)本发明保存液不仅能保存细胞形态还能长时间保护p16INK4a抗原决定簇；

[0033] (3)本发明保存液成分简单、价格低廉、操作方便，大大节省了制备样品的时间，易于推广。

附图说明

[0034] 图1：本发明保存液对血液样本中的红细胞裂解情况；

[0035] 图2：本发明保存液对粘液样本中粘液、细胞形态的观察；

[0036] 图3：p16INK4a免疫标记阴性染色；

[0037] 图4：p16INK4a免疫标记阳性染色；

[0038] 图5：本发明保存液保存的细胞p16INK4a蛋白免疫标记染色；

[0039] 图6：CPS03细胞保存液保存的细胞p16INK4a蛋白免疫标记染色；

[0040] 图7：Thinprep保存液保存的细胞p16INK4a蛋白免疫标记染色。

具体实施方式

[0041] 下面将结合说明书附图和实施例进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

[0042] PEG-400购于无锡市千聚恒贸易有限公司；CPS03细胞保存液和Thinprep细胞保存液由本公司广州江元医疗科技有限公司提供。

[0043] 实施例1 一种用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液

[0044] 所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液，由以下成分及其浓度组成：NaCl 85mmol/L、KCl 7.5mmol/L、乙二胺四乙酸二钠3.5mmol/L、尿素42mmol/L、柠檬酸钠
3.6mmol/L、蔗糖16mmol/L、PEG-400 6.5mmol/L、多聚甲醛2％、甘油8.4mmol/L和二硫苏糖醇16.5mmol/L。

[0045] 所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液的制备方法，包括以下步骤：

[0046] S1.准确称取NaCl、KCl和尿素，依次溶于纯化水中，搅拌使其全部溶解，得溶液I；

[0047] S2.准确称取乙二胺四乙酸二钠并溶于纯化水中，加热使其完全溶解后冷却至室温，得溶液II；

[0048] S3.准确称取柠檬酸钠、蔗糖溶于纯化水中，搅拌使其全部溶解，得溶液III。

[0049] S4.将上述溶液I、溶液II和溶液III混合均匀后，然后加入PEG-400、多聚甲醛和甘油，搅拌使其混合均匀，得溶液IV；

[0050] S5.将上述溶液IV用乙酸/NaOH调节pH值至7.8，得溶液V；

[0051] S6.向上述溶液V中添加二硫苏糖醇，搅拌使其完全溶解，使溶液pH值为7.5，即得。

[0052] 实施例2 一种用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液

[0053] 所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液，由以下成分及其浓度组成：NaCl 60mmol/L、KCl 2mmol/L、乙二胺四乙酸二钠1mmol/L、尿素30mmol/L、柠檬酸钠1mmol/L、蔗糖5mmol/L、PEG-400 4mmol/L、多聚甲醛2％、甘油2mmol/L和二硫苏糖醇10mmol/L。

[0054] 所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液的制备方法与实施例1类似。

[0055] 实施例3 一种用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液

[0056] 所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液，由以下成分及其浓度组成：NaCl 100mmol/L、KCl 10mmol/L、乙二胺四乙酸二钠5mmol/L、尿素50mmol/L、柠檬酸钠
5mmol/L、蔗糖20mmol/L、PEG-400 10mmol/L、多聚甲醛2.5％、甘油10mmol/L和二硫苏糖醇
20mmol/L。

[0057] 所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液的制备方法与实施例1类似。

[0058] 实施例4 一种用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液

[0059] 所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液，由以下成分及其浓度组成：NaCl 75mmol/L、KCl 6mmol/L、乙二胺四乙酸二钠3mmol/L、尿素40mmol/L、柠檬酸钠
2.5mmol/L、蔗糖12mmol/L、PEG-400 5.6mmol/L、多聚甲醛3％、甘油7.5mmol/L和二硫苏糖醇13mmol/L。

[0060] 所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液的制备方法与实施例1类似。

[0061] 实施例5 一种用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液

[0062] 所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液，由以下成分及其浓度组成：NaCl 90mmol/L、KCl 8mmol/L、乙二胺四乙酸二钠4mmol/L、尿素45mmol/L、柠檬酸钠4mmol/L、蔗糖17mmol/L、PEG-400 8.4mmol/L、多聚甲醛2.3％、甘油9mmol/L和二硫苏糖醇18mmol/L。

[0063] 所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液的制备方法与实施例1类似。

[0064] 对比例1 一种用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液

[0065] 所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液，由以下成分及其浓度组成：NaCl 85mmol/L、KCl 7.5mmol/L、乙二胺四乙酸二钠3.75mmol/L、尿素42mmol/L、PEG-400 
6.5mmol/L、多聚甲醛2％和二硫苏糖醇16.5mmol/L。

[0066] 所述用于液基薄层细胞的免疫p16INK4a抗原保存液的制备方法与实施例1类似。

[0067] 与实施例1的区别在于，保存液中不含有柠檬酸钠、蔗糖及甘油。

[0068] 试验例1 液基薄层制片观察

[0069] 按照标准取样规程，用一次性宫颈刷刷取女性患者宫颈移形区的细胞样本(包含粘液较多样本和血液样本)，然后将取样刷放入本发明实施例1制备得到的保存液中保存细胞。用全自动沉降式制片机(JY-3200)进行自动制片和巴氏染色，然后显微镜下拍照，试验结果如图1，图2所示。

[0070] 由图1可知，经实施例1制备得到的保存液保存的血液样本中的红细胞被全部裂解，制片和染色后观察不会出现遮挡上皮细胞、干扰镜下观察现象。

[0071] 由图2可知，经实施例1制备得到的保存液保存的粘液较多的样本中粘液被打散，白细胞成均匀状态，制片和染色后观察不会出现遮挡上皮细胞、干扰镜下观察现象。

[0072] 由图1和图2可知，经实施例1制备得到的保存液在普通液基薄层制片中不仅能够很好的保存细胞的形态，对粘液样本和血液样本的也有很好的处理效果。

[0073] 试验例2 不同样本p16INK4a免疫标记染色观察

[0074] 按照标准取样规程，用一次性宫颈刷刷取女性患者宫颈移形区的细胞样本(包含组织学确诊的宫颈病变样本和无病变样本)，然后将取样刷放入本发明实施例1制备得到的保存液中保存细胞。用全自动沉降式制片机(JY-3200)进行自动制片、用组织染色机(JY-6000)进行p16INK4a免疫标记染色，然后显微镜下拍照，试验结果如图3、图4所示。

[0075] 由图3可知，p16INK4a免疫标记阴性染色，细胞形态清晰，无背景干扰；由图4可知，INK4a INK4ap16 免疫标记阳性染色，细胞形态清晰，阳性着色清晰易辨，p16 抗原保存较好。

[0076] 试验例3 宫颈癌细胞株SiHa p16INK4a免疫标记染色观察

[0077] 将宫颈癌细胞株SiHa分别在本发明实施例1制备得到的保存液、CPS03细胞保存液和Thinprep保存液中常温保存5天后进行液基薄层制片和p16INK4a蛋白免疫标记染色。结果如图5、图6及图7所示。

[0078] 由图5、图6及图7可知，发明实施例1制备得到的保存液保存的细胞p16INK4a蛋白免疫标记染色程度和效果明显优于CPS03细胞保存液和Thinprep细胞保存液。

[0079] 试验例4 不同保存液对保存细胞的影响观察

[0080] 将宫颈癌细胞株SiHa分别在本发明实施例1制备得到的保存液、CPS03细胞保存液、Thinprep保存液以及对比例1制备得到的保存液中常温保存5天后进行液基薄层制片和p16INK4a蛋白免疫标记染色，同时进行细胞形态观察，对p16INK4a蛋白免疫标记染色程度以及阳性染色细胞比例进行观察和统计分析，结果如表1所述。

[0081] 表1 不同保存液对保存细胞的影响观察

[0082]

[0083] 由表1可知，实施例1保存液不仅能保存细胞形态还能长时间保护p16INK4a抗原决定簇；CPS03保存液、Thinprep保存液及对比例1保存液仅能保存细胞的形态。实施例1与对比例1相比，说明在本发明保存液中柠檬酸钠、蔗糖和甘油的添加对p16INK4a抗原决定簇具有明显的保护作用。

[0084] 综上可知，本发明保存液不仅适用于传统的液基细胞制片、染色，还适用于宫颈液基细胞p16INK4a蛋白免疫标记染色，利用抗原抗体的特异性结合，为液基细胞学技术提供特异性的染色方法，避免了传统非特异性巴氏染色的缺陷。