一种快速测定鸡蛋中磺胺类和喹诺酮类药物残留的方法

摘要

本发明公开了一种快速测定鸡蛋中磺胺类和喹诺酮类药物残留的方法，它涉及鸡蛋样品检测技术领域。其步骤为：将鸡蛋样品用2%甲酸乙腈8mL提取，再加入pH7.0、0.1mol/L的EDTA缓冲液0.5mL震荡，用QuEChERS EMR‑Lipid快速样品提取技术净化，最后用0.2%甲酸溶液和乙腈溶液作为流动相进行梯度洗脱，应用电喷雾离子源的动态多反应监测对30种磺胺类药物和喹诺酮类药物进行定性和定量分析。本发明前处理简单易行，便于操作，方法精密度高，可以满足对鸡蛋中磺胺类药物和喹诺酮类药物快速、准确的检测要求，适合大批量样品的准确定性和定量分析。

权利要求

1.一种快速测定鸡蛋中磺胺类和喹诺酮类药物残留的方法，其特征在于，其步骤为：

(1)准备材料与试剂：QuEChERS EMR-Lipid快速萃取管，HPLC纯试剂：乙腈、甲醇、甲酸，蒸馏水，以及目标分析物：磺胺噻唑(ST)、磺胺二甲异恶唑(SIZ)、磺胺多辛(SDM’)、磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺甲噻二唑(SMT)、磺胺甲氧哒嗪(SMP)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺地索辛(SDM)、磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺喹恶啉(SQ)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、麻保沙星、洛美沙星、培氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、二氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、吡哌酸、恶喹酸(奥索利酸)、依诺沙星(氟啶酸)、萘啶酸、氟甲喹、西诺沙星；

(2)样品提取净化：准确称取5g鸡蛋样品，加入2％甲酸乙腈8mL，漩涡震荡1min，再加入pH7.0、0.1mol/L的EDTA缓冲液0.5mL，漩涡震荡1min，10000r/min离心3min，将上清液转移至QuEChERS EMR-Lipid快速萃取提取管中，剧烈震荡1min，10000r/min离心3min，将上清液转移至QuEChERS EMR-Lipid反萃取管中，剧烈震荡1min，10000r/min离心3min，吸取1mL上清液到样品瓶中，50℃下氮气吹至近干；

所述的上清液转移至QuEChERS EMR-Lipid快速萃取提取管前需用pH2.4、0.1mol/L的乙酸铵溶液5mL活化；

(3)上机测定：浓缩液用0.2％甲酸乙腈溶液定容至1.0mL，涡旋混匀，过0.22μm过滤膜转移至进样瓶中上机检测；

(4)仪器条件：

色谱条件：色谱柱：Agilentporoshell EC-C18柱，2.1mm×100mm，2.7μm；流动相：A相为

0.2％甲酸溶液，B相为乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～0.5min，4％B；0.5～4.5min，4％B～8％B；4.5～5min，8％B；5～10min，8％B～18％B；10～13min，18％B～40％B；13～13.4min，40％B～70％B；13.4～13.5min，70％B～90％B；B瞬时变化为10％，并保持2min；流速：0.4ml/min；进样量：5.0μL；

质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描，动态多反应监测，碰撞能量为380V，雾化气压力为50psi，毛细管压力4000V，干燥气流速10l/min，干燥气温度350℃；

各目标分析物的质谱参数为；

(5)标准溶液的配制与标准曲线、检测限与定量限测定：根据标准品的实际含量换算标准品的实际称重量，分别准确称取各标准品，置于相应容量瓶中，以10ml水溶解，并用0.1％甲酸乙腈定容至刻度，其中恶喹酸10ml水加1.5ml氨水溶解，再用0.1％甲酸乙腈定容，即成

100.00μg/mL的标准储备液，4℃冰箱中避光保存，临用前可将其用流动相稀释至工作浓度标准溶液；

配置一系列浓度的混标溶液，用处理好的空白样品基质，配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、

20.0ng/mL标准工作溶液，上机检测获得基质标准曲线，数据处理获得线性相关系数，按3倍信噪比计算方法检测限，10倍信噪比计算方法定量限；

(6)添加回收率、精密度测定：准确称取5.00g鸡蛋样品，分别添加标准溶液混合溶液8、

16、32μg/kg浓度，每个添加浓度做6个平行样品，按上述方法进行处理分析，计算回收率和相对标准偏差。

2.根据权利要求1所述的一种快速测定鸡蛋中磺胺类和喹诺酮类药物残留的方法，其特征在于，所述上机测定步骤中甲酸乙腈溶液的甲酸水与乙腈的配比为4：1。

说明书

一种快速测定鸡蛋中磺胺类和喹诺酮类药物残留的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及的是鸡蛋样品检测技术领域，具体涉及一种QuEChERS EMR-Lipid结合LC-MS/MS快速测定鸡蛋中磺胺类和喹诺酮类药物残留的方法。

背景技术

[0002] 磺胺类抗生素(sulfonamides，sAs)是人工合成的具有对氨基苯磺酰胺结构的一类抗菌药物，喹诺酮类(4-quinolones)是一类含4-喹诺酮基本结构的抗菌药物，两类药物都因具有化学性质稳定、抗菌谱广、高效、低毒、价格低、使用方便等优点而被广泛应用到养殖业上，用来治疗和预防动物的疾病感染，并越来越受到养殖户的重视。但由于生产者用药不规范或不遵守正确的休药期等因素，导致sAs和FQs在畜禽体内过量积聚残留，污染了动物性食品，间接对人体产生过敏反应、泌尿系统损害等危害，重者可导致休克甚至死亡，某些药物还存在潜在的致癌性质。为此，世界各国普遍对食品中的sAs和FQs的限量提出了严格要求，并被许多国家列入抗生素禁用清单。目前，欧盟、美国、日本、韩国等国家均将磺胺类药物列为动物饲养过程中限制使用的药物，美国则禁止喹诺酮类药物应用于动物源性食品，我国农业部《兽药停药期规定》中也指出多种喹诺酮药物制剂在产蛋鸡中禁用，农业部公告第235号对动物源性食品中使用磺胺类药物的规定限量为总量不得大于100μg·kg-1。

[0003] 目前，国内外对sAs和FQs的分析检测方法主要有微生物检测法、酶联免疫吸附法、毛细管电泳法(CE)、高效液相色谱法(HPLC)及高效液相色谱—串联质谱法(HPLC-MS/MS)等，其中，HPLC-MS/MS法是检测动物源性食品中兽药残留的重要方法，这种方法结合液相保留时间，并采用多重反应监测(MRM)模式，对特征离子进行定量和定性分析，适合于复杂基质样品的检测，但目前检测sAs和FQs的LC-MS/MS方法主要集中在水产品、鸡肉、猪肉和牛奶等方面，未有文献报道鸡蛋中磺胺类药物的液相色谱-质谱/质谱法，可以同时检测鸡蛋中磺胺类药物和喹诺酮类药物的快捷方法更未见文献报道。基于此，结合最新QuEChERS EMR-Lipid快速样品提取技术的高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪法检测禽蛋中多种磺胺类药物和多种氟喹诺酮类药物的残留含量是食品安全技术发展所趋。

发明内容

[0004] 针对现有技术上存在的不足，本发明目的是在于提供一种快速测定鸡蛋中磺胺类和喹诺酮类药物残留的方法，简单易行，便于操作，方法精密度高，可以满足对鸡蛋中磺胺类药物和喹诺酮类药物快速、准确的检测要求，适合大批量样品的准确定性和定量分析，易于推广使用。

[0005] 为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种快速测定鸡蛋中磺胺类和喹诺酮类药物残留的方法，其步骤为：

[0006] (1)准备材料与试剂：QuEChERS EMR-Lipid快速萃取管，乙腈、甲醇、甲酸(均为HPLC纯试剂)，蒸馏水，以及目标分析物：磺胺噻唑(ST)、磺胺二甲异恶唑(SIZ)、磺胺多辛(SDM’)、磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺甲噻二唑(SMT)、磺胺甲氧哒嗪(SMP)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺地索辛(SDM)、磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺喹恶啉(SQ)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、麻保沙星、洛美沙星、培氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、二氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、吡哌酸、恶喹酸(奥索利酸)、依诺沙星(氟啶酸)、萘啶酸、氟甲喹、西诺沙星；

[0007] (2)样品提取净化：准确称取5g鸡蛋样品，加入2％甲酸乙腈8mL，漩涡震荡1min，再加入pH7.0、0.1mol/L的EDTA缓冲液0.5mL，漩涡震荡1min，10000r/min离心3min，将上清液转移至QuEChERS EMR-Lipid快速萃取提取管中，剧烈震荡1min，10000r/min离心3min，将上清液转移至QuEChERS EMR-Lipid反萃取管中，剧烈震荡1min，10000r/min离心3min，吸取1mL上清液到样品瓶中，50℃下氮气吹至近干；

[0008] (3)上机测定：浓缩液用0.2％甲酸乙腈溶液定容至1.0mL，涡旋混匀，过0.22μm过滤膜转移至进样瓶中上机检测；

[0009] (4)仪器条件：

[0010] 色谱条件：色谱柱：Agilent poroshell EC-C18柱，2.1mm×100mm，2.7μm；流动相：A相为0.2％甲酸溶液，B相为乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～0.5min，4％B；0.5～4.5min，4％B～8％B；4.5～5min，8％B；5～10min，8％B～18％B；10～13min，18％B～40％B；13～
13.4min，40％B～70％B；13.4～13.5min，70％B～90％B；B瞬时变化为10％，并保持2min；流速：0.4ml/min；进样量：5.0μL；

[0011] 质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描，动态多反应监测，碰撞能量为380V，雾化气压力为50psi，毛细管压力4000V，干燥气流速10l/min，干燥气温度350℃,同时优化各物质的质谱检测参数；

[0012] (5)标准溶液的配制与标准曲线、检测限与定量限测定：根据标准品的实际含量换算标准品的实际称重量，分别准确称取各标准品，置于相应容量瓶中，以10ml水溶解，并用0.1％甲酸乙腈定容至刻度(其中恶喹酸10ml水加1.5ml氨水溶解，再用0.1％甲酸乙腈定容)，即成100.00μg/mL的标准储备液，4℃冰箱中避光保存，临用前可将其用流动相稀释至工作浓度标准溶液；

[0013] 配置一系列浓度的混标溶液，用处理好的空白样品基质，配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0ng/mL标准工作溶液，上机检测获得基质标准曲线，数据处理获得线性相关系数，按3倍信噪比计算方法检测限，10倍信噪比计算方法定量限；

[0014] (6)添加回收率、精密度测定：准确称取5.00g鸡蛋样品，分别添加标准溶液混合溶液8、16、32μg/kg浓度，每个添加浓度做6个平行样品，按上述方法进行处理分析，计算回收率和相对标准偏差。

[0015] 作为优选，所述样品提取净化步骤中将上清液转移至QuEChERS EMR-Lipid快速萃取提取管前需用pH2.4、0.1mol/L的乙酸铵溶液5mL活化。

[0016] 作为优选，所述上机测定步骤中甲酸乙腈溶液的甲酸水与乙腈的配比为4：1。

[0017] 本发明的有益效果：操作步骤简单，减少操作过程中的各种误差，不仅提高了方法的灵敏度，还提高了样品的回收率和精密度，大大节省了样品前处理的时间，方法精密度高，不仅提高了磺胺类药物和喹诺酮类药物的检测灵敏度，也通过二级质谱扫描对药物进行了准确的定性分析，满足对鸡蛋中磺胺类药物和喹诺酮类药物快速、准确的检测要求，适合大批量样品的准确定性和定量分析，对于大批量样品的检测具有很高的实用性。

具体实施方式

[0018] 为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

[0019] 本具体实施方式采用以下技术方案：一种快速测定鸡蛋中磺胺类和喹诺酮类药物残留的方法，其步骤为：

[0020] (1)准备材料与试剂：QuEChERS EMR-Lipid快速萃取管，乙腈、甲醇、甲酸(均为HPLC纯试剂)，蒸馏水，以及目标分析物：磺胺噻唑(ST)、磺胺二甲异恶唑(SIZ)、磺胺多辛(SDM’)、磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺甲噻二唑(SMT)、磺胺甲氧哒嗪(SMP)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺地索辛(SDM)、磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺喹恶啉(SQ)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、麻保沙星、洛美沙星、培氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、二氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、吡哌酸、恶喹酸(奥索利酸)、依诺沙星(氟啶酸)、萘啶酸、氟甲喹、西诺沙星。

[0021] (2)样品提取净化：准确称取5g(精确至0.05g)鸡蛋样品，加入2％甲酸乙腈8mL，漩涡震荡1min，再加入pH7.0、0.1mol/L的EDTA缓冲液0.5mL，漩涡震荡1min，10000r/min离心3min，将上清液转移至QuEChERS EMR-Lipid快速萃取提取管中(此管提前用pH2.4、0.1mol/L的乙酸铵溶液5mL活化)，剧烈震荡1min，10000r/min离心3min，将上清液转移至QuEChERS EMR-Lipid反萃取管中，剧烈震荡1min，10000r/min离心3min，吸取1mL上清液到样品瓶中，
50℃下氮气吹至近干。

[0022] (3)上机测定：浓缩液用0.2％甲酸乙腈溶液(甲酸水与乙腈配比为4：1)定容至1.0mL，涡旋混匀，过0.22μm过滤膜转移至进样瓶中上机检测。

[0023] (4)仪器条件：

[0024] 色谱条件：色谱柱：Agilent poroshell EC-C18柱，2.1mm×100mm，2.7μm；流动相：A相为0.2％甲酸溶液，B相为乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～0.5min，4％B；0.5～4.5min，4％B～8％B；4.5～5min，8％B；5～10min，8％B～18％B；10～13min，18％B～40％B；13～
13.4min，40％B～70％B；13.4～13.5min，70％B～90％B；B瞬时变化为10％，并保持2min；流速：0.4ml/min；进样量：5.0μL。

[0025] 质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描，动态多反应监测，碰撞能量为380V，雾化气压力为50psi，毛细管压力4000V，干燥气流速10l/min，干燥气温度350℃,同时优化各物质的质谱检测参数。

[0026] (5)标准溶液的配制与标准曲线、检测限与定量限测定：根据标准品的实际含量换算标准品的实际称重量，分别准确称取各标准品，置于相应容量瓶中，以10ml水溶解，并用0.1％甲酸乙腈定容至刻度(其中恶喹酸10ml水加1.5ml氨水溶解，再用0.1％甲酸乙腈定容)，即成100.00μg/mL的标准储备液，4℃冰箱中避光保存，临用前可将其用流动相稀释至工作浓度标准溶液。

[0027] 配置一系列浓度的混标溶液，用处理好的空白样品基质，配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0ng/mL标准工作溶液，上机检测获得基质标准曲线，数据处理获得线性相关系数，按3倍信噪比计算方法检测限，10倍信噪比计算方法定量限。

[0028] (6)添加回收率、精密度测定：准确称取5.00g鸡蛋样品，分别添加标准溶液混合溶液8、16、32μg/kg浓度，每个添加浓度做6个平行样品，按上述方法进行处理分析，计算回收率和相对标准偏差。

[0029] 本具体实施方式的结果与分析如下：

[0030] (1)色谱柱选择：使用Agilent poroshell EC-C18柱(2.1mm×100mm，2.7μm)对配制0.1mg/L的标准溶液混合溶液柱进样上机，同样色谱质谱条件下，Agilent poroshell EC-C18柱的响应值和多种药物成分的分离度更好。

[0031] (2)质谱条件选择：

[0032] 磺胺类药物是人工合成的氨苯磺胺衍生物，基本化学结构为对氨基苯磺酰胺，喹诺酮类药物则都是具有吡啶酮酸共同结构的一组药物，根据两类药物的分子结构性质，选择ESI(+)作为电离模式。采用直接进样方式，0.1mg/L单标溶液进样5μL，正离子扫描模式对各药物进行全扫描，选择响应最佳的准分子离子峰为母离子，再对母离子进行二级质谱扫描，得到各个化合物响应值最佳的碎片子离子。最后再对得到的每种药物的二级质谱的碰撞能量(CE)、电喷雾电压(IS)、雾化气、喷雾压力、毛细管温度和电压等质谱参数进行优化，从而使每种药物的分子离子与特征离子碎片产生的离子强度达到最大时为最佳，使化合物的响应最高(见表1)。

[0033] (3)色谱条件选择：

[0034] 磺胺类药物和喹诺酮类药物的结构对pH值都有严格的要求，0.2％甲酸溶液体系能使磺胺类药物和喹诺酮类药物在质谱中有更好的响应值，这是由于甲酸可以为阳离子的形成提供必需的质子来源，从而提高其离子化效率，因此选用0.2％甲酸溶液作为流动相。此外，由于喹诺酮类药物热稳定性差，柱温太高可能会分解，而当柱温太低时流动相粘度大、色谱柱的理论塔板数低、目标物质出峰慢，因此柱温选为40℃。

[0035] (4)样品前处理的优化：

[0036] 磺胺类药物和喹诺酮类药物都含有较稳定的结构，微溶于水和甲醇等有机溶液，尤其是在酸性环境下稳定,选择2％甲酸乙腈溶液作为提取液，其提取样品所得的提取液最清，蛋白除去效果最好，磺胺药物的提取效果也较好。喹诺酮类含有吡啶酮酸基本结构，其羧基和酮基极易和金属离子形成络合物，所以单纯2％甲酸乙腈溶液提取时，喹诺酮类药物的回收率几乎没有，所有在样品提取过程中加入乙二胺四乙酸二钠(EDTA)去络合提取管中的金属离子，从而提高喹诺酮类药物的回收率，0.1mol/L EDTA作为络合剂时喹诺酮类药物的回收率最好；所以在提取过程中，选择2％甲酸乙腈溶液和0.1mol/L EDTA共同提取样品。

[0037] (5)样品净化：

[0038] 使用QuEChERS EMR-Lipid快速提取对样品进行净化，QuEChERS EMR-Lipid对脂质的去除率较好，而且分析物的回收率也较高。在使用QuEChERS EMR-Lipid萃取管进行样品净化时，QuEChERS EMR-Lipid快速萃取提取管的活化效果直接影响了检测结果的好坏，对比纯水、pH2.4 0.1mol/L乙酸铵、pH2.4 0.1mol/L EDTA、pH4 0.1mol/L EDTA、pH7 0.1mol/L EDTA活化提取管：纯水活化时，只有磺胺类药物有回收；pH4 0.1mol/L EDTA活化时喹诺酮类药物开始有回收，但较低；pH7 0.1mol/L EDTA活化时喹诺酮类药物回收较好，但磺胺类药物又没有了回收；而pH2.4 0.1mol/L EDTA活化时，由于溶液太酸，EDTA有析出现象；而用pH2.4 0.1mol/L乙酸铵活化萃取管中，磺胺类药物和喹诺酮类药物均有回收，而且回收率较好，所以最终选择pH2.4 0.1mol/L乙酸铵作为萃取管的活化液进行活化。

[0039] (6)检测方法的线性关系、检测限(LOD)与定量限(LOQ)的确定

[0040] 配制一系列标准工作溶液，做基质标准曲线进行定量分析，其线性范围和相关系数见表1，按3倍信噪比计算定为检测限(LOD)，10倍信噪比定为定量限(LOQ)，结果见表1。

[0041] 表1目标分析物的质谱检测参数、工作曲线线性范围、相关系数、检测限和定量限[0042]

[0043]

[0044]

[0045] (7)检测方法回收率和精密度确定

[0046] 准确称取空白样品，分别添加高、中、低三个浓度标准溶液，每个添加浓度平行测定6次，进行样品分析。在添加的所有药物中，除了磺胺药物没有回收率外，其他药物的回收率较好，回收率范围为41.65％～115.86％之间，精密度也较好，相对标准偏差小于20％，结果见表2。

[0047] 表2空白样品中30种兽药的加标回收率和相对标准偏差(％，n＝6)

[0048]

[0049]

[0050] 本具体实施方式建立了同时检测禽蛋中14种磺胺类药物和16中喹诺酮类药物多残留量的HPLC-MS/MS分析检测方法，为禽蛋中的磺胺类药物和喹诺酮类药物的残留检测提供了理论依据，食品中抗生素残留检测属于较为复杂的痕量组分分析技术，最显著的特点是需要严格的样本前处理步骤，因为前处理的操作直接影响检测结果的准确性和可靠性，所以能集采样、萃取、净化、浓缩、预分离、进样于一身的联用和自动化分析等将是未来发展的趋势。而本方法中的检测样品禽蛋中的蛋白质含量较高，在前处理过程中去除脂肪的步骤也非常关键，其脂肪去除的干净程度直接影响了最终结果。但目前现有技术所用的多数方法通常都会在去除脂质的损失一部分目标物，从而使目标物的回收率受到的影响，所以本方法在样品前处理过程中，采用QuEChERS EMR-Lipid萃取技术净化样品，可针对任意样品前处理产品实现最彻底的脂质去除和分析物回收，与其他样品前处理方法不同，它是一种能够选择性去除复杂基质中脂质并挑战鳄梨等高脂肪含量样品的独特吸附剂，可以在不损失分析物的前提下去除脂质，而且其操作步骤也比较简单，从而减少了操作过程中的各种误差，避免了以往方法中人工操作较多，前处理繁琐，检测限较高，结果不够理想的现象，不仅提高了方法的灵敏度，还提高了样品的回收率和精密度。而且其样品前处理时间也较短，大大节省了样品前处理的时间，适用于大批量产品的快速检测。

[0051] 本方法利用高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪检测禽蛋中磺胺类药物和喹诺酮类药物的多残留含量，不仅具有液相色谱对药物的高效分离特点，也具有质谱对分析物质化学结构的定性分析特性，同时达到了定性和定量的检测目的，特别适用于兽药痕量残留的确证性分析检测，而且在检测结果上大大提高了方法的灵敏度和精确度，所得检测限也比较低，磺胺类药物检测限为0.0013～0.0166μg/kg，定量限0.0044～0.0552μg/kg；喹诺酮类药物检测限为0.0018～0.0972μg/kg，定量限0.0060～0.3239μg/kg，远远小于欧美国家和我国农业部制定的最高残留限量，与其他液质联用法相比，检测限也有所降低。所以本方法建立的检测方法不仅提高了磺胺类药物和喹诺酮类药物的检测灵敏度，也通过二级质谱扫描对药物进行了准确的定性分析，即使动物性食品的样品中含有复杂的基质，也可以做到准确的确证分析，同时本方法前处理操作简便，节省了大量人力和时间，对于大批量样品的检测具有很高的实用性，在理论和生产实践上都具有重要意义，具有广阔的市场应用前景。

[0052] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。