甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法及应用

摘要

本发明涉及甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法及应用。所述构建方法，步骤如下：(1)提取博伊丁假丝酵母基因组DNA为模板；(2)以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，制得fdh基因片段；(3)将fdh基因片段用双酶切后连接到质粒pET28a(+)中，制得质粒pET28a(+)‑fdh；(4)将质粒pET28a(+)‑fdh转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到表达fdh的重组菌株BL21(DE3)‑fdh。本发明中所述的引物对是根据NCBI中所登录的多株博伊丁假丝酵母的fdh序列设计的兼并引物，可以以多数博伊丁假丝酵母菌株的基因组DNA为模板扩增出fdh基因，而不受基因序列中个别碱基差异的影响。

权利要求

1.甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤如下：

（1）提取博伊丁假丝酵母基因组DNA为模板；

所述博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC NO. 2.2378；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，以兼并引物进行PCR扩增，兼并引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，兼并引物的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，制得fdh基因片段；

（3）将步骤（2）制得的fdh基因片段用内切酶XbaI和BamHI双酶切fdh基因和质粒pET28a（+），再用连接酶连接，得到质粒pET28a(+)-fdh；

（4）将质粒pET28a(+)-fdh转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布筛选平板，37℃培养24h后进行克隆子鉴定，选取阳性菌株，得到表达fdh的重组菌株BL21(DE3)-fdh。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，30 循环；72℃延伸7min。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中，PCR扩增体系如下，总体系50μL：dNTP 5μL，上游引物 1μL，下游引物 1μL；模板DNA 1μL，Taq DNA聚合酶 2.5U，Buffer 

5μL，加双蒸水至50μL。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（4）中，筛选平板组分如下，均为质量百分比：

1％蛋白胨，1％NaCl，0.5％酵母提取物，2％琼脂，100μg/mL 卡那霉素，余量为水。

5.权利要求1所述构建方法构建的甲酸脱氢酶工程菌株在多环芳烃降解过程中的应用。

说明书

甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

[0002] 氧化还原酶催化底物的氧化或还原，在生物体利用有机物的过程中起着至关重要的作用。氧化还原反应伴随着电子的传递，生物体内绝大多数的氧化还原酶在反应时需要辅酶作为电子传递体。反应过程中，伴随着有机物的氧化，还原态的NADH会被氧化为其氧化态形式NAD+，当NADH被消耗殆尽，会导致反应的终止。生物体内有NAD+<＝>NADH的相互转化系统可以持续为氧化还原酶提供还原态NADH，当氧化还原酶细胞外应用时，应为其持续提供还原态辅酶NADH，而甲酸脱氢酶(Formate Dehydrogenase，FDH)是最成功的辅酶再生体系之一，已应用于工业生产中。

[0003] 中国专利文献CN104561052A(申请号201410803992.1)公开了一种重组甲酸脱氢酶及其制备方法和应用。一种甲酸脱氢酶基因突变体，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。一种重组甲酸脱氢酶，选自(1)由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；或是(2)由SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且具有甲酸脱氢酶活性的由(1)衍生的蛋白质。一种用于生产重组甲酸脱氢酶的基因工程菌，并且通过培养该基因工程菌和优化发酵工艺，实现重组甲酸脱氢酶的工业化生产，将其用于辅酶NAD+和NADH再生循环体系，并用于相关原料药及医药中间体的生产。

[0004] 中国专利文献CN104087522A(申请号201410306082.2)公开了一种外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌，其分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia.Pastoris)，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，登记入册编号为CGMCC NO：8924，保藏日期为2014年3月17日。本发明还公开了上述酵母工程菌的构建方法和应用。该发明的酵母工程菌经甲醇诱导后，测的粗酶活为27.9U/mL。

[0005] 虽然上述工程菌均能够表达甲酸脱氢酶，但受限于菌株的生长及酶活的原因，无法满足市场的需求。

发明内容

[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法及应用。

[0007] 本发明技术方案如下：

[0008] 甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法，步骤如下：

[0009] (1)提取博伊丁假丝酵母基因组DNA为模板；

[0010] (2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，以兼并引物进行PCR扩增，兼并引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，兼并引物的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，制得fdh基因片段；

[0011] (3)将步骤(2)制得的fdh基因片段用内切酶XbaI和BamHI双酶切fdh基因和质粒pET28a(+)，再用连接酶连接，得到质粒pET28a(+)-fdh；

[0012] (4)将质粒pET28a(+)-fdh转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布筛选平板，37℃培养24h后进行克隆子鉴定，选取阳性菌株，得到表达fdh的重组菌株BL21(DE3)-fdh。

[0013] 根据本发明优选的，所述步骤(1)中，博伊丁假丝酵母购自中国普通微生物菌种包藏管理中心(CGMCC)，编号为：2.2378。

[0014] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，30循环；72℃延伸7min。

[0015] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下，总体系50μL：

[0016] dNTP 5μL，上游引物1μL，上游引物1μL；模板DNA 1μL，Taq DNA聚合酶2.5U，Buffer5μL，加双蒸水至50μL。

[0017] 根据本发明优选的，所述步骤(4)中，筛选平板组分如下，均为质量百分比：

[0018] 1％蛋白胨，1％NaCl，0.5％酵母提取物，2％琼脂，100μg/mL卡那霉素，余量水。

[0019] 上述甲酸脱氢酶工程菌株在多环芳烃降解过程中的应用。

[0020] 有益效果

[0021] 1、本发明中所述的引物对是根据NCBI中所登录的多株博伊丁假丝酵母的fdh序列设计的兼并引物，可以以多数博伊丁假丝酵母菌株的基因组DNA为模板扩增出fdh基因，而不受基因序列中个别碱基差异的影响。

[0022] 2、利用本发明的菌株BL21(DE3)-fdh制备的甲酸脱氢酶粗酶液酶活性高，可达到0.6331U/mL，具有很好的工业应用性。

附图说明

[0023] 图1是从对菌株BL21(DE3)-fdh中提取的质粒pET28a(+)-fdh进行酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；

[0024] 其中：M泳道：DNA Marker，1泳道：质粒pET28a(+)-fdh单酶切片段，2泳道：质粒pET28a(+)-fdh双酶切片段；

[0025] 图2是甲酸脱氢酶活性测定时吸光度OD340随时间的变化曲线；

[0026] 图3是菲降解率和降解时间的变化曲线。

具体实施方式

[0027] 下面结合说明书及实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

[0028] 生物材料来源

[0029] 实施例中所述博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)购自中国普通微生物菌种包藏管理中心(CGMCC)，菌种编号为：2.2378。

[0030] 分子生物学试剂购自大连宝生物生物工程有限公司。

[0031] 实施例1

[0032] 菌株BL21(DE3)-fdh的构建

[0033] 提取博伊丁假丝酵母的基因组作为模板，用兼并引物对为引物进行PCR扩增，制得fdh基因片段；

[0034] 上游兼并引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游兼并引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

[0035] SEQ ID NO.1：5’-CCTCTAGAAAGGAGATATAATGAAGATYGTYTTAGTYYTWTATG-3’[0036] SEQ ID NO.2：5’-CCGGATCCTTATTTCTTATCGTGTTTACCG-3’

[0037] 扩增条件为：94℃预变性3min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，30循环；最后72℃延伸7min。

[0038] 得到的fdh基因片段经内切酶XbaI和BamHI双酶切，与同样经XbaI和BamHI双酶切的质粒pET28a(+)进行连接(连接产物为质粒pET28a(+)-fdh)，连接8h后转化BL21(DE3)感受态，涂布含卡纳霉素的固体LB平板进行，然后对平板上生长出的菌落进行挑筛选鉴定，酶切结果见图1，命名为BL21(DE3)-fdh。

[0039] 筛选平板组分如下，均为质量百分比：

[0040] 1％蛋白胨，1％NaCl，0.5％酵母提取物，2％琼脂，100μg/mL卡那霉素，余量水。

[0041] 实施例2

[0042] 菌株BL21(DE3)-fdh甲酸脱氢酶活性的诱导表达及粗酶液制备

[0043] 将BL21(DE3)-fdh接种到5mL的LB液体培养基中，向培养基中加入5μL，100mg/mL的卡那霉素溶液，摇床中37℃、180r/min条件下进行培养12～24h。。

[0044] 转接3mL菌液至50mL新鲜的LB液体培养基中，在温度为37℃，摇床转速为180r/min条件下继续培养，2～3h后，添加IPTG溶液至终浓度0.5mmol/L进行诱导，诱导时间为3～5h。

[0045] 离心收集菌体完全，用20～30mL的PBS缓冲液(0.1M pH7.0)进行菌体重悬，然后超声破碎(功率200～400W，条件为超声3s，间歇3s，共10min)，离心，上清即为粗酶液。

[0046] 实施例3

[0047] 菌株BL21(DE3)-fdh甲酸脱氢酶活性的测定

[0048] 酶活测定体系：反应液为0.2mL NAD(16.7mM)、0.2mL甲酸钠(1670mM)和1.4mL PBS缓冲液(pH7.5、10mM、含4mM DTT)，加入0.2mL经稀释过的粗酶液，混合后立即置于分光光度计，测340nm处的吸光值A1，室温(20℃)反应5min，测340nm处吸光值A2，A2-A1用于计算酶活性，吸光值随时间的变化曲线如图2所示。

[0049] 酶活力定义为：在pH7.5、30℃条件下，每分钟生成1μmol NADH所需要的酶量为1个酶活单位(NADH的摩尔消光系数为6220L·mol-1·cm-1)。

[0050] 经计算，酶活为0.6331U/mL。

[0051] 实施例4

[0052] 本实施例主要用于说明本发明制备的甲酸脱氢酶在多环芳烃降解过程中的应用及有益效果。

[0053] 本实验室前期筛选的多环芳烃降解菌多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)，用LB培养基在摇床中32℃、150rpm条件下培养16h，利用超声破碎仪在功率320W，超声5s，间歇5s，共15min的条件下破碎，离心，取上清液，即为多环芳烃降解粗酶液。

[0054] 将本实施例中的多环芳烃降解粗酶液与实施例2中制备的甲酸脱氢酶粗酶液混合，进行多环芳烃的降解。

[0055] 体系为：反应总体积5ml，菲终浓度50mg/L，用PBS缓冲液(pH7.5、10mM、含4mM DTT)配制，0.5mL多环芳烃降解粗酶液以及0.5mL甲酸脱氢酶粗酶液；

[0056] 对照体系为反应总体积5ml，菲终浓度50mg/L，用PBS缓冲液(pH7.5、10mM、含4mM DTT)配制，加入0.5mL多环芳烃降解粗酶液。

[0057] 结果如图3所示，由于NADH的消耗，反应3h后体系中的菲不再减少。

[0058] 而添加甲酸脱氢酶的处理组中，由于实现了NADH的循环再生，因此一直到6h后，菲的降解都保持着很高的速度。