一种癌症诊断试剂盒以及治疗用药物组合物

摘要

本发明收集甲状腺癌患者和正常人的血浆对全基因组miR表达谱进行研究。研究结果揭示了一系列miRs与甲状腺癌相关，其中发现分子标记物miR‑27a‑3p作为靶向降低MMSET表达的分子在甲状腺癌中具有显著抑制癌细胞的生长的现象。为有效控制治疗甲状腺癌提供全新的治疗靶点和药物。

权利要求

1.miR-27a-3p在制备用于治疗甲状腺癌的药物中的用途，其特征在于将miR-27a-3p制备成为过表达载体药物。

说明书

一种癌症诊断试剂盒以及治疗用药物组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及癌症的诊断试剂盒及其治疗用的药物组合物，属于医药生物技术领域。

背景技术

[0002] 甲状腺恶性肿瘤中最常见的是甲状腺癌(Thyroid carcinoma)，极少数可有恶性淋巴瘤及转移瘤，甲状腺癌占全身恶性肿瘤的1％。除髓样癌外，绝大部分甲状腺癌起源于滤泡上皮细胞。甲状腺癌的发病率与地区、种族、性别有一定关系。美国的甲状腺癌发病率较高，根据统计，1973-2002年间，美国甲状腺癌的年发生率由十万分之3.6增加到十万分之8.7，大约增加了2.4倍(P<0.001),而且这种趋势仍然在逐年增长。国内的甲状腺癌发病率较低，据统计，其中男性约

[0003] 0.8-0.9/10万，女性约2.0-2.2/10万。

[0004] 甲状腺癌是内分泌系统中发病率最高的恶性疾病，其发病率在近三十年内上升了三倍。根据2012年中国国家癌症中心登记处统计，我国甲状腺癌的发病率约为十万分之8.76，每年大约有11.8万人被检测出甲状腺癌。从细胞起源和临床病理上甲状腺癌可分为以下几种亚型:起源于甲状腺滤泡上皮细胞的高分化的乳头状癌和滤泡状癌，低分化癌，未分化癌；以及起源于甲状腺滤泡旁细胞的甲状腺髓样癌。其中乳头状癌占了所有甲状腺癌
85％的病例。目前的研究表明基因融合是甲状腺癌发病的决定性因素之一，癌症基因组计划(The Cancer Genome Atlas)绘制的甲状腺癌的遗传图谱提示，基因融合占据了甲状腺癌驱动突变的20％左右。因此鉴定出甲状腺癌组织中的基因融合对于甲状腺癌的精准诊断和治疗是必要的。

[0005] CN 102844443 B描述了用于检测、诊断和监测受试者的甲状腺癌的方法，其包括测定在受试者的样品中的包括Ep-ICD和β-联蛋白在内的标志物。

[0006] CN 102459636 B中公开了组合物用于确定受试者中恶性甲状腺病症的可能性，其中所述试剂适于检测所述受试者的DNA样品中IYD或其互补序列与正常样品相比的一种或多种拷贝数变异，并且包含对应于HD或其互补序列的一种或多种生物标志物，并且其中所述甲状腺病症是异常细胞增殖，其中所述可能性如下确定：(a)提供所述受试者的DNA样品；(b)使用所述组合物分析所述 DNA样品中IYD或其互补序列的一种或多种拷贝数变异的存在；和(c)基于步骤(b)的结果确定所述受试者是否患有或可能患有恶性甲状腺病症。

[0007] CN 102272325 B中公开了试剂在制备用于诊断受试者的甲状腺状态的组合物中的用途，其中所述试剂包含两种对应于两种生物标志物的基因，其中所述两种生物标志物选自ALDH1B1、CFH、CFHR1、PKHD1L1、PYGL、SEMA3D、 STK32A，并且其中所述两种生物标志物中的一种是ALDH1B1，所述甲状腺状态通过以下步骤诊断：(a)从所述受试者获得甲状腺组织样品；(b)测定所述甲状腺组织样品中至少两种基因表达产物的表达的表达水平，其中所述至少两种基因表达产物对应于所述甲状腺组织样品中的所述至少两种生物标志物；和 (c)通过将算法应用于步骤(b)的表达水平数据而将所述甲状腺组织样品分类为良性或恶性的，其中所述算法的阴性预测值至少为95％，且其中所述分类基于对应于所述至少两种生物标志物的至少两种基因表达产物的所述表达水平。

[0008] 现有技术的研究发现，针对甲状腺癌的检测方法比较复杂，存在这不准确以及不稳定的现象，需要本领域技术人员去追求和研究。

[0009] 前期的研究发现MMSET作为一种近期发现的新的肿瘤相关基因，研究者们在多种肿瘤中证实MMSET在促进肿瘤细胞的恶性转化以及肿瘤的迁移、侵袭以及转移等方面的作用，深入了解MMSET对于了解肿瘤发生、发展以及侵袭转移的分子机制，和判断肿瘤的预后和指导治疗方面均具有重要意义。因此，MMSET 基因有可能成为今后肿瘤的早期诊断和基因治疗方面的研究热点。但我们仍应看到，MMSET基因的表达调控机制、生物学功能和促进肿瘤侵袭转移的机制现在还不清楚，有许多问题还有待于进一步研究与探索。

[0010] 基于上述的研究发现，发明人通过研究发现，MMSET基因与甲状腺癌相关，同时提供一种快速的甲状腺癌检测的标志物以及相应的试剂盒显得尤为重要。

发明内容

[0011] 根据第一方面，本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供微小核苷酸 miR-27a-3p在制备诊断甲状腺癌的芯片中的应用。

[0012] 其中，miR-27a-3p的碱基序列为UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC。

[0013] 本发明的第二个目的是，提供微小核苷酸miR-27a-3p在制备甲状腺癌预后的疾病进展的试剂盒中的应用。

[0014] 本发明的第三个目的是，提供微小核苷酸miR-27a-3p作为靶向降低MMSET 表达的试剂在制备治疗甲状腺癌的药物中的应用。

[0015] 本发明提供了一种分离的寡核苷酸。根据本发明的实施例，所述寡核苷酸具有如SEQ ID NO:1所示的序列。根据本发明的实施例，发明人确定了生物样本存在甲状腺癌的miRNA生物标志物，该miRNA生物标志物具有如SEQ ID NO:1所示的序列，并且确定了该miRNA生物标志物与甲状腺癌的诊断/预后以及治疗过程密切相关。

[0016] 在本发明的最后一个方面，本发明提供了一种用于确定生物样本存在甲状腺癌的芯片以及相应的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含探针，所述探针特异性识别具有如SEQ ID NO:1所示序列的所述的寡核苷酸。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地确定生物样品是否存在甲状腺癌。

[0017] 一种用于早期甲状腺癌诊断用试剂盒或生物芯片，包括上述特异表达 miRNAs的逆转录引物和检测引物。逆转录引物的序列如SEQ ID NO：2所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：3所示：反向检测引物如SEQ ID NO：4所示：

[0018] SEQ ID NO:2：

[0019] 5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT-3’；

[0020] SEQ ID NO：3：5’-ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3'；

[0021] SEQ ID NO：4：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。

[0022] 本发明可以直接将生物样本中提取分离出完整无降解的RNA，经过荧光标记，利用生物芯片杂交技术进行芯片扫描和分析，从而确定生物体是否存在甲状腺癌。

[0023] 本发明优点在于：

[0024] 本发明收集甲状腺癌患者和正常人的血浆对全基因组miR表达谱进行研究。研究结果揭示了一系列miRs与甲状腺癌相关，其中发现分子标记物miR-27a-3p 作为靶向降低MMSET表达的分子在甲状腺癌中具有显著抑制癌细胞的生长的现象。为有效控制治疗甲状腺癌提供全新的治疗靶点和药物。

附图说明

[0025] 图1甲状腺癌和正常细胞中MMSET和miR-27a-3p RNA相对表达量变化图具体实施方式

[0026] 实施例1甲状腺癌中差异miR分析

[0027] 1、样本的确定

[0028] 研究对象的一般资料

[0029] 本实验石蜡标本均取自2005年9月至2011年3月在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院妇科接受手术治疗的标本，包括101例甲状腺癌标本，随机选择的41 例同期因甲状腺良性结节于我院行结节切除术的正常甲状腺标本作为对照。全部病例在术前均未接受放疗、化疗、激素治疗及生物治疗，病例对应的临床病理资料完整，病理诊断均由有经验的病理科医生复核。

[0030] 本课题在实施前，己获哈尔滨医科大学医学伦理委员会审核批准。

[0031] 我们将本研究的101例甲状腺癌组织样本制作成组织芯片，通过测序其中 RNA表达数据(RNAseq)，比较甲状腺癌组织与正常组织miR表达水平上的差异。通过研究发现，miR-27a-3p在甲状腺癌患者体内低表达，而MMSET蛋白在甲状腺癌中高表达。而miR-27a-3p在正常人群中相对于患者体内是高表达，而 MMSET蛋白在正常人群中相对于癌症患者是低表达的。

[0032] 表1 MMSET在正常组织和癌症患者中的表达情况(P<0.001；χ2检验)[0033]

[0034] 同时我们发现miR-27a-3p能够靶向MMSET，从图1的结果可以发现, miR-27a-3p高表达时,相应的MMSET低表达。

[0035] 实施例2高表达miR-27a-3p对甲状腺癌细胞作用情况

[0036] 将甲状腺癌细胞株WRO细胞进行培养；所用培养基为含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100wg/ml链霉素的高搪DMEM培养基(Dulbecco'S modified Eagle's medium,Gibco-Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。细胞置于37℃,5％CO2和饱和湿度的无菌恒温箱内培养。正常生长情况下2-4天换一次培养液，通过0.25％胰酶(Trypsin-EDTA solution,Gibco-Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)将细胞1:3或 1:4传代。

[0037] 构建过表达miR-27a-3p载体：将miR-27a-3p序列及其侧翼序列克隆至 pMD19-T载体，由上海生工公司测序。结果显示miR-27a-3p序列正确，将测序确认的miR-27a-3p序列及其侧翼序列做亚克隆，插入 pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP+Puro载体的EcoRI/BamHI之间。载体命名为 pCDH-CMV-miR-27a-3p-EFl-GFP+Puro。将载体转染入常用的载体细胞中，构建慢病毒载体。

[0038] 病毒感染及抗性筛选稳转细胞株:在六孔板中无抗完全培养基中接种2.0X 106个WRO细胞，37℃、5％CO2过夜，稀释病毒:稀释液(靶细胞维持液培养基) 1000ul+终浓度5μg/6
ml Polybrene，将慢病毒原液(100ul)加入到稀释液中(此时细胞个数按1X10计，即ΜO Ι＝10)；移去细胞培养液，加入稀释后的病毒液，同时建立对照(blank、negative)，37℃、5％CO2过夜(感染时细胞融合度为 70-80％)，移去细胞侵染后的病毒液，加入2ml完全培液，37℃、5％CO2过夜；根据细胞状态，进行常规传代，传代同时(感染后72h)，换用含嘌呤霉素(puro 终浓度lμg/ml)的完全培养基以进行抗性筛选；以后每隔两天换用新的含puro的培养基，直至Blank组细胞全部死亡；将存活下来的细胞换用含一半筛选浓度药物的培养基培养，进行为期一周的抗性维持。最后采用荧光定量PCR的实验方法筛选过表达细胞。通过PCR以及提取质粒鉴定，阳性细胞的miR表达量可以提高184％左右。

[0039] 为了鉴定靶向蛋白MMSET的表达情况，采用荧光定量PCR以及Western blot法进行检查：

[0040] 通过实时定量荧光PCR法对上述转染甲状腺癌中MMSET基因的mRNA表达水平进行再次验证，通过比较，发现以MMSET在空白甲状腺癌细胞为参照物，转染了miRNA的甲状腺癌细胞中的MMSET mRNA表达水平降低了94％。

[0041] 另外，通过细胞生长曲线分析同样也发现过表达miR的甲状腺癌细胞株的生长速度明显低于只转染空载体的细胞株，生长速度下降了84％。这说明 miR-27a-3p可以靶向降低MMSET的表达，进而抑制甲状腺癌细胞的增殖。

[0042] 通过Western-blot法检测了MMSET在空白甲状腺癌细胞以及导入了miR的甲状腺癌细胞中的表达水平，为了排除蛋白上样量不一致所导致的误差，本实验采用β-actin作为内参。MMSET蛋白在导入了miR癌细胞中的表达量相对于未导入miR的癌细胞相对表达量为0.12，也就是说MMSET蛋白的表达绝大部分被抑制。

[0043] 实施例3甲状腺癌细胞的检测

[0044] 新选取40例甲状腺癌患者以及20例正常人群的血清2mL，通过miRNAs 的逆转录引物和检测引物进行定量PCR检测，核酸提取以及相应的PCR步骤和条件为本领域常规的。其中，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：2所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：3所示：反向检测引物如SEQ ID NO：4所示：通过检测，发现其中39例癌症患者的miRNA表达量显著低于20例正常人的表达量，这说明通过miR的表达量分析可以用于甲状腺癌的初步诊断。

[0045] 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。