一种稳定的β2微球蛋白溶液、其制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种稳定的β2微球蛋白溶液、其制备方法及应用，稳定的β2微球蛋白溶液包括检测用浓度水平的β2微球蛋白、Good’s缓冲液、氯化钠、甘油、牛血清白蛋白、稳定剂、防腐剂和蛋白酶抑制剂，所述Good’s缓冲液pH值为7.5至9.0，所述氯化钠浓度20～250mmol/L。本发明的β2微球蛋白溶液可应用于校准品和质控品，结合体外诊断试剂盒准确测定人体组织中β2微球蛋白的含量。其在4℃的有效期超过1年，开瓶稳定性超过1个月，结果准确，重复性好，开瓶即用，操作方便。

权利要求

1.一种稳定的β2微球蛋白溶液，其特征是所述稳定的β2微球蛋白溶液包括检测用浓度水平的β2微球蛋白；PIPES缓冲液 50mmol/L，pH8.0；NaCl150mmol/L；胆酸钠0.5mmol/L；天冬氨酸镁50mmol/L；丙氨酸50mmol/L；甘氨酸50mmol/L；甘油10%；牛血清白蛋白2g/L；

PMSF1mmol/L；EDTA 1mmol/L；叠氮钠0.1%；PEG6000 2g/L。

2.根据权利要求1所述的稳定的β2微球蛋白溶液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：β2微球蛋白为人源，浓度根据质控和校准品的要求进行配制，按照配方组成称量各组分，用纯净水溶解，溶液配制完成后用0.2μM孔径滤膜过滤除菌，在无菌环境下分装、封盖，并在4℃条件下保存。

3.根据权利要求1或2所述的稳定的β2微球蛋白溶液用于组织样品中β2微球蛋白含量检测的校准品或/和质控品的用途，其特征在于：多个浓度梯度成品组成一个诊断试剂盒中的校准品或/和质控品。

说明书

一种稳定的β2微球蛋白溶液、其制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，特别涉及一种稳定的β2微球蛋白溶液、其制备方法及应用。

背景技术

[0002] β2微球蛋白(β2-microglobulin，简称β2-MG)是由瑞典科学家 Berggard1968年首次从尿中分离纯化出来，分子量11800，等电点5.7，因电泳在β2区带而得名。β2-MG是一种小分子球状结构蛋白，存在于有核细胞的表面，与MHCI和CD1等蛋白质复合物结合在一起，对于蛋白质的运输和免疫反应的识别具有重要的作用。β2-MG可从细胞中排出以单体的形式存在于血液和尿液中，通常以较低的浓度水平存在。糖尿病患者或者高血压患者常常出现肾脏损伤的并发症，肾脏回收和代谢功能下降，血液和尿液中β2-MG会出现异常上升。因此，糖尿病和高血压患者血液和尿液中的β2-MG含量的上升经常预示着早期肾脏功能的损伤。血液中β2-MG的水平升高也可能是病毒性感染、骨髓瘤、骨髓增生等疾病导致。临床上检测血液或尿中的β2-MG浓度为临床肾功能测定、肾移植成活、糖尿病肾病、重金属镉、汞中毒以及某些恶性肿瘤的临床诊断提供早期、可靠和灵敏的指标。脑脊液中β2-MG的检测对脑膜白血病的诊断也有特别的意义。

[0003] 目前，β2-MG含量的测定主要采用免疫比浊法或胶乳增强免疫比浊法，试剂通常为液体双试剂，在医院即开即用。而β2-MG的校准品常常为冻干粉，需要添加生理盐水现配现用。医院检验科为非洁净环境，配制试剂容易引入污染，造成蛋白质降解。而且，校准品溶解后，需要进行梯度稀释制备至少6个浓度水平的溶液，用于多点定标。校准品经生理盐水多次稀释后稳定性很差，无法长期存放，下次定标时需重新进行配制，费时费力，且价格昂贵、浪费严重。

发明内容

[0004] 本发明的目的是克服上述技术缺陷，提供一种稳定的β2微球蛋白溶液，该溶液应用于校准品的制备可长期存放，多次使用，提高临床β2-MG含量的测定的效率，降低检测成本。

[0005] 本发明一种稳定的β2微球蛋白溶液，包括检测用浓度水平的β2微球蛋白、 Good’s缓冲液、氯化钠、甘油、牛血清白蛋白、稳定剂、防腐剂和蛋白酶抑制剂，所述Good’s缓冲液pH值为7.5至9.0，所述氯化钠浓度20～250mmol/L。作为一种优选方式，Good’s缓冲液为三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)或者4- 羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)。

[0006] 作为一种优选方式，所述甘油的体积百分比浓度为5％～25％。

[0007] 作为一种优选方式，牛血清白蛋白的浓度为0.5～5g/L。

[0008] 作为一种优选方式，所述稳定剂为浓度范围5～250mmol/L天冬氨酸镁、5～ 250mmol/L甘氨酸、5～250mmol/L丙氨酸中的一种或一种以上。

[0009] 作为一种优选方式，防腐剂为质量百分比浓度为0.05％～0.2％的叠氮钠，或者Proclin300。

[0010] 作为一种优选方式，蛋白酶抑制剂为浓度为0.5～2mmol/L的苯甲基磺酰氟 PMSF、浓度为0.5～5mmol/L的EDTA中的一种或两种。

[0011] 作为一种优选方式，上述β2微球蛋白溶液中还含有表面活性剂，所述表面活性剂为终浓度为0.1～5mmol/L的胆酸钠,或0.5-2％的脂肪醇聚氧乙烯醚 AEO7。

[0012] 作为一种优选方式，上述β2微球蛋白溶液中还含有赋形剂，所述赋形剂为浓度为0.1～10g/L聚乙二醇PEG6000。

[0013] 上述β2微球蛋白溶液的制备方法，包括以下步骤：β2微球蛋白为人源，浓度根据质控和校准品的要求进行配制，按照配方组成称量各组分，用纯净水溶解，溶液配制完成后用0.2μM孔径滤膜过滤除菌，在无菌环境下(如生物安全柜中)分装、封盖，并在4℃条件下保存。

[0014] 上述β2微球蛋白溶液用于组织样品中β2微球蛋白含量检测的校准品或/ 和质控品，多个浓度梯度成品组成一个诊断试剂盒标中的校准品或/和质控品。例如可以将β2微球蛋白溶液的浓度梯度设置为8mg/L、6mg/L、2mg/L、0.6mg /L、0.2mg/L等，可以放置4℃冰箱中稳定保存一年，开瓶稳定保存一个月。

[0015] 本发明稳定的β2微球蛋白溶液可改变现有β2微球蛋白的校准品和质控品冻干保存，使用时现用现配的局面，可有效降低产品的生产成本，在使用时无需添加生理盐水，简化操作，更能降低引入污染而造成蛋白降解的风险。每个浓度的水平校准品从高值到低值都能保证稳定1年以上，开瓶稳定性达到一个月。每次定标结束后，冷藏可继续使用，极大避免了试剂的浪费。

附图说明

[0016] 图1为本发明β2微球蛋白溶液定标与朗道校准品(BM1362)定标结果比较。

具体实施方式

[0017] 实施例1

[0018] 1.以pH8.0的Good’s缓冲液、NaCl 150mmol/L、甘油10％、牛血清白蛋白2g/L、叠氮钠0.1％和β2-MG 2.0mg/L作为基础配方A，在基础配方A基础上增加稳定剂等，考察在4℃条件下保存12个月后各配方中β2-MG测试值的改善效果。尿微量β2-MG的测定采用宁波瑞源生物科技有限公司的β2-微球蛋白测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)，生化仪器采用奥林巴斯AU400。根据说明书进行设置，主波长546nm，试剂R1 240μl添加样本3μl后混匀孵育5分钟后加入R2混匀孵育10秒钟读取吸光度A1，3分钟后读取吸光度A2。以多点校准品浓度和相应吸光度变化值(ΔA＝A2-A1)建立标准曲线，再测试样本值。基础配方A在12个月后β2-MG的剩余量为0.67mg/L,为初始值的33.5％。添加稳定剂12个月后，β2-MG测试值相对于配方A的水平变化如表1所示。

[0019] 表1：配方中稳定剂等及浓度对β2-MG在溶液中，4℃条件下保存12个月稳定性的影响。

[0020]

[0021] 在本实施例中对胆酸钠、天冬氨酸镁、丙氨酸、甘氨酸、PMSF、EDTA和PEG6000 对β2-MG在溶液中的稳定性进行了考察。丙氨酸、甘氨酸等氨基酸被添加在很多蛋白质溶液中作为稳定剂使用，PMSF能够抑制配方中可能存在的蛋白酶，避免其对β2-MG的水解作用。
EDTA同样具有抑制蛋白酶的作用，同时也能螯合重金属，避免重金属对蛋白质的损伤。加入一定比例的聚乙二醇(PEG6000)起到了稳定试剂的作用。聚乙二醇是多羟基化合物，能形成很多氢键，有助于形成“溶剂层”，增加表面张力和溶液黏度，使蛋白质有效脱水而降低蛋白质水解作用。本实施例中含有PEG6000的配方相对于不含PEG6000，可以使β2-MG一年的稳定性提高2.3-5.6％。天冬氨酸镁中Mg2+离子对于β2-MG的稳定性具有重要的作用，采用天冬氨酸镁可以让β2-MG的一年稳定性提高4.1-11.3％。

[0022] 实施例2

[0023] 以优选配方：Good’s缓冲液(PIPES 50mmol/L，pH8.0)、NaCl 150mmol/L、胆酸钠0.5mmol/L、天冬氨酸镁50mmol/L、丙氨酸50mmol/L、甘氨酸50mmol/L、甘油10％、牛血清白蛋白2g/L、PMSF1mmol/L、EDTA 1mmol/L、叠氮钠0.1％、 PEG6000 2g/L，β2-微球蛋白浓度分别为0.2mg/L、2mg/L和18mg/L进行稳定性对比分析。

[0024] 本实施例中对配制试剂的开瓶稳定性、长效稳定性进行考察。

[0025] 一、使用宁波瑞源生物科技有限公司的β2-微球蛋白测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)中定标液定标，对上述方法所配置3个浓度水平的样本(浓度分别0.2mg/L、2mg/L和18mg/L)每次测定10次，取平均值，计算相对偏差。作为对比某厂家冻干粉加生理盐水稀释成18mg/L的浓度，并用生理盐水继续稀释成2mg/L和0.2mg/L两个浓度。

[0026] 结果分析：根据检测数据，计算测定值均值、相对偏差。

[0027] 表2本发明优选配方与生理盐水溶解冻干粉的开瓶稳定性检测结果

[0028]

[0029] 表2结果显示，用生理盐水溶解的干粉在1个月后即出现明显的下降，尤其是低值，由于生理盐水的进一步稀释，冻干粉中稳定剂的比例相应下降，起不到稳定作用而造成。而本发明方法制作的样本表现出良好的稳定性，2个月内无论高值还是中低值的变化都小于5％，而1个月内只有不超过0.5％的下降，表明试剂在开瓶后非常稳定，准确性良好，为测试人员提供了方便快捷的检测试剂。

[0030] 二、对本发明优选配方长效稳定性测试

[0031] 对本发明优选配方在低、中、高三个浓度(0.2mg/L、2mg/L和18mg/L) 进行长期稳定性考察，样品在4℃保存。

[0032] 表3本发明优选配方稳定性考察结果：

[0033]

[0034] 表3结果显示，本发明稳定的β2微球蛋白溶液一年内表现出良好的稳定性，从低值到到高值，浓度的变化都不超过2％，完全满足诊断试剂盒的技术要求(一般精密度允许5％的相对偏差)。

[0035] 实施例3

[0036] β2-MG校准品的准确性分析

[0037] 以本实施例以发明稳定的β2微球蛋白溶液作为校准品定标，测试临床100 例血清，再以朗道校准品(BM1362)定标，测试该100例样本。两组结果进行比对，如图1所示。本发明定标液与朗道定标液具有相同的准确性。