肌红蛋白检测用试剂体系

摘要

本发明公开了一种基于时间分辨微球的肌红蛋白检测用试剂体系，包括以下组分：于缓冲溶液中加入0.05‑0.5wt％的标记有肌红蛋白抗体的时间分辨微球、0.1‑0.5wt％的牛血清白蛋白、0.1‑5wt％的聚乙烯吡咯烷酮、0.1‑1wt％核糖体蛋白S7、0.01‑0.5wt％吐温‑20。上述试剂体系与样品混合即能反应，操作简单；在试剂体系的作用下，标记抗体的时间分辨微球不会残留在样品垫上，也不会残留在样品垫和硝酸纤维素(NC)膜的结合处。试剂体系中的抗体与肌红蛋白反应的特异性高，灵敏度强，该检测体系的稳定性好、准确度高、精密度好，检测范围大。

权利要求

1.一种肌红蛋白检测试剂体系，其特征在于，包括以下组分：于缓冲溶液中加入0.15-

0.25wt％的标记有肌红蛋白抗体的时间分辨微球、0.2-0.3wt％的牛血清白蛋白、0.5-

1.5wt％的聚乙烯吡咯烷酮、0.4-0.6wt％核糖体蛋白S7、0.05-0.15wt％吐温-20。

2.根据权利要求1所述的肌红蛋白检测试剂体系，其特征在于，包括以下组分：于缓冲溶液中加入0.2wt％标记有肌红蛋白单克隆抗体的时间分辨微球、0.25wt％牛血清白蛋白、

1wt％聚乙烯吡咯烷酮、0.5wt％核糖体蛋白S7、0.1wt％吐温-20。

3.根据权利要求1所述的肌红蛋白检测试剂体系，其特征在于，牛血清白蛋白与核糖体蛋白S7的质量比为1:2。

4.根据权利要求1-2任一项所述的肌红蛋白检测试剂体系，其特征在于，所述肌红蛋白抗体选自肌红蛋白单克隆抗体、肌红蛋白多克隆抗体中的一种或几种。

5.根据权利要求1-2任一项所述的肌红蛋白检测试剂体系，其特征在于，试剂体系pH值为7-8。

6.根据权利要求5所述的肌红蛋白检测试剂体系，其特征在于，试剂体系pH值为7.4。

7.根据权利要求1-2任一项所述的肌红蛋白检测试剂体系，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸缓冲液或Tris缓冲液。

说明书

肌红蛋白检测用试剂体系

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于时间分辨微球的肌红蛋白检测用试剂体系及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，时间分辨荧光测定技术是利用稀土配合物具有长寿命荧光这一特点，在样品被脉冲光激发后、荧光信号采集前，根据样品中所包含的荧光物质荧光寿命的不同引入一定的延迟时间(delay time)，待短寿命的背景荧光完全淬灭后，再对长寿命的特异性荧光信号进行测定，采用时间分辨荧光测定技术可以有效消除来自样品、试剂、仪器等的短寿命非特异性荧光的干扰，从而极大地提高荧光检测的灵敏度。

[0003] 肌红蛋白(MYO)是存在于肌肉组织中的一种亚铁血红素蛋白，当肌肉细胞损伤后，由于分子量小，肌红蛋白迅速释放到血液中。在急性心肌损伤时，肌红蛋白最先被释放到血液中，在症状出现2-3小时后，血中MYO可超出正常上限，9-12小时达到峰值，24-36小时后恢复。MYO是目前心肌受损后最早发生异常的心血管标志物，MYO阳性虽不能确诊急性心肌梗死(AMI)，但可用于早期排除AMI诊断的重要指标，如MYO阴性，则基本排除心肌梗死。多种肌病，例如急性肌损伤、肌营养不良、肌萎缩和多发性肌炎等疾病会导致血液中的肌红蛋白含量升高。急慢性肾功能极度衰竭、严重充血性心力衰竭及长期休克也会导致肌红蛋白升高。监测肌红蛋白含量对于多种疾病的诊断具有重要意义。

[0004] 通常使用化学发光法、乳胶比浊法、胶体金免疫层析法或者荧光免疫层析法测定肌红蛋白，但是这些方法的操作复杂、稳定性低、灵敏度低、容易出现假阴性和假阳性。抗原抗体的结合特异性不强，检测结果的准确性不高、精密度低，检测范围小。

发明内容

[0005] 基于此，有必要针对肌红蛋白检测中存在的灵敏度低、精密度低、稳定性低、操作复杂及检测限过高等问题，提供一种基于时间分辨微球的肌红蛋白检测用试剂体系，以促进抗原抗体结合的特异性，实现简单快速检测肌红蛋白含量，同时具有高灵敏性、高稳定性、精密度好，并且检测限小，检测范围大，能够检测不同浓度的样品。

[0006] 具体的技术方案如下：

[0007] 一种基于时间分辨微球的肌红蛋白检测用试剂体系，包括以下组分：于缓冲溶液中加入0.05-0.5wt％的标记有肌红蛋白抗体的时间分辨微球、0.1-0.5wt％的牛血清白蛋白、0.1-5wt％的聚乙烯吡咯烷酮、0.1-1wt％核糖体蛋白S7、0.01-0.5wt％吐温-20。

[0008] 在其中一些实施例中，基于时间分辨微球的肌红蛋白检测用试剂体系包括以下组分：于缓冲溶液中加入0.15-0.25wt％的标记有肌红蛋白抗体的时间分辨微球、0.2-0.3wt％的牛血清白蛋白、0.5-1.5wt％的聚乙烯吡咯烷酮、0.4-0.6wt％核糖体蛋白S7、
0.05-0.15wt％吐温-20。

[0009] 在其中一些实施例中，基于时间分辨微球的肌红蛋白检测用试剂体系包括以下组分：于缓冲溶液中加入0.2wt％标记有肌红蛋白单克隆抗体的时间分辨微球、0.25wt％牛血清白蛋白、1wt％聚乙烯吡咯烷酮、0.5wt％核糖体蛋白S7、0.1wt％吐温-20。

[0010] 在其中一些实施例中，牛血清白蛋白与核糖体蛋白S7的质量比为1:2。

[0011] 在其中一些实施例中，所述肌红蛋白抗体选自肌红蛋白单克隆抗体、肌红蛋白多克隆抗体中的一种或几种。

[0012] 在其中一些实施例中，试剂体系pH值为7-8(优选为7.4)。

[0013] 在其中一些实施例中，所述缓冲溶液为磷酸缓冲液或Tris缓冲液。

[0014] 上述肌红蛋白检测用试剂体系具有以下有益效果：

[0015] 试剂体系与样品混合即能反应，操作简单；在试剂体系的作用下，标记抗体的时间分辨微球不会残留在样品垫上，也不会残留在样品垫和硝酸纤维素(NC)膜的结合处。试剂体系中的抗体与肌红蛋白反应的特异性高，灵敏度强，该检测体系的稳定性好、准确度高、精密度好，检测范围大。

附图说明

[0016] 图1为标准曲线图。

[0017] 其中，横坐标为肌红蛋白标准品的浓度(ng/mL)，纵坐标为检测到的荧光信号(T/C值)。

具体实施方式

[0018] 以下结合具体实施例对本发明所述基于时间分辨微球的肌红蛋白检测用试剂体系作进一步详细的说明。

[0019] 本发明用到的试剂规格、仪器型号及厂家如下：

[0020] 磷酸缓冲液(PBS)，具体组成：NaCl 8.5g，NaHPO4 2.2g，NaH2PO4 0.2g，H2O1000mL；

[0021] 牛血清白蛋白(BSA)，购自西宝生物科技股份有限公司；

[0022] 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，购自阿拉丁；

[0023] 核糖体蛋白S7，购自上海杰一生物技术有限公司；

[0024] 标记有肌红蛋白抗体的时间分辨微球，购自Bangslab；

[0025] 肌红蛋白标准品，购自上海古朵生物科技有限公司；

[0026] 样品来源广东省顺德区北滘医院；

[0027] 荧光检测仪Microdetection南京微测生物科技有限公司。

[0028] 实施例1

[0029] 本实施例考察了三组含有标记有肌红蛋白单克隆抗体的时间分辨微球的溶液的稳定性，具体而言，是通过检测放置不同时间后的溶液荧光信号变化，确定溶液的稳定性。各组溶液的组成如表1所示：

[0030] 表1

[0031]

[0032]

[0033] 按照表1中的组成配制好三组溶液，在溶液配制结束、放置1天、3天、5天及7天后检测荧光信号，检测结果如表2所示：

[0034] 表2

[0035]

[0036] 由表2的检测结果可以看到，溶液①在放置7天内的T/C值变化率均超过10％；溶液②在放置3天和5天后的T/C值变化率小，放置5天后的变化率低至0.52％；溶液③放置3天后的T/C值变化率最小为1.52％，继续放置后的T/C值变化率将超过22％，表明聚乙烯吡咯烷酮PVP有助于溶液的稳定性。

[0037] 实施例2

[0038]

[0039] 通过上述试验进行，可知条件：BSA：0.25％、PVP：1％、S7：0.5％的结果稳定性较好，下降幅度较小，后续经过多次测试，能够进行重复。

[0040] 确定了肌红蛋白检测用试剂体系的组成为：10mM PBS中含有0.25wt％BSA、1wt％PVP、0.5wt％S7、0.1wt％Tween-20及0.2wt％标有肌红蛋白的时间分辨微球。

[0041] 实施例3

[0042] 标准曲线的绘制及样品测试

[0043] 将标准品稀释为以下浓度，2000ng/ml，1000ng/ml，750ng/ml，500ng/ml，250ng/ml，100ng/ml，75ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml分别进行荧光的检测，得到对应的荧光值。绘制标准曲线如图1所示。

[0044] 标准品浓度 测试T/C值2000 3.50756
1000 2.91702
750 2.78745
500 2.55058
250 2.05047
100 1.399803
75 1.31654
50 1.06481
25 0.63259
12.5 0.339408
6.25 0.216751

[0045] 实施例4

[0046] 检测限实验

[0047] 取样标本最低检测值为21，本方法可以检测更低的值。

[0048]

[0049]

[0050] 实施例5

[0051] 回收率实验(准确度)

[0052] 选取多个值的不同样本重复测试，结果如下：

[0053]

[0054] 实施例6

[0055] 精密度实验

[0056] 取任意取三个不同浓度的样本，同一样本测试五次，观察五次变化[0057]

[0058]

[0059] 对比例1

[0060] 肌红蛋白检测用试剂体系的组成为：10mM PBS中含有1％PVP、0.5％S7、0.1％Tween-20及0.2％标有肌红蛋白的时间分辨微球。

[0061] 对比例2

[0062] 肌红蛋白检测用试剂体系的组成为：10mM PBS中含有0.25％BSA、1％PVP、0.1％Tween-20及0.2％标有肌红蛋白的时间分辨微球。

[0063]

[0064]

[0065]

[0066]

[0067] 每个平均值均为三次测量的平均值。

[0068] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0069] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。