三叶青藤的组织培养快速繁殖方法

摘要

本发明公开了一种三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：1)以三叶青藤的带芽茎段为外植体，接种于繁殖复壮一体化培养基，置于培养室内培养15d，室内条件为22‑26℃，1400lux，8h/d，然后转入25‑28℃，3500‑4500lux的自然光照条件下继续培养15d，获得丛生芽；2)将步骤1)培养得到的丛生芽接种到生根炼苗同步化培养基中，于室内22‑26℃，1500lux，10h/d的条件下培养7d，再转入大棚内23‑28℃、遮光度为20‑40％、相对湿度为60‑80％的自然光下培养25d；3)移栽。本发明的方法能显著缩短种苗生产周期，降低种苗生产成本，提高种苗成活率与种苗质量。

权利要求

1.一种三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)繁殖复壮一体化培养：以三叶青藤的带芽茎段为外植体，接种于繁殖复壮一体化培养基，置于培养室内培养15d，培养室温度22-26℃，光照强度1400lux，光照时间8h/d，然后转入培养温度25-28℃，光照强度3500-4500lux的自然光照条件下继续培养15d，获得健壮的丛生芽，繁殖复壮一体化培养基的配方为：MS+1.0-2.0mg/L BA+0.3-0.5mg/L LFS+0.1-

0.3mg/L IBA+0.1-1.0mg/L NAA；

2)生根炼苗同步化培养：步骤1)培养得到的丛生芽接种到生根炼苗同步化培养基中，于室内培养温度22-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10h/d的条件下培养7d，再转入大棚内培养温度为23-28℃、相对湿度为60-80％的自然光下培养25d获得适宜移栽的完整植株，其中大棚上部覆盖遮阳网，遮光度为20-40％，其中，生根炼苗同步化培养基的配方为：

1/2MS+0.1-0.3mg/L IBA+1.0-2.0mg/L NAA+0.5-1.5mg/L IAA+0.3-0.5mg/L MET；

3)移栽：将步骤2)获得的完整植株从生根炼苗同步化培养基中取出，洗净根部残留培养基，移栽至育苗床或育苗大棚；

步骤1)中的外植体的获取方法如下：取三叶青藤带腋芽的茎段消毒后接种于繁殖培养基上培养获得不定芽，并在无菌条件下切割得到1.0-2.0cm长的带芽茎段作为外植体，备用，所述繁殖培养基的配方为：MS+1.5mg/L BA+0.4mg/L LFS+0.5mg/L IBA；

所述生根炼苗同步化培养基的配方为：1/2MS+0.2mg/L IBA+1.5mg/L NAA+1.0mg/L IAA+0.4mg/L MET；

步骤2)中，所述生根炼苗同步化培养基还含有1.2mg/L纳米氧化锌。

2.如权利要求1所述的三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤1)中所述外植体的接种方法为：将所述外植体平铺在繁殖复壮一体化培养基的表面，并将1/2所述外植体压入繁殖复壮一体化培养基内。

3.如权利要求1所述的三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述繁殖复壮一体化培养基的配方为：MS+1.5mg/L BA+0.4mg/L LFS+0.2mg/L IBA+0.5mg/L NAA。

4.如权利要求1所述的三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤3)中移栽的环境相对湿度为80-90％，培养温度25-28℃，遮光度为60-75％。

说明书

三叶青藤的组织培养快速繁殖方法

技术领域

[0001] 本发明涉及三叶青藤的繁殖技术领域。更具体地说，本发明涉及一种三叶青藤的组织培养快速繁殖方法。

背景技术

[0002] 三叶青藤Illigera trifoliata(Griff.)Dunn，又名红花青藤、毛青藤、三姐妹藤，为莲叶桐科青藤属植物。三叶青藤主要分布在广西、广东、云南、四川、湖南、福建和贵州等地，以地上部入药，具有祛风散瘀，消肿止痛的功效，在广西民间多用于治疗跌打肿痛、肩周炎、风湿骨痛、风湿病和类风湿病症、小儿麻痹症等，该植物藤茎是生产中成药“华佗风痛宝”及其各种剂型药品的主要原料药。近年研究表明，三叶青藤醇提物毒性较小并有显著的抗炎作用。

[0003] 三叶青藤多生于海拔1100-1300m的山谷中，地域分布零散且蕴藏量稀少。随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，三叶青藤的市场需求量逐年攀升，野生资源遭到过度采挖，濒临枯竭。自然状态下，三叶青藤主要依靠种子进行繁殖，但由于三叶青藤果实是在每年的4-5月成熟，此时南方地区处于清明时期梅雨季节，连绵阴雨极易造成果实因雨水浸泡而变黑腐烂；当果实从青绿色转黄绿色或淡棕色时采摘，果实变成黑褐色，种子也都变得比较干瘪，发芽率偏低，出苗不整齐，给科学研究和引种栽培带来极大困难。

发明内容

[0004] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

[0005] 本发明还有一个目的是提供一种三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，能显著缩短种苗生产周期，降低种苗生产成本，提高种苗成活率与种苗质量。

[0006] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

[0007] 1)繁殖复壮一体化培养：以三叶青藤的带芽茎段为外植体，接种于繁殖复壮一体化培养基，置于培养室内培养15d，培养室温度22-26℃，光照强度1400lux，光照时间8h/d，然后转入培养温度25-28℃，光照强度3500-4500lux的自然光照条件下继续培养15d，获得健壮的丛生芽，繁殖复壮一体化培养基的配方为：MS+1.0-2.0mg/L BA+0.3-0.5mg/L LFS+0.1-0.3mg/L IBA+0.1-1.0mg/L NAA；

[0008] 2)生根炼苗同步化培养：步骤1)培养得到的丛生芽接种到生根炼苗同步化培养基中，于室内培养温度22-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10h/d的条件下培养7d，再转入大棚内培养温度为23-28℃、相对湿度为60-80％的自然光下培养25d获得适宜移栽的完整植株，其中大棚上部覆盖遮阳网，遮光度为20-40％，其中，生根炼苗同步化培养基的配方为：1/2MS+0.1-0.3mg/L IBA+1.0-2.0mg/L NAA+0.5-1.5mg/L IAA+0.3-0.5mg/L MET；

[0009] 3)移栽：将步骤2)获得的完整植株从生根炼苗同步化培养基中取出，洗净根部残留培养基，移栽至育苗床或育苗大棚。

[0010] 优选的是，所述的三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，步骤1)中的外植体的获取方法如下：取三叶青藤带腋芽的茎段消毒后接种于繁殖培养基上培养获得不定芽，并在无菌条件下切割得到1.0-2.0cm长的带芽茎段作为外植体，备用，所述繁殖培养基的配方为：MS+1.5mg/L BA+0.4mg/L LFS+0.5mg/L IBA。

[0011] 优选的是，所述的三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，步骤1)中所述外植体的接种方法为：将所述外植体平铺在繁殖复壮一体化培养基的表面，并将1/2所述外植体压入繁殖复壮一体化培养基内。

[0012] 优选的是，所述的三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，所述繁殖复壮一体化培养基的配方为：MS+1.5mg/L BA+0.4mg/L LFS+0.2mg/L IBA+0.5mg/L NAA。

[0013] 优选的是，所述的三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，所述生根炼苗同步化培养基的配方为：1/2MS+0.2mg/L IBA+1.5mg/L NAA+1.0mg/L IAA+0.4mg/L MET。

[0014] 优选的是，所述的三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，步骤2)中，所述生根炼苗同步化培养基还含有1.2mg/L纳米氧化锌。

[0015] 优选的是，所述的三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，步骤3)中移栽的环境相对湿度为80-90％，培养温度25-28℃，遮光度为60-75％。

[0016] 本发明至少包括以下有益效果：

[0017] 1)通过生物技术对三叶青藤进行组织培养快速繁殖，在短时间内培育出大量可供大田栽培的三叶青藤幼苗，显著提高了三叶青藤种苗的繁殖系数和种苗质量，实现规模化生产，满足生产上的需要；

[0018] 2)通过繁殖复壮一体化培养、生根炼苗同步化培养两步培养法进行三叶青藤的工厂化生产，缩短了培养时间，减少培养步骤，降低了培养成本，提高了三叶青藤组培种苗的生产效率；

[0019] 3)在繁殖复壮一体化培养基上培养获得的无菌枝条健康粗壮、无玻璃化现象，展叶良好，木质化程度较高，接种到生根培养基上生根情况良好，生根率在92％以上，移栽育苗大棚后成活率在91.6％以上；

[0020] 4)本发明的生根炼苗同步化培养基中含有1.2mg/L纳米氧化锌，可显著促进生根，提高生根率，同时能增强植株的抗逆性，提高移栽成活率。

[0021] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

[0022] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

[0023] 需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0024] 实施例1：

[0025] 一种三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

[0026] 1)繁殖复壮一体化培养：以三叶青藤的带芽茎段为外植体，接种于繁殖复壮一体化培养基，置于培养室内培养15d，培养室温度22-26℃，光照强度1400lux，光照时间8h/d，然后转入培养温度25-28℃，光照强度3500lux的自然光照条件下继续培养15d，获得健壮的丛生芽，繁殖复壮一体化培养基的配方为：MS+1.0mg/L BA+0.3mg/L LFS+0.1mg/L IBA+0.1mg/L NAA；

[0027] 2)生根炼苗同步化培养：步骤1)培养得到的丛生芽接种到生根炼苗同步化培养基中，于室内培养温度22-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10h/d的条件下培养7d，再转入大棚内培养温度为23-28℃、相对湿度为60-80％的自然光下培养25d获得适宜移栽的完整植株，其中大棚上部覆盖遮阳网，遮光度为20％，其中，生根炼苗同步化培养基的配方为：1/2MS+0.1mg/L IBA+1.0mg/L NAA+0.5mg/L IAA+0.3mg/L MET；

[0028] 3)移栽：将步骤2)获得的完整植株从生根炼苗同步化培养基中取出，洗净根部残留培养基，移栽至育苗床或育苗大棚，移栽的环境相对湿度为80-90％，培养温度25-28℃，遮光度为60％。

[0029] 其中，所述的三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，步骤1)中所述外植体的接种方法为：将所述外植体平铺在繁殖复壮一体化培养基的表面，并将1/2所述外植体压入繁殖复壮一体化培养基内。

[0030] 其中，MS为MS基本培养基，BA为6-苄基腺嘌呤，LFS为灵发素，IBA为吲哚丁酸，NAA为萘乙酸，IAA为吲哚乙酸，MET为多效唑。

[0031] 实施例2：

[0032] 一种三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

[0033] 1)繁殖复壮一体化培养：以三叶青藤的带芽茎段为外植体，接种于繁殖复壮一体化培养基，置于培养室内培养15d，培养室温度22-26℃，光照强度1400lux，光照时间8h/d，然后转入培养温度25-28℃，光照强度4500lux的自然光照条件下继续培养15d，获得健壮的丛生芽，繁殖复壮一体化培养基的配方为：MS+2.0mg/L BA+0.5mg/L LFS+0.3mg/L IBA+1.0mg/L NAA；

[0034] 2)生根炼苗同步化培养：步骤1)培养得到的丛生芽接种到生根炼苗同步化培养基中，于室内培养温度22-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10h/d的条件下培养7d，再转入大棚内培养温度为23-28℃、相对湿度为60-80％的自然光下培养25d获得适宜移栽的完整植株，其中大棚上部覆盖遮阳网，遮光度为40％，其中，生根炼苗同步化培养基的配方为：1/2MS+0.3mg/L IBA+2.0mg/L NAA+1.5mg/L IAA+0.5mg/L MET；

[0035] 3)移栽：将步骤2)获得的完整植株从生根炼苗同步化培养基中取出，洗净根部残留培养基，移栽至育苗床或育苗大棚，移栽的环境相对湿度为80-90％，培养温度25-28℃，遮光度为75％。

[0036] 其中，所述的三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，步骤1)中所述外植体的接种方法为：将所述外植体平铺在繁殖复壮一体化培养基的表面，并将1/2所述外植体压入繁殖复壮一体化培养基内。

[0037] 其中，MS为MS基本培养基，BA为6-苄基腺嘌呤，LFS为灵发素，IBA为吲哚丁酸，NAA为萘乙酸，IAA为吲哚乙酸，MET为多效唑。

[0038] 实施例3：

[0039] 一种三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

[0040] 1)繁殖复壮一体化培养：以三叶青藤的带芽茎段为外植体，接种于繁殖复壮一体化培养基，置于培养室内培养15d，培养室温度22-26℃，光照强度1400lux，光照时间8h/d，然后转入培养温度25-28℃，光照强度4000lux的自然光照条件下继续培养15d，获得健壮的丛生芽，繁殖复壮一体化培养基的配方为：MS+1.5mg/L BA+0.4mg/L LFS+0.2mg/L IBA+0.5mg/L NAA；

[0041] 2)生根炼苗同步化培养：步骤1)培养得到的丛生芽接种到生根炼苗同步化培养基中，于室内培养温度22-26℃，光照强度1500lux，光照时间为10h/d的条件下培养7d，再转入大棚内培养温度为23-28℃、相对湿度为60-80％的自然光下培养25d获得适宜移栽的完整植株，其中大棚上部覆盖遮阳网，遮光度为30％，其中，生根炼苗同步化培养基的配方为：1/2MS+0.2mg/L IBA+1.5mg/L NAA+1.0mg/L IAA+0.4mg/L MET；

[0042] 3)移栽：将步骤2)获得的完整植株从生根炼苗同步化培养基中取出，洗净根部残留培养基，移栽至育苗床或育苗大棚，移栽的环境相对湿度为80-90％，培养温度25-28℃，遮光度为65％。

[0043] 其中，所述的三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，步骤1)中所述外植体的接种方法为：将所述外植体平铺在繁殖复壮一体化培养基的表面，并将1/2所述外植体压入繁殖复壮一体化培养基内。

[0044] 其中，MS为MS基本培养基，BA为6-苄基腺嘌呤，LFS为灵发素，IBA为吲哚丁酸，NAA为萘乙酸，IAA为吲哚乙酸，MET为多效唑。

[0045] 其中，所述的三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，步骤1)中的外植体的获取方法如下：取三叶青藤带腋芽的茎段消毒后接种于繁殖培养基上培养获得不定芽，并在无菌条件下切割得到1.0-2.0cm长的带芽茎段作为外植体，所述繁殖培养基的配方为：MS+1.5mg/L BA+0.4mg/L LFS+0.5mg/L IBA。

[0046] 实施例4：

[0047] 在实施例3的基础上，所述的三叶青藤的组织培养快速繁殖方法，步骤2)中，所述生根炼苗同步化培养基还含有1.2mg/L纳米氧化锌。

[0048] 为了说明本发明的三叶青藤的组织培养快速繁殖方法的效果，本发明的发明人针对上述实施例1-4进行了对比研究，以每组实施例制备5瓶样本，每瓶24株，共100株，分别统计移栽前清洗根部残留培养基得到的生根植株与生根率，以及移栽培养30天后的成活植株数与成活率，结果见下表1。由表1可知，本发明的方法得到的三叶青藤的生根率与成活率均较高。

[0049] 表1不同实施例的生根率与成活率

[0050]  生根植株数/株 生根率％ 成活植株数/株 成活率％
实施例1 95 95 87 91.6
实施例2 92 92 85 92.4
实施例3 93 93 90 96.8
实施例4 99 99 97 98.0

[0051] 本发明的发明人以实施例4为对象，研究含有不同浓度的纳米氧化锌的生根炼苗同步化培养基对三叶青藤组培过程中的生根率与移栽培养30天后的植株成活率的影响，样本数量为5瓶，每瓶24株，共100株，结果见表2。

[0052] 表2不同浓度的纳米氧化锌对三叶青藤组培生根率与成活率的影响[0053]

[0054] 由表2可以看出，纳米氧化锌对三叶青藤生根具有促进作用，随着生根炼苗同步化培养基含有的纳米氧化锌浓度增加，三叶青藤的生根率呈先增加后减少的趋势，而成活率相比相对稳定，但比未添加纳米氧化锌的实施例中，成活率明显提高，说明纳米氧化锌具有促进植株成活的作用。其中，以纳米氧化锌含量为1.2mg/L时，三叶青藤组培得到的生根率最高。

[0055] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。