小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒

摘要

本发明公开一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括聚氧乙烯脂肪酸酯、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、十二烷基多肽和曲拉通X‑100；血清样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇在聚氧乙烯脂肪酸酯的作用下受到保护，其与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的反应在一定程度上被抑制，而其它脂蛋白胆固醇则在十二烷基多肽的作用下与胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶反应而被消除；曲拉通X‑100与剩余的小而密低密度脂蛋白胆固醇反应检测出其含量。本发明能够用于快速方便地检测血清样本中的sdLDL‑C。本发明所述的试剂配方简单易制，成本低，能够大规模地产业化配制，同时本发明的试剂盒能够高效、准确、特异性地检测样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇。

权利要求

1.一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括聚氧乙烯脂肪酸酯、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、十二烷基多肽和曲拉通X-100；血清样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇在聚氧乙烯脂肪酸酯的作用下受到保护，其与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的反应被抑制，而其它脂蛋白胆固醇则在十二烷基多肽的作用下与胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶反应而被消除；曲拉通X-100与剩余的小而密低密度脂蛋白胆固醇反应检测出其含量；

所述试剂盒具体包括试剂R1和R2：

其中试剂R1含MOPS缓冲液pH7.0，胆固醇酯酶，胆固醇氧化酶，过氧化物酶，聚氧乙烯脂肪酸酯，十二烷基多肽，TOOS，叠氮钠；

所述的聚氧乙烯脂肪酸酯为单十二酸聚乙二醇酯；

所述的十二烷基多肽为从ADEKA中购买的AP-1240E；

试剂R1中MOPS缓冲液的浓度为10-500mM，胆固醇酯酶的浓度为0.1-20KU/L，胆固醇氧化酶的浓度为0.1-20KU/L，过氧化化物酶0.1-10KU/L，聚氧乙烯脂肪酸酯的浓度为0.01%-

1%，十二烷基多肽的浓度为0.01%-1%； TOOS的浓度为0.1-10mM，叠氮钠的浓度为0.01%-1%；

试剂R2含MOPS缓冲液pH7.0，曲拉通X-100，4-AAP，叠氮钠；试剂R2中MOPS缓冲液的浓度为10-500mM，曲拉通X-100的浓度为0.01%-5%，4-AAP的浓度为0.1-10mM，叠氮钠的浓度为

0.01%-1%。

2.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于：试剂R1中MOPS缓冲液的浓度为20-100mM，试剂R2中MOPS缓冲液的浓度为20-100mM。

3.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于：试剂R1中胆固醇酯酶的浓度为1-5KU/L，胆固醇氧化酶的浓度为1-5KU/L，过氧化化物酶1-5KU/L。

4.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于：试剂R2中曲拉通X-100的浓度为0.1%-1%。

说明书

小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体是一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒。

背景技术

[0002] 血液中的脂蛋白可以根据其密度大小分为高密度脂蛋白(HDL)，低密度脂蛋白(LDL)，极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)四大类。不同种类的脂蛋白胆固醇对于引起动脉粥样硬化的能力不一样。通常临床上检测最多的组分是高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，就常规而言，高密度脂蛋白胆固醇对于动脉血管有一定的保护作用，其含量高发生心血管疾病的风险就低，低密度脂蛋白胆固醇则易引起动脉粥样硬化，增大发生心血管疾病的风险。然而，最近的研究表面，即使LDL-C的含量较低，有部分人群也容易发生心血管疾病，而部分LDL-C含量较高的人群却不一定会发生心血管疾病。这可能与LDL-C的不均一性有关，有研究显示，低密度脂蛋白的亚组分中颗粒较小密度较大的LDL称为小而密低密度脂蛋白(small dense Low-Density Lipoprotein，简称sdLDL)；而将颗粒较大、密度较低的LDL称为大而轻LDL。相比之下，sdLDL致动脉粥样硬化的能力更强，是目前公认的引发心血管疾病的重要危险因子之一。

[0003] 目前的检测方法中，测定sdLDL的方法主要有电泳法、超速离心法、分级沉淀法等。但是电泳法测定的步骤繁琐，而且精密度和准确度都有待提高，临床应用性不强；超速离心法是测定脂蛋白类的标准方法，但是用该法检测sdLDL需要超速离心机，且检测通量不高，对操作人员的要求高，故该法在临床上也并未得到很好的推广；分级沉淀法虽然使得操作上相对简单，但仍然需要沉淀步骤，该法的精密度和准确度都相对较差，不适合临床应用。
因而急需一种简单快速的方法能够检测sdLDL或者sdLDL-C。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，能够用于快速方便地检测血清样本中的sdLDL。本发明所述的试剂配方简单易制，成本低，能够大规模地产业化配制，同时本发明的试剂盒能够高效、准确、特异性地检测样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)。

[0005] 本发明人通过长期地研究发现，聚氧乙烯脂肪酸酯对于sdLDL-C的反应有一定的抑制保护作用，而十二烷基多肽则对除sdLDL-C以外的脂蛋白的反应性更强，因此通过聚氧乙烯脂肪酸酯和十二烷基多肽的组合，实现对sdLDL-C特异性地检测。

[0006] 为了实现上述技术方案，本发明的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，包括聚氧乙烯脂肪酸酯、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、十二烷基多肽和曲拉通X-100；血清样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇在聚氧乙烯脂肪酸酯的作用下受到保护，其与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的反应在一定程度上被抑制，而其它脂蛋白胆固醇则在十二烷基多肽的作用下与胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶反应而被消除；曲拉通X-100与剩余的小而密低密度脂蛋白胆固醇反应检测出其含量

[0007] 具体地，本发明提供一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括试剂R1和R2，其中：

[0008] 试剂R1含MOPS缓冲液(pH7.0)，胆固醇酯酶，胆固醇氧化酶，过氧化物酶，聚氧乙烯脂肪酸酯，十二烷基多肽，TOOS，叠氮钠；

[0009] 试剂R2含MOPS缓冲液(pH7.0)，曲拉通X-100，4-AAP(4-氨基安替比林)，叠氮钠。

[0010] 本发明上述的聚氧乙烯脂肪酸酯可以为单十二酸聚乙二醇酯(EMANON 1112，单十二酸聚乙二醇酯)，聚乙二醇硬脂酸酯(单硬脂酸聚乙二醇)，聚乙二醇二硬脂酸酯(二硬脂酸聚乙二醇or聚乙二醇二硬脂酸脂)。

[0011] 本发明所述的试剂R1中，MOPS缓冲液的浓度为10-500mM，优选20-100mM，更优选50mM。

[0012] 本发明所述的试剂R1中，胆固醇酯酶的浓度为0.1-20KU/L，胆固醇氧化酶的浓度为0.1-20KU/L，过氧化化物酶0.1-10KU/L；优选的，胆固醇酯酶的浓度为1-5KU/L，胆固醇氧化酶的浓度为1-5KU/L，过氧化化物酶1-5KU/L；更优选的，胆固醇酯酶的浓度为2KU/L，胆固醇氧化酶的浓度为2KU/L，过氧化化物酶1KU/L。

[0013] 本发明所述的试剂R1中，聚氧乙烯脂肪酸酯浓度为0.01％-1％，十二烷基多肽(ADEKA，AP-1240E)的浓度为0.01％-1％，优选聚氧乙烯脂肪酸酯的浓度为0.1％，十二烷基多肽的浓度为0.1％。

[0014] 本发明所述的试剂R1中，TOOS的浓度为0.1-10mM，叠氮钠的浓度为0.01％-1％；优选的，TOOS的浓度为2mM，叠氮钠的浓度为0.1％。

[0015] 本发明所述的试剂R2中，MOPS缓冲液的浓度为10-500mM，优选20-100mM，更优选50mM。

[0016] 本发明所述的试剂R2中，曲拉通X-100的浓度为0.01％-5％，优选0.1％-1％，更优选0.5％。

[0017] 本发明所述的试剂R2中，4-AAP的浓度为0.1-10mM，叠氮钠的浓度为0.01％-1％，优选4-AAP的浓度为2mM，叠氮钠的浓度为0.1％。

[0018] 本发明所述的试剂R1中，各个主要成分的作用如下：首先，血清样本中的sdLDL-C在聚氧乙烯脂肪酸酯的作用下受到保护，其与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的反应在一定程度上被抑制，而相比而言，血清中的其它脂蛋白，如HDL，VLDL，CM，大而轻LDL(或其对应的胆固醇)则在选择性的表面活性剂十二烷基多肽的作用下，更加容易与胆固醇酯酶，胆固醇氧化酶反应，所生成的过氧化氢与过氧化物酶作用，生成水和氧气而被消除；而试剂R2中，含有曲拉通X-100，这种表面活性剂几乎能够与所有脂蛋白反应，故而与R1试剂配合使用后，使得在R1反应后仅剩的sdLDL-C能够全部与R2试剂反应，此时所生成的过氧化氢，在过氧化物酶的作用下，与色原物质TOOS和4-AAP偶联，生成偶氮类色素，进而通过吸光度的变化，来检测出sdLDL-C的含量。

[0019] 在整个检测过程中，聚氧乙烯脂肪酸酯和十二烷基多肽的联合使用对于选择性反应sdLDL至关重要，本发明人还发现，具体的聚氧乙烯脂肪酸实例有单十二酸聚乙二醇酯，单硬脂酸聚乙二醇酯(聚乙二醇单硬脂酸酯)，二硬脂酸聚乙二醇酯(聚乙二醇二硬脂酸酯or聚乙二醇二硬脂酸脂)等，典型地这些原料可以从商业渠道购买到，例如花王的EMANON1112，EMANON3199V，EMANON3299V，EMANON3299RV其中，效果最佳的当属单十二酸聚乙二醇酯，即EMANON1112。

[0020] 而另一种关键原料，十二烷基多肽则可以从ADEKA中购买到，例如AP-1240E。

[0021] 对于表面活性剂的用量，一般而言没有太大的限制，通常0.01％-1％的浓度范围比较合适，更常用的是，0.05％，0.1％，0.2％等浓度，在这些浓度下往往能够获得较好的效果。

[0022] 对于胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶和过氧化物酶而言，在第一步中主要是去除sdLDL-C以外的脂蛋白，因此只要其含量足够即可，故合理的范围为0.1-20KU/L，优选的范围为1-5KU/L，更常用的浓度为1KU/L，2KU/L，3KU/L，4KU/L，5KU/L。对于色原物质而言，其主要目的是提供显色所必须的物质，通常的组合如TOOS和4-AAP，由于色原物质的稳定性原因，故而将这两种物质分别用在R1和R2中，以保证试剂稳定性，不会变色，通常情况下，该物质的使用量为0.1-10mM，更为常用的量是0.5mM，1mM，2mM，3mM，4mM，5mM等。

[0023] 在R2试剂中，对于曲拉通X-100而言，其含量必须足以作用于剩余的sdLDL-C，使之完全溶解，并与胆固醇氧化酶，胆固醇酯酶反应，故使用量一般要在0.01％-5％之间，用量不足，无法使sdLDL-C完全溶解，用量过多，可能导致试剂的粘度增高等问题出现，因此，更常使用的量是0.1％-1％，更优选的使用量是0.2％，0.5％，0.75％，1％。

[0024] sdLDL-C检测试剂中，还应当包含适当的缓冲液，如MOPS缓冲液，该缓冲液具有良好的生物相容性，且缓冲能力合适，通常使用的pH值范围为6.0-8.0间，为了发挥酶活的最大作用，选择pH7.0是较为合适的，其选用的缓冲液浓度一般在10-500mM之间，优选20-100mM，更常用的是25mM，50mM，75mm等。

[0025] 此外为了使试剂盒用足够长的有效期，经常需要添加一些防腐剂，如叠氮钠，用以抑制微生物的污染等问题，通常情况下，需要抑制微生物生长的防腐剂浓度范围为0.01％-1％，更常用的浓度是0.02％，0.05％，0.1％，0.2％等浓度，这些浓度下抑制微生物的能力最有效。对于常规生化试剂盒中经常可以用到的一些其它物质，如抗坏血酸氧化酶、EDTA、甘露醇、氯化镁等也可以适当添加，以增强试剂盒的性能。

[0026] 本发明上述的％表示组分的质量百分比含量。

附图说明

[0027] 图1本发明的配方3试剂进行线性验证的线性范围图。

具体实施方式

[0028] 下面通过实施例的方式进一步详细说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。未在下列实施例中说明的条件或实验方法，均按照常规方法或按照厂家提供的说明书进行。

[0029] 实施例1

[0030] 相关性比较

[0031] 按照以下表格中的配方配制试剂R1和R2，共有6组。

[0032] 表1

[0033]

[0034]

[0035] 本发明的十二烷基多肽购买自日本企业株式会社ADEKA(具体参见网页：http://www.docin.com/p-1287395662.html中第6页中的记载)，该物质的结构式为[0036] 其中，样本试剂比例，样本：试剂R1：试剂R2＝3：150：50。在样本与试剂R1孵育5min后，加入R2，再反应5min，然后再600nm处测量吸光度。作为对照方法，使用超速离心法，具体方法参见(Menys V C,Liu Y,Mackness M I,et al.Measurement of plasma small-dense LDL concentration by a simplified ultracentrifugation procedure and immunoassay of apolipoprotein B.[J].Clinica Chimica Acta,2003,334(1–2):95-106.)。选择至少10个样本进行检测。具体结果见表2。

[0037] 表2

[0038]

[0039] 由表2可知，本发明的检测sdLDL-C的试剂盒，与超速离心法具有较好的相关性，相关系数在0.886-0.9368之间，可以说其准确度较高，因此用本发明的试剂盒能够简单有效地检测血清样本中的小而密低密度胆固醇。

[0040] 实施例2

[0041] 线性范围

[0042] 选一个sdLDL-C值约为100mg/dL的高值样本，分别稀释成不同的浓度，如0.2，0.4，0.6，0.8倍稀释，并用本发明的配方3试剂进行线性验证，其线性范围为0-100mg/dL，相关系数为0.9952。

[0043] 实施例3

[0044] 抗干扰实验

[0045] 在配方4的基础上，在其R1中加入以下物质，2KU/L抗坏血酸氧化酶，10g/L甘露醇，1mMEDTA，20mM氯化镁。检测其抗干扰能力。相关实验结果见表3，可以发现本发明的sdLDL-C检测试剂盒的抗干扰性能较好，不受5g/L血红蛋白，30mg/dL结合胆红素，50mg/dL维生素C的影响。

[0046] 表3

[0047]

[0048] 。