一种电流型电化学传感器及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种电流型电化学传感器及其制备方法和应用，该电流型电化学传感器通过降解信号物质，从而有效提高传感器的灵敏度。所述传感器系统包括传感器和探针，所述传感器在电极表面通过Ca2+交联固定金聚亚甲基蓝或者硫堇、还原的氧化石墨烯‑血红素(hemin)‑金颗粒和铂颗粒修饰的海藻酸钠或者聚丙烯酸的混合物作为基底，然后在该基底上吸附固定CA199抗体1(Ab1)，再以牛血清蛋白封闭剩余的活性位点，构建电流型电化学传感器。

权利要求

1.一种电流型电化学传感器系统，所述传感器系统包括传感器和探针，所述传感器在电极表面通过Ca2+交联固定金聚亚甲基蓝或者硫堇、还原的氧化石墨烯-血红素(hemin)-金颗粒，和铂颗粒修饰的海藻酸钠或者聚丙烯酸的混合物作为基底，然后在该基底上吸附固定CA199抗体1(Ab1)，再以牛血清蛋白封闭剩余的活性位点，构建电流型电化学传感器；

所述探针为金颗粒、葡萄糖氧化酶和CA199抗体2共同修饰的碳酸钙纳米颗粒探针。

2.根据权利要求1所述的电流型电化学传感器系统，其特征在于，所述电极为玻碳电极。

3.根据权利要求1所述的电流型电化学传感器系统，其特征在于，所述金聚亚甲基蓝、还原的氧化石墨烯-血红素-金颗粒，和铂颗粒修饰的海藻酸钠的质量比例为4～10:2～5:2～5。

4.根据权利要求3所述的电流型电化学传感器系统，其特征在于，所述金聚亚甲基蓝、还原的氧化石墨烯-血红素-金颗粒，和铂颗粒修饰的海藻酸钠的质量比例为4～8:2～3:2～3。

5.根据权利要求3所述的电流型电化学传感器系统，其特征在于，所述金聚亚甲基蓝、还原的氧化石墨烯-血红素-金颗粒，和铂颗粒修饰的海藻酸钠的质量比例为2:1:1。

6.一种电流型电化学传感器系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)制备金聚亚甲基蓝或硫堇；

2)制备还原的氧化石墨烯-血红素-金颗粒的复合材料；

3)制备铂颗粒修饰的海藻酸钠或者聚丙烯酸

首先配置2～5mL质量百分比浓度为0.2％的海藻酸钠或者聚丙烯酸溶液，然后将3～7μL质量百分比浓度为4％的H2PtCl6溶液加入到海藻酸钠或者聚丙烯酸溶液中，得到的溶液在漩涡仪上进行混合，最后将混合好的溶液在微波反应器中80-100℃条件下反应5-20min，反应之后，混合物的颜色变成棕色；

4)制备金颗粒、葡萄糖氧化酶和CA199抗体2共同修饰的碳酸钙纳米颗粒探针首先5mL浓度为4mM的CaCl2溶液和5mL质量百分比浓度为0.08％的可溶淀粉溶液混合

30min，然后将5mL浓度为3mM的Na2CO3溶液加入到此混合液中并且剧烈搅拌10min，利用二次水洗涤，8000转离心分离得到制备的CaCO3颗粒，此过程重复三次，之后碳酸钙颗粒分散到

2mL二次水中，随后将10μL质量百分比浓度为4％的HAuCl4溶液加到碳酸钙颗粒分散液中并搅拌10min，然后加入8μL浓度为1mol/L的NaBH4溶液加到混合液中反应1h，得到的产物通过离心分离然后分散到2mL二次水中，最后将100μL浓度为1mg/mL的CA199抗体2和200μL浓度为1mg/mL的葡萄糖氧化酶的混合溶液加入到上述修饰过金颗粒的碳酸钙分散液中在室温条件下反应12h，经过离心分离和洗涤得到最后的产物；

5)构建传感器

电极经过铝粉的打磨之后分别用硝酸、乙醇进行洗涤，并用氮气吹干，然后用配置浓度为2～5mg/mL的步骤1)中制备的金聚亚甲基蓝或硫堇溶液、配置浓度为2～5mg/mL的步骤2)中制备的还原的氧化石墨烯-血红素(hemin)-金颗粒溶液和配置浓度为2～5mg/mL的步骤

3)中制备的铂颗粒修饰的海藻酸钠或者聚丙烯酸溶液的混合溶液直接滴在电极表面，三种溶液的体积比为2:1:1；烘箱中干燥之后，电极用浓度为20nM的CaCl2溶液浸泡5-15min，然后洗涤，之后将80μL浓度为200μg/mL的CA199抗体1溶液滴在电极表面并在冰箱中存放一夜；接着质量百分比浓度为1％的BSA溶液封闭剩余的活性位点，烘箱中干燥得到传感器。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中最后将混合好的溶液在微波反应器中反应5-10min。

8.一种根据权利要求1所述电流型电化学传感器系统的应用方法，所述方法如下进行：

将制备的传感器在待测液中浸泡1h，再在金颗粒、葡萄糖氧化酶和CA199抗体2修饰的碳酸钙纳米颗粒探针溶液中浸泡1h，所述探针溶液浓度为2mg/mL，然后再在7mM的葡萄糖溶液中浸泡5min，电极用二次水洗涤之后，利用方波伏安法以 Ag/AgCl为电极在-0.8至0.4V范围内进行检测最后的电信号，由电化学响应的电流大小来线性检测待测液中CA199的浓度。

说明书

一种电流型电化学传感器及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物免疫检测技术领域，具体而言，涉及一种电流型电化学传感器及其制备方法和应用，该电流型电化学传感器通过降解信号物质，从而有效提高传感器的灵敏度。

背景技术

[0002] 胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90％为起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率<1％，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌早期的确诊率不高，手术死亡率较高，而治愈率很低。本病发病率男性高于女性，男女之比为1.5～2:1，男性患者远较绝经前的妇女多见，绝经后妇女的发病率与男性相仿。CA199是一种粘蛋白型的糖类蛋白肿瘤标志物，为细胞膜上的糖脂质，分子量大于1000kD。是迄今报道的对胰腺癌敏感性最高的标志物。在血清中它以唾液粘蛋白形式存在，分布于正常胎儿胰腺、胆囊、肝、肠和正常成年人胰腺、胆管上皮等处。是存在于血液循环的胃肠道肿瘤相关抗原。大部分胰腺癌患者血清CA199水平明显增高。如果以正常参考范围上限(37U/mL)为诊断标准，敏感性和特异性均可达90％以上。

[0003] 目前，检测CA199蛋白肿瘤标志物的传感器多为三明治和非标型传感器的结构，例如CN201110127521.X中公开了一种检测卵巢SKOV-3癌细胞的三明治型电化学传感器，其采用石墨烯修饰电极。在现有文献(“Novel redox species polyaniline derivative-Au/Pt as sensing  platform for label-free  electrochemical immunoassay of carbohydrate antigen 199”，Anlytica Chimica Acta,2016,108-113,Wang等)中，非标传感器利用在电极表面修饰苯胺衍生物作为基底，然后修饰金铂合金。对于目前存在的三明治型电化学传感器，探针上固定有抗体和封闭剂(如牛血清蛋白)，电信号物质也在探针表面固定。抗体和封闭剂的导电性不好，不利于灵敏度的提高；对于非标型电化学传感器，电流的变化仅仅是因为抗原被固定到电极表面，存在灵敏度不高，检测范围小等问题。

[0004] 因此仍然需要开发一种灵敏度、检测限更高的传感器。

发明内容

[0005] 针对现有技术存在的问题，根据本发明的一个方面，提供了一种电流型电化学传感器系统，所述传感器系统通过降解信号物质，从而有效提高传感器的灵敏度。所述传感器系统包括传感器和探针，所述传感器在电极表面通过Ca2+交联固定金聚亚甲基蓝或者硫堇、还原的氧化石墨烯-血红素(hemin)-金颗粒和铂颗粒修饰的海藻酸钠或者聚丙烯酸的混合物作为基底，然后在该基底上吸附固定CA199抗体1(Ab1)，再以牛血清蛋白封闭剩余的活性位点，构建电流型电化学传感器。

[0006] 所述探针为金颗粒、葡萄糖氧化酶和CA199抗体2共同修饰的碳酸钙纳米颗粒探针。

[0007] 优选地，所述电极为玻碳电极。

[0008] 优选地，所述金聚亚甲基蓝、还原的氧化石墨烯-血红素-金颗粒和铂颗粒修饰的海藻酸钠的质量比例约为4～10:2～5:2～5，优选为4～8:2～3:2～3，更优选为2:1:1。

[0009] 根据本发明的一个方面，提供了一种电流型电化学传感器系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：

[0010] 1)金聚亚甲基蓝或硫堇的合成，可根据现有技术进行制备(“Novel metal-organic nanocomposites:Poly(methylene blue)-Au and its application for an ultrasensitive electrochemical immunosensing platform”，Sensors and Actuators B:Chemical 237，2016，666-671，Shan等)。

[0011] 2)还原的氧化石墨烯-血红素-金颗粒的复合材料的合成，可根据现有技术进行制备(“Reduced graphene oxide-Hemin-Au nanohybrids:Facile one-pot synthesis and enhanced electrocatalytic activity towards the reduction of hydrogen peroxide”，Biosensors and Bioelectronics 78,2016,300-307，Gu等)。

[0012] 3)铂颗粒修饰的海藻酸钠或者聚丙烯酸的合成

[0013] 首先配置2～5mL质量百分比浓度约为0.2％的海藻酸钠或者聚丙烯酸溶液，然后将3～7μL质量百分比浓度约为4％的H2PtCl6溶液加入到海藻酸钠或者聚丙烯酸溶液中，得到的溶液在漩涡仪上进行混合。最后将混合好的溶液在微波反应器中80-100℃条件下反应5-20min，优选反应5-10min。反应之后，混合物的颜色变成棕色，证明成功制备了铂颗粒修饰的海藻酸钠或者聚丙烯酸。

[0014] 4)金颗粒、葡萄糖氧化酶和CA199抗体2共同修饰的碳酸钙纳米颗粒探针的合成[0015] 首先5mL浓度为4mM的CaCl2溶液和5mL质量百分比浓度为0.08％的可溶淀粉溶液混合30min。然后将5mL浓度为3mM的Na2CO3溶液加入到此混合液中并且剧烈搅拌10min。利用二次水洗涤，8000转离心分离得到制备的CaCO3颗粒，此过程重复三次，之后碳酸钙颗粒分散到2mL二次水中。随后将10μL质量百分比浓度为4％的HAuCl4溶液加到碳酸钙颗粒分散液中并搅拌10min。然后加入8μL浓度为1mol/L的NaBH4溶液加到混合液中反应1h，得到的产物通过离心分离然后分散到2mL二次水中。最后将100μL浓度为1mg/mL的CA199抗体2和200μL浓度为1mg/mL的葡萄糖氧化酶的混合溶液加入到上述修饰过金颗粒的碳酸钙分散液中在室温条件下反应12h，经过离心分离和洗涤得到最后的产物。

[0016] 5)构建传感器

[0017] 电极经过铝粉的打磨之后分别用硝酸、乙醇进行洗涤，并用氮气吹干。然后用配置浓度为2～5mg/mL的步骤1)中制备的金聚亚甲基蓝或硫堇溶液、配置浓度为2～5mg/mL的步骤2)中制备的还原的氧化石墨烯-血红素(hemin)-金颗粒溶液和配置浓度为2～5mg/mL的步骤3)中制备的铂颗粒修饰的海藻酸钠或者聚丙烯酸溶液的混合溶液直接滴在电极表面，三种溶液的体积比为2:1:1；烘箱中干燥之后，电极用浓度为20nM的CaCl2溶液浸泡5-15min，然后洗涤，之后将80μL浓度为200μg/mL的CA199抗体1溶液滴在电极表面并在冰箱中存放一夜；接着质量百分比浓度为1％的BSA溶液封闭剩余的活性位点，烘箱中干燥得到传感器。

[0018] 根据本发明的另一个方面，提供了一种所述电流型电化学传感器系统的应用方法，所述方法以下进行：

[0019] 将制备的传感器在待测液中浸泡1h，再在金颗粒、葡萄糖氧化酶和CA199抗体2修饰的碳酸钙纳米颗粒探针溶液(2mg/mL)中浸泡约1h，然后再在7mM的葡萄糖溶液中浸泡5min。电极用二次水洗涤之后，利用方波伏安法(-0.8to 0.4V(vs Ag/AgCl))进行检测最后的电信号，由电化学响应的电流大小来线性检测待测液中CA199的浓度。

附图说明

[0020] 图1为表示根据本发明的电流型电化学传感器制备方法及应用方法的示意图；

[0021] 图2(A)为制备实施例1中得到的传感器系统对不同浓度的CA199对应响应电流；(B)为不同浓度的CA199与响应电流之间的线性关系。

具体实施方式

[0022] 在下文中，将参照附图详细地描述本公开的优选的实施方式。在描述之前，应当了解在说明书和所附权利要求中使用的术语，并不应解释为局限于一般及辞典意义，而是应当基于允许发明人为最好的解释而适当定义术语的原则，基于对应于本发明技术层面的意义及概念进行解释。因此，在此的描述仅为说明目的的优选实例，而并非是意指限制本发明的范围，因而应当了解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以做出其他等同实施和修改。

[0023] 根据本发明的制备的碳酸钙纳米颗粒探针导电性差、携带CA199抗体2和葡萄糖氧化酶，因此可以特异性识别目标分析物CA199和催化葡萄糖产生过氧化氢。当此探针连到基底上时，增加电阻，降低电化学响应电流。在基底上修饰了血红素，并含有金聚亚甲基蓝作为电信号物质，血红素在过氧化氢的存在时可以催化降解金聚亚甲基蓝。

[0024] 普通的三明治型电化学免疫传感器的信号物质在探针上，但是此探针必须修饰抗体和封闭剂(例如牛血清蛋白)，这些蛋白质的导电性较差，不利于响应电流的增加。

[0025] 根据本发明的传感器将信号物质金聚亚甲基蓝固定在基底之上，引入导电性差的CA199抗体2和葡萄糖氧化酶修饰的碳酸钙纳米颗粒探针可以阻碍电子转移，提高灵敏度。修饰在探针上的蛋白质也有利于提高灵敏度。此外，探针上的葡萄糖氧化酶可与固定在基底上催化剂血红素协同降解亚甲基蓝，进一步提高灵敏度。实验检测证明此传感器具有非常高的灵敏度和较宽的检出范围。

[0026] 以下实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。除非特别说明，以下实施例中使用的试剂和仪器均为市售可得产品。

[0027] CA199、CA199抗体1(Ab1)和CA199抗体2(Ab2)购买于上海领潮生物有限公司。亚甲基蓝、牛血清蛋白、可溶淀粉、碳酸钠、氯化钙、购自北京化学试剂公司(北京，中国)。氯金酸、氯铂酸和葡萄糖购自Alfa Aesar(天津，中国)。血红素葡萄糖氧化酶、海藻酸钠和氧化石墨烯购买于Sigma-Aldrich。所有的电化学检测都是在电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)进行。

[0028] 实施例

[0029] 制备实施例1

[0030] 1)构建传感器

[0031] 将玻碳电极利用0.05微米的三氧化二铝粉末打磨，然后在1:1硝酸、乙醇和二次水中洗涤，最后用氮气吹干。然后将8μL浓度为2mg/mL的金聚亚甲基蓝溶液、4μL浓度为2mg/mL的金颗粒修饰的还原氧化石墨烯溶液和4μL浓度为2mg/mL的铂颗粒修饰的海藻酸钠溶液混合，将混合液滴在电极表面。在37℃烘箱中干燥之后电极放在4℃的冰箱中冷却，然后在浓度为20nM的CaCl2溶液中浸泡10min。用二次水洗涤之后，将80μL浓度为200μg/mL的CA199抗体1(Ab1)直接滴在电极表面并在4℃冰箱中存放一夜，接着用牛血清蛋白(BSA)溶液(质量百分比浓度为1％)封闭剩余的活性位点，烘箱中干燥得到传感器。

[0032] 2)金颗粒、葡萄糖氧化酶和CA199抗体2共同修饰的碳酸钙纳米颗粒探针的合成[0033] 首先5mL浓度为4mM的CaCl2溶液和5mL质量百分比浓度为0.08％的可溶淀粉溶液混合30min。然后将5mL浓度为3mM的Na2CO3溶液加入到此混合液中并且剧烈搅拌5min。通过离心分离得到制备的CaCO3颗粒，利用二次水洗涤，8000转离心分离得到制备的CaCO3颗粒，此过程重复三次，之后碳酸钙颗粒分散到2mL二次水中。随后将10μL质量百分比浓度为4％的HAuCl4溶液加到碳酸钙颗粒分散液中并搅拌10min。然后加入8μL浓度为1mol/L的NaBH4溶液加到混合液中反应1h，得到的产物通过离心分离然后分散到2mL二次水中。最后将100μL浓度为1mg/mL的CA199抗体2和200μL浓度为1mg/mL的葡萄糖氧化酶的混合溶液加入到上述修饰过金颗粒的碳酸钙分散液中在室温条件下反应12h，经过离心分离和洗涤得到最后的产物修饰的碳酸钙纳米颗粒探针。

[0034] 测试实施例1

[0035] 将室温下，80μL浓度分别为0.001、0.01、0.1、1、5、10、100和200U/mL(U是酶活性单位)的CA199溶液滴在制备实施例1中得到的传感器表面上反应1h。洗涤之后再将80μL制备实施例1中得到的2mg/mL的碳酸钙纳米颗粒探针溶液滴在电极表面反应1h，最后将负载了探针的传感器再在7mM的葡萄糖溶液中浸泡5min，用方波伏安法进行表征(-0.8to 0.4V(vs Ag/AgCl))，并做出响应电流与CA199的浓度之间的线性关系。

[0036] 图2(A)为在制备实施例1中得到的传感器系统对不同浓度的CA199对应响应电流；(B)为不同浓度的CA199与响应电流之间的线性关系。

[0037] 测试实施例2

[0038] 取10份不同的血清，将根据制备实施例1制备的传感器在待测血清中浸泡1h，再在金颗粒、葡萄糖氧化酶和CA199抗体2修饰的碳酸钙纳米颗粒探针溶液(2mg/mL)中浸泡约1h，然后再在7mM的葡萄糖溶液中浸泡5min。电极用二次水洗涤之后，利用方波伏安法(-
0.8to 0.4V(vs Ag/AgCl))进行检测最后的电信号，由电化学响应的电流大小来线性检测待测液中CA199的浓度，表1中的样品1。

[0039] 作为对比，用通用的ELISA方法(样品2)进行检测，两组数据进行对比，结果如下表1所示。

[0040] 表1：不同血清样品中的CA199浓度的比较。

[0041]

[0042] 测试实施例3

[0043] 比较根据制备实施例1制备的传感器系统与其他现有技术中检测CA199的电化学传感器性能，结果列于下表2中，其中：

[0044] 样品1为根据制备实施例1制备的传感器系统；

[0045] 样品2为根据文献(“Ultrasensitive electrochemical immunosensor for carbohydrate antigen 19-9using Au/porous graphene nanocomposites as platform and Au@Pd core/shell bimetallic functionalized graphene nanocomposites as signal enhancers”，Biosensors andBioelectronics 66(2015)356–362，Yang等)制备的传感器；

[0046] 样品3为根据文献(“Silver-functionalized g-C3N4nanohybrids as signal-transduction tags for electrochemical immunoassay of human carbohydrate antigen 19-9”，Analyst,2016,141,4366，Sun等)制备的传感器；

[0047] 样品4为根据文献(“Metal ions doped chitosan–poly(acrylicacid)nanospheres:Synthesis and their application in simultaneously electrochemical detection of four markers of pancreatic cancer”，Biosensors and Bioelectronics 75(2016)148–154，Rong等)制备的传感器；

[0048] 样品5为根据文献(“Novel electrochemical redoxactive species:one-step synthesis of polyaniline derivative-Au/Pd and its application for multiplexed immunoassay”，Scientific Reports 5:16855，Published:2015,11,18，Wang等)制备的传感器；

[0049] 样品6为根据文献(“Multiplex electrochemical origami immunodevice based on cuboid silver-paper electrode and metal ions tagged nanoporous silver–chitosan”，Biosensors andBioelectronics 56(2014)167–173，Li等)制备的传感器；

[0050] 样品7为根据文献(“ZnO quantum  dot labeled immunosensor for carbohydrate antigen 19-9”，Biosensors and Bioelectronics 26(2011)2720–2723Gu等)制备的传感器。

[0051] 表2：根据制备实施例1制备的传感器系统与其他现有技术中检测CA199的电化学传感器性能的比较。

[0052]

[0053] 由表格中的数据可得，根据本发明制备的传感器系统具有较宽的检出范围，最低检出限相对较低。本文中的传感器的斜率远远超过其他传感器，证明此传感器的灵敏度远远超过其他传感器。