一种L型淀粉酶变体及应用

摘要

本发明公开了一种L型淀粉酶变体及应用。所述的α淀粉酶变体通过B.licheniformis的α淀粉酶缺失其N‑末端第一个氨基酸残基V并替换成3个其他氨基酸残基DGL得到，序列如SEQ ID NO.4所示。本发明提供的α淀粉酶变体，在pH 5.0‑5.8酸性条件下和100℃以上高温条件下有较高的催化活度。这些α淀粉酶变体的耐酸和热稳定性，适用于淀粉液化。

权利要求

1.一种α淀粉酶变体， 其特征在于所述的α淀粉酶变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的α淀粉酶变体，其特征在于所述的α淀粉酶变体的核苷酸编码序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

3.编码权利要求1 2中任一项所述的α淀粉酶变体的基因。

~

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

5.用于表达权利要求1 2中任一项所述的α淀粉酶变体的表达载体，其特征在于所述的~表达载体包括主要由SEQ ID NO .5所示的启动子序列，一个天然或合成的核糖体结合位点aaaggagg， SEQ ID NO.3所示的编码α淀粉酶变体的基因序列和SEQ ID NO.6所示的合成的终止序列同组成了一个表达组件，以及SEQ ID: NO.7所示的被插入到α淀粉酶变体编码基因启动子的上游的天然信号序列。

6.一种用于表达权利要求1 2中任一项所述的α淀粉酶变体的重组细胞，其特征在于包~含权利要求5所述的表达载体；重组细胞的宿主细胞选自经过基因工程改造失活了AprE和/或Blase的B. licheniformis。

7.一种权利要求1 2中任一项所述的α淀粉酶变体的生产方法，其特征在于包括在适宜~α淀粉酶变体表达的条件下对权利要求6所述的重组细胞进行培养，并从重组细胞或者其培养上清液中获得α淀粉酶变体。

8.权利要求1 2中任一项所述的α淀粉酶变体在水解多糖的α-1,4糖苷键中的应用。

~

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的α淀粉酶变体在高温和/或低pH条件下水解多糖的α-1,4糖苷键中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的高温为80℃ 110℃。

~

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于所述的高温为100℃ 110℃。

~

12.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的低pH为5.0 5.8。

~

说明书

一种L型淀粉酶变体及应用

技术领域

[0001] 本发明属于酶工程领域，涉及一种L型淀粉酶变体及应用。

背景技术

[0002] 在工业界，淀粉的水解主要是从α淀粉酶来开始的，这些来源于微生物的α淀粉酶和其他酶种的协同应用，比如说普鲁兰酶，糖化酶及葡萄糖异构酶，可有效分解淀粉大分子，这些产生的小分子多糖或单糖在食品制造、谷物处理、啤酒加工、酒精生产等行业有很多应用，至关重要。α淀粉酶隶属于糖化水解酶的一种，它的主要结构特征是(α/β)8折叠，其中含有特殊的淀粉底物结合位点，长度一般为不超过10个糖单体，但是很多淀粉酶的结合位点在一起作用，就可以实行多点位结合，从而成功剪切淀粉大分子。

[0003] α淀粉酶可以有效剪切淀粉底物中的α-1，4糖苷键，从而快速降低淀粉底物的分子量和粘度，产物主要是不同长度的糊精。α淀粉酶有不同的种类，这些种类在工业上的应用条件根据所需产品的性征有很大的不同。

[0004] α淀粉酶(α-1,4-glucan-4-glucanohydrolases,E.C.3.2.1.1)能有效水解淀粉和其他的多糖中的α-1，4糖苷键。鉴于在淀粉在水解过程中对酶效率的提高和降低生产成本的需求，寻求在不同应用领域能支持有效淀粉液化的α淀粉酶已成为学术界和工业界的一个重要研发方向。目前利用酶工程的技术改良该酶种的焦点主要在耐热性，酸碱耐受性能的改善和液化效果的提升。

[0005] 已经从植物和微生物中发现和定义了很多α淀粉酶具有商业价值，主要包括B.licheniformisα淀粉酶，B.amyloliquefaciensα淀粉酶和G.stearothermophilusα淀粉酶，其中以B.licheniformisα-amylase(L型)为模板有衍生的变体数量为最多，应用也最广泛。

[0006] 在本发明中，为适应工业化生产的需要，我们利用B.licheniformisα-amylase(L型)为模板构建了一系列新的α淀粉酶变体，提高了该酶种的应用效率，特别是在低pH以及减少添加量的情况下液化效率同市场主流产品可相匹配。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种B.licheniformisα-amylase(L型)变体，该系列变体可以提高液化效率，并能适应工业化生产的需求。特别是在100℃以上的温度和pH为5.0-5.8的条件下，本发明的α淀粉酶变体的酶活及其他性质可同市场主流产品相匹配。

[0008] 本发明的目的是提供编码该α淀粉酶变体的基因。

[0009] 本发明的又一目的是提供该α淀粉酶变体的生产方法和应用。

[0010] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：

[0011] 一种α淀粉酶变体，所述的α淀粉酶变体通过B.licheniformis的α淀粉酶缺失其N-末端第一个氨基酸残基V并替换成3个其他氨基酸残基DGL。

[0012] 所述的B.licheniformis的α淀粉酶的全长编码基因序列见SEQ ID NO.1；对应的氨基酸序列见SEQ ID NO.2。

[0013] 所述的α淀粉酶变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0014] 所述的α淀粉酶变体的核苷酸编码序列优选自如SEQ ID NO.3所示。

[0015] 编码本发明所述的α淀粉酶变体的基因。

[0016] 所述的基因优优选如SEQ ID NO.3所示。

[0017] 用于表达本发明所述的α淀粉酶变体的表达载体，其中含有本发明所述的编码α淀粉酶变体的基因。

[0018] 所述的表达载体包括主要由一个天然或者合成的启动子序列，一个天然或合成的核糖体结合位点，一个天然或合成的终止子序列，以及本发明所述的编码α淀粉酶变体的基因序列一同组成了一个表达组件。

[0019] 一种用于表达本发明所述的α淀粉酶变体的重组细胞，其中包含一个或多个本发明所述的编码α淀粉酶变体的基因。

[0020] 重组细胞的宿主细胞优选自Bacillus菌株,进一步优选B.licheniformis或经过基因工程改造失活了一些内源性蛋白的Bacillus菌株；最优选经过基因工程改造失活了AprE和/或Blase的B.licheniformis。

[0021] 一种本发明所述的α淀粉酶变体的生产方法，包括在适宜α淀粉酶变体表达的条件下对含有编码α淀粉酶变体基因序列的重组细胞进行培养，并从重组细胞或者其培养上清液中获得α淀粉酶变体。

[0022] 本发明所述的α淀粉酶变体在水解多糖的α-1,4糖苷键中的应用；优选在高温和/或低pH条件下水解多糖的α-1,4糖苷键中的应用；所述的高温优选80℃～110℃，进一步优选100℃～110℃；所述的低pH优选pH值为5.0～5.8。

[0023] 有益效果

[0024] 本发明提供的一系列α淀粉酶变体，在pH 5.0-5.8酸性条件下和100℃以上高温条件下有较高的催化活度。这些α淀粉酶变体的耐酸和热稳定性，适用于淀粉液化。

附图说明

[0025] 图1为pYF-tsDE载体，包括一个温度敏感原件(30℃时有复制活性)，一个红霉素决定基因(ErmC)--在E.coli中可以耐受300μg/mL的红霉素而在B.licheniformis中可以耐受5μg/mL的红霉素。用红霉素筛选出含有编码α淀粉酶变体核苷酸序列的重组宿主细胞。

[0026] 图2为pUC57-KS-erm载体的示意图，从该载体中可以获得本发明中的pYF-tsDE载体。

[0027] 图3为pYF-tsINT-amy载体的示意图。

[0028] 图4为不同喷射温度条件下，淀粉酶液化应用比较

[0029] 图5为不同淀粉浆浓度下，淀粉酶液化应用比较

[0030] 图6为在pH5.0下，淀粉酶不同加酶量液化应用比较

[0031] 图7为不同底物浓度条件下，淀粉酶液化应用比较

[0032] 图8为在不同pH条件下，淀粉酶液化应用比较

[0033] 图9为不同底物浓度条件下，淀粉酶液化应用比较

[0034] 图10为在不同pH条件下，淀粉酶液化应用比较

[0035] 图11为淀粉酶在玉米酒精液化上的应用比较

[0036] 本发明的详细描述

[0037] 除非另有规定，所有技术和科学术语在本发明中的具有相同的含义，通常理解为一般的专业技术。在此应用中，某些术语意义同规范所述。必须指出的是，本文所用的和所附的权利要求，单数形式“一个”“这个”包括复数形式，除非上下文中另有明确规定。

[0038] 本发明中，α淀粉酶指的是能够水解多糖的α-1,4糖苷键的酶。例如，α淀粉酶能将淀粉水解成糊精。

[0039] 本发明中，亲代α淀粉酶是指天然的α淀粉酶。天然的α淀粉酶是细菌α淀粉酶，来源包括但不局限于Bacillus subtilis,B.licheniformis，B.amyloliquefaciens，G.stearothermophilus和Bacillus cereus。

[0040] 根据本发明的优选实施例，天然α淀粉酶是来源于芽孢杆菌菌株----尤其是B.licheniformis和G.stearothermophilus。B.licheniformis的全长编码序列见SEQ ID NO.1；对应的氨基酸序列见SEQ ID NO.2。

[0041] 本发明中，术语“α淀粉酶变体”是指非天然存在的，在亲代的α淀粉酶氨基酸序列的有效点位进行一个或数个氨基酸残基的增加、删除和/或替代，同时仍然保持了亲代水解α-1,4糖苷键的能力的α淀粉酶。

[0042] 本发明中“液化”一般是指将碳水化合物分解为小分子的多糖的过程。当加入α淀粉酶或者α淀粉酶变体时，“液化”特指水解碳水化合物的α-1,4糖苷键。

[0043] 本发明中，“α-1,4糖苷键”指将前一个葡萄糖的C1与后一个葡萄糖的C4连接起来的键，即为α-1,4糖苷键。

[0044] 本发明涉及将亲代α淀粉酶做序列改造获得的“α淀粉酶变体”。亲代α淀粉酶是天然的α淀粉酶，特别来源于细菌的天然α淀粉酶。根据本发明的实施例，α淀粉酶变体是将亲代的α淀粉酶的氨基酸序列的有效点位进行一个或数个氨基酸残基的突变或删除。

[0045] 本发明包括一系列的α淀粉酶变体。根据本发明的实施例，这一系列的α淀粉酶变体的氨基酸序列的同源性至少达到95％，分别达到95％，96％，97％，98％，99％或者100％。

[0046] 作为说明性和非限制性的本发明示例，所述的α淀粉酶变体通过B.licheniformis的α淀粉酶缺失其N-末端第一个氨基酸残基V并替换成3个其他氨基酸残基DGL得到，氨基酸序列见SEQ ID NO.4。

[0047] 本发明中的α淀粉酶变体保持了水解α-1,4糖苷键的能力。另外，这些α淀粉酶的性能使用上符合工业生产要求，比如，液化效率的提高，酸性pH或高温条件下催化活性稳定。

[0048] 根据本发明的实施例，一个α淀粉酶变体在pH 5.0的酸性条件或者温度高于100℃的条件(尤其是温度在100℃-108℃之间)下，催化活性稳定。α淀粉酶变体这些提高的性能更适应淀粉工业的液化反应。因为在淀粉工业上液化工艺常常在低pH和高温条件下进行。

[0049] 本发明的所有α淀粉酶变体都可以用于液化反应。在优选的实施例中，α淀粉酶变体来源于亲代α淀粉酶，尤其是来源于B.licheniformis亲代的α淀粉酶。在特定的优选实施例中，α淀粉酶变体氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

[0050] 根据本发明，任何含有α-1,4糖苷键的碳水化合物都可以用于液化反应。含有一个或多个α-1,4糖苷键的碳水化合物包括但不仅限于淀粉，支链淀粉，直链淀粉和葡萄聚糖。

[0051] 很多碳水化合物含有α-1,6-糖苷键和α-1,4-糖苷键，比如，支链淀粉。“α-1,4-糖苷键”是指前一个葡萄糖的C1与后一个葡萄糖的C4连接起来的键，即为α-1,4糖苷键。因此，本发明的α淀粉酶变体可以与能够水解α-1,6糖苷键的普鲁兰酶在糖化过程中配合使用。能够水解α-1,4糖苷键的酶包括但不仅限于α淀粉酶。在本发明的优选实施例中，催化水解α-1,4糖苷键的酶为α淀粉酶。

[0052] 因此，根据本发明的实施例，进一步催化糖化反应提高效率的方法是配合使用普鲁兰酶。本发明中，“普鲁兰酶”是指能够水解α-1,6糖苷键的水解酶。

[0053] 本发明中的α淀粉酶与普鲁兰酶配合在淀粉的糖化过程中使用能够提高葡萄糖和麦芽糖的纯度。此外，在糖化反应使用上述复合酶能有效减少底物浓度，提高转化效率，在酸性pH或更高的温度下也能有更高的催化活性，更能适应工业上水解淀粉的条件。

[0054] 本发明提供了一种α淀粉酶变体能够在任何适合工业化生产的温度和pH条件下水解α-1，4糖苷键进行糖化反应的方法。根据本发明，液化反应可以在80℃至110℃的高温下反应，比如80℃，90℃，100℃，105℃和110℃。糖化反应也能在pH5.0至pH5.8的酸性pH条件下进行，比如pH5.0，5.2,5.4,5.6,和5.8。

[0055] 根据本发明的实施例，α淀粉酶变体催化的液化反应在酸性pH和100℃以上温度条件下催化活性稳定。

[0056] 另一方面，本发明中的表达载体包含一个合成的编码α淀粉酶变体的核苷酸序列，而重组宿主细胞包含了上述表达载体。表达载体含有一个合成的编码不同α淀粉酶变体的核苷酸序列。表达载体能够整合至宿主细胞的基因组上。例如，表达载体含有合成的核苷酸序列SEQ ID NO.3。

[0057] 本发明中的表达载体优选包括一个天然或者合成的启动子序列，一个天然或合成的核糖体结合位点，一个天然或合成的终止子序列。这些遗传原件与合成的α淀粉酶变体编码序列一同组成了一个表达组件，表达组件与载体骨架构成了表达载体。例如，表达载体包括一个表达组件，而表达组件包括以下的元件：一个启动子序列，一个合成的核糖体结合位点，一个合成的编码本发明中α淀粉酶变体的核苷酸序列和一个终止子序列。信号序列能够指导α淀粉酶变体的分泌，将信号序列引入表达载体或者表达组件，尤其是将信号序列引入起始密码子的上游更有利于α淀粉酶变体的分泌。

[0058] 根据本发明优选实施例，表达载体适宜在细菌中表达，尤其是Bacillus菌株,更适宜在B.licheniformis中表达。在特别优选实施例中，表达载体能够整合到Bacillus的基因组上，尤其是B.licheniformis的基因组上。可用于整合到染色体中的多核苷酸序列的宿主细胞的表达载体，以及这种表达载体的构建方法，是当代生物学领域众所周知的一个普通技能。

[0059] 根据本发明实施例，重组宿主细胞可以基因工程改造包含一个或多个α淀粉酶变体基因表达的核酸序列。任何技术均可用于基因工程改造宿主细胞包含一个或多个本发明中的α淀粉酶变体编码合成的核酸序列，例如，染色体整合。含有温度敏感起源和抗性筛选标记的载体可以用于整合步骤。这些载体通过坎贝尔机制与基因组的特定区域整合，通过抗性筛选得到重组菌，重组菌在随后的培养过程中通过同源重组去掉抗性筛选标记。

[0060] 根据本发明实施例，重组宿主细胞经过基因工程改造失活了一些内源性蛋白。能被失活的内源性包括但不限于胞外的蛋白酶。重组的宿主细胞转化含有α淀粉酶变体表达基因的核酸序列之前或者之后要失活一些内源性蛋白。更适宜的方法是，在转入α淀粉酶变体表达基因的载体之前进行宿主菌外源分泌蛋白酶的失活。

[0061] 首先，B.licheniformis经过改造已经失活了一些外源性蛋白酶基因。特别是B.licheniformis菌株可以失活一些胞外蛋白酶，例如subtilisin(AprE)，glutamic acid-specific protease(Blase)。这些基因工程改造使得B.licheniformis菌株更适宜α淀粉酶变体的表达和分泌。

[0062] 本发明提供了一种α淀粉酶变体的生产方法。根据本发明的实施例，该方法包括在适宜α淀粉酶变体表达的条件下对含有编码α淀粉酶变体核苷酸序列的重组宿主细胞进行培养，并从重组宿主细胞或者其上清液中获得α淀粉酶变体。

[0063] 本发明的所有重组宿主细胞都能够生产α淀粉酶变体。重组宿主细胞包含了至少一个拷贝的编码α淀粉酶变体的核苷酸序列。这些编码α淀粉酶变体的核苷酸序列能够在适宜的条件下表达α淀粉酶变体。从重组宿主细胞中分泌的α淀粉酶变体能够从重组细胞或上清液中收集到。收集的方法包括但不仅限于过滤，离心等。

[0064] 根据本发明的实施例，通过发酵经过基因工程改造B.licheniformis能够高产α淀粉酶变体。B.licheniformis通过基因工程改造导入了编码α淀粉酶变体的核苷酸序列。更好的是，本发明中的B.licheniformis已经去掉了抗性筛选基因，对环境无害并且生产的α淀粉酶变体更适合用于食品工业。

[0065] 本发明中下列的例子进一步阐述了本发明的本质。应当理解，下面的例子不限制本发明，本发明的范围是由所附的权利要求确定。

具体实施方式

[0066] 实施例1:pYF-tsDE质粒的构建

[0067] pYF-tsDE(图1)是一个温敏型的E.coli/B.licheniformis穿梭质粒。该质粒由一个温度敏感型的复制起点(在30℃有活性)和一个红霉素抗性基因(ErmC)组成，该抗性基因在E.coli中的抗性是300ug/ml，在B.licheniformis中的抗性是5ug/ml。在37℃时，质粒上的复制起点失活，质粒被整合到宿主菌基因组的指定位点，用ErmC进行筛选。

[0068] pYF-tsDE质粒的构建过程为：将质粒pUC57-KS-erm(委托Genscript合成,序列见CN 104073458A，图2)用BglII双酶切，回收纯化3.8kbp的片段，用T4连接酶(New England Biolabs)自连，克隆好的质粒就是pYF-tsDE。转化子在E.coli TOP10中进行繁殖，并且作为以下所有基因操作的骨架。

[0069] 实施例2:蛋白酶缺陷型B.licheniformis菌株的构建

[0070] 作为重组酶产品宿主细胞的遗传工程菌株已经有文献报道(Widner et al.,Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,25,204-212,2000)。这些重组的宿主细胞一般包含一个或多个编码目标序列的核酸结构用以酶的表达。在本发明中，B.licheniformis被用作基因操作的受体菌。Bacillus的转化目前可以通过非常成熟的手段来达到，如感受态细胞转化，电转化和原生质体转化(Young et al.,J Bacteriology,81,823-829,1961；Shigekawa et al.,Biotechniques,6,742-751,1988；Chang et al.,Molecular General Genetics,168,111-115,1979)。

[0071] 在本发明中，一个单独的α淀粉酶变体表达框，包含自然的或合成的启动子序列，一个从杆菌中筛选到的信号肽序列，一个合成的核糖体结合位点，一个来自于B.licheniformis的α淀粉酶变体编码基因，和一个转录终止子。这样的设计将大大增强宿主菌株中基因的表达水平和α淀粉酶变体的分泌量。将α淀粉酶变体编码基因替换掉B.licheniformis细胞基因组上的特定位点是通过质粒介导的单交叉同源重组来实现的。

[0072] 在B.licheniformis中，胞外蛋白酶的活性对异种酶的分泌是不利的。现已证实有2种主要的胞外蛋白酶：subtilisin(AprE)，glutamic acid-specific protease(Blase)，在B.licheniformis中大步伐的胞外蛋白酶活性都是源自于这两种蛋白酶。

[0073] 在本发明中，为了获得α淀粉酶变体基因表达的结构整体性，上述两个基因被灭活，采用的是连续性方式单交叉坎贝尔型机制。具体操作如下：

[0074] 2.1 pYF-tsDE经由BglII酶切后用CIP处理来抑制自连；

[0075] 2.2基因敲除

[0076] (1)为了能够获得每个基因缺失片段，以地衣杆菌基因组DNA为模板用PCR的方法从要缺失的基因两侧各扩增大约500bp的同源序列。枯草芽孢杆菌的单克隆经过98℃,5分钟预变性后可以作为基因组DNA模板直接在PCR反应中使用。

[0077] 用于PCR反应的引物是由Genscript公司合成的。引物序列如下：

[0078] 扩增Apr基因上游序列的引物为：

[0079] lichApr_F1 TTATTGAGCGGCAGCTTCGACATTGATCAGACCTT

[0080] lichApr_R1 CCTTACGGCATTCCTCTCAACAGCGGATCTTCAG

[0081] 扩增Apr基因下游序列的引物为：

[0082] lichApr_F2 CCTGAAGATCCGCTGTTGAGAGGAATGCCGTAAGG

[0083] lichApr_R2 ATGATGAGGAAAAAGAGTTTTTGGCTTGGGATGCTGAC

[0084] 扩增Blase基因上游序列的引物为：

[0085] blalich_F1 TTATTGTGCGCTGTTTTTCCAGTTGGTCAAATTGTCG

[0086] blalich_cR1 CGGACAAGGGTCACCAACGGGACAACTGTTACCATC

[0087] 扩增Blase基因下游序列的引物为：

[0088] blalich_cF2 GATGGTAACAGTTGTCCCGTTGGTGACCCTTGTCC

[0089] blalich_R2 CGGCGTTGGTTAGTAAAAAGAGTGTTAAACGAGGTTTGAT

[0090] PCR扩增体系为50ul，反应程序如下：

[0091] (1)枯草芽孢杆菌B.licheniformis 14580单克隆预变性98℃，8分钟；

[0092] (2)96℃，15秒；

[0093] (3)58℃，15秒；

[0094] (4)72℃，30秒；重复2-4步骤25-30次；

[0095] (5)终延伸72℃，2分钟。

[0096] PCR产物用0.8％琼脂糖胶电泳检测后用爱思进试剂盒纯化。

[0097] 2.3重叠PCR方法扩增内部大约400-500bp序列缺失的目的基因

[0098] 基因内部缺失片段是用重叠PCR方法(overlap extension PCR，SOE)获得的，具体操作如下：

[0099] (1)分别回收2.2中各基因上游、下游PCR片段并纯化；

[0100] (2)以各目的基因的上、下游同源序列片段1:1摩尔比混合后作为模板，用引物XX-CZ-F1和XX-CZ-R2(“XX”代表Apr或Blase)PCR扩增获得内部缺失片段的AprE基因或Blase基因。

[0101] 上述片段随后用Clone-EZ克隆试剂盒(Genscript公司提供)重组进经过BglII线性化的pYF-tsDE载体中，获得的重组质粒分别命名为：pYF-tsDE-Apr和pYF-tsDE-Blase。这些重组质粒为温敏型质粒，其中包含的Apr基因或Blase基因相对于完整基因来说缺失了内部大约400-500bp的序列。

[0102] 不同等位基因的替换可通过同源重组来实现。方法参见CN102124112A，也可使用本领域的其他公知的同源重组的方法。

[0103] 2.4质粒转化

[0104] 本实验采用将敲除质粒转化到地衣杆菌感受态细胞中方法及筛选过程如下：

[0105] (1)将温敏型质粒pYF-tsDE-Apr或pYF-tsDE-Blase转化地衣杆菌(CICC 22794，中国微生物菌种库购得)感受态细胞；

[0106] (2)在30℃的条件下，在LB(每升含蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g)培养基上用红霉素(5ug/ml)抗性来筛选阳性克隆菌株；

[0107] (2)再将阳性克隆菌株转移到37℃的条件下培养，使该温敏质粒能够融合到宿主基因组上。为了使基因在设定的位点发生替换，挑选几个克隆同时接种于2×YT培养基中连续培养24小时后重新继代一次，整个过程继代4-5次(一般需要5-7天)。

[0108] (3)筛选红霉素敏感的枯草杆菌细胞进行PCR鉴定.可同时用1％的脱脂牛奶LB平板观察透明水解圈，敲除后的菌种应显示显著缩小的水解圈。

[0109] 鉴定所用PCR引物：

[0110] AprE：Apr-seqF1/Apr-seqR3

[0111] Blase：Blase-seqF1/Blase-seqR3

[0112] Apr-seqF1：GCCAGGTTGAAGCGGTCTATTCAT

[0113] Apr-seqR3：TACGGCCATCCGACCATAATGGAAC

[0114] Blase-seqF1：GAAGAGCCGGTCACAATTGC

[0115] Blase-seqR3：GGCCGTTAGATGTGACAGCC

[0116] 实施例3:α淀粉酶变体菌株的整合构建

[0117] 3.1淀粉酶表达框架构建

[0118] 整合质粒的构建采用上述pYF-tsDE质粒同样的方法。为了将表达框整合到设计的基因组上的AmyE位点，在基因组上的AmyE位点的上下游设计800bp左右的同源区域，连接在一个α淀粉酶变体表达框两侧。同时组装了一些从头至尾自然选择的细菌染色体DNA片段和功能的合成序列，这些都是控制表达α淀粉酶变体基因所必须的。

[0119] 一个典型的淀粉酶表达框有以下几个部分构成：一个典型的α淀粉酶变体表达框由以下元件组成：一个天然的或合成的启动子序列(SEQ ID NO.5)，一个合成的核糖体结合位点aaaggagg，一个源自于B.licheniformis的α淀粉酶变体编码基因(分别为SEQ ID NO.3)和一个合成的终止序列(SEQ ID NO.6)。一个从枯草芽孢杆菌中筛选的强的天然信号序列(SEQ ID:NO.7)被插入到α淀粉酶变体编码基因启动子的上游，用以增强表达酶的分泌效率。用Clone-EZ克隆试剂盒(Genscript)将完整的α淀粉酶变体表达框插入线性化的pYF-tsDE中的BglII位点，最终得到的温敏型整合质粒被命名为pYF-tsINT-amy(图3)。上述序列的合成由Genscript公司来完成，将上述序列依次无缝串联得到α淀粉酶酶表达框。本框架中信号肽序列是从枯草芽孢杆菌中筛选出的，能够有效的提高α淀粉酶的分泌。

[0120] 3.2质粒转化

[0121] 将上述整个α淀粉酶表达框(包含amyE基因上下游同源片段)利用重组技术环化BglII线性化的pYF-tsDE质粒(重组试剂盒由Genscript公司提供)，构建好的温敏型质粒命名为pYF-tsINT-amy。该质粒用于转化至AprE及Blase蛋白酶基因缺失的地衣芽孢杆菌中(CICC 22794，中国微生物菌种库购得)，无抗性标记的α淀粉酶变体表达框将替换AmyE。采用上述的方法，成功整合α淀粉酶变体编码基因至B.licheniformis染色体上的菌株在蓝色淀粉平板上产生透明圈，PCR进一步验证表达框被整合在受体菌株的AmyE位点。

[0122] 产α淀粉酶变体的B.licheniformis工程菌株在-80℃保存。

[0123] 实施例4:α淀粉酶变体生产的摇瓶发酵

[0124] 取一个活化的细菌单克隆(含有α淀粉酶变体表达框)，接种到20ml培养基中(含有麦芽糖浆4.0％，蛋白胨2.0％，酵母粉0.1％KH2PO4 0.6％以及相应抗生素)培养到对数期。取1.2ml培养液接种到30ml培养基中(含有麦芽糖浆12.0％，蛋白胨1.0％，酵母粉1％KH2PO4 
0.2％，MnCl2 0.003％)，在往复摇床中120rpm振荡培养3天。分别在24小时，48小时和72小时取样1ml，1000rpm离心1min。将上清液保存，做SDS-PAGE分析。α淀粉酶变体分子量约为
53kD。

[0125] 测定α淀粉酶变体活性，方法同实施例6。

[0126] 实施例5:α淀粉酶变体分步补料发酵工艺

[0127] 将实施例3中得到的-80℃冷冻保存的基因工程B.licheniformis菌株划线与琼脂斜面上，37℃过夜恢复培养。琼脂斜面配方如下：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，琼脂粉2％。

[0128] 首先，选取数个新鲜克隆在盛有50ml培养基的种子摇瓶中于37℃培养16小时。种子摇瓶配方：麦芽糖浆4.0％，蛋白胨2.0％，酵母提取物0.1％，KH2PO4 0.6％。16小时后，将所有的种子发酵液全部转移至盛有4L培养基的7L不锈钢发酵罐中于37℃，搅拌速度350rpm，通气速率为650L/H的条件下持续发酵12小时。发酵罐配方：麦芽糖浆6.0％，蛋白胨
1.0％，酵母提取物1％，KH2PO4 0.2％，MnCl2 0.003％。然后用5％磷酸控制发酵pH在5.7±
0.2左右，并在前18小时以速率1L/18hrs后110小时以速率0.5L/18hrs向发酵罐中不断补料。补料配方如下：麦芽糖浆48％，蛋白胨6％，酵母提取物8％。整个发酵过程持续140-150小时。收集并在4℃，1010krpm，30分钟离心发酵罐中所有培养基，离心后的上清用于α淀粉酶变体酶活分析。

[0129] 实施例6:淀粉酶活力测定

[0130] 淀粉酶活力测定用的是百斯杰淀粉酶活力(BAU)。1个BAU单位的定义：在pH6.0、70℃条件下，1分钟液化1mg可溶性淀粉所需要的酶量。

[0131] 简单的说，酶活测定如下操作：20ml 20g/L可溶性淀粉溶液与5ml pH6.0磷酸缓冲液混合，先在70℃预热8min，加入1.0ml稀释后的酶液，准确反应5分钟，然后取1ml反应液，加入预先盛有0.5ml 0.1mol/L盐酸溶液和5ml稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5ml 0.1mol/L盐酸溶液和5ml稀碘液为空白，于660nm波长下，迅速测定其吸光值，根据吸光度查表，获得测试样品的酶活。

[0132] 实施例7:淀粉酶的应用

[0133] 除另外说明的，1BAU:淀粉酶的活力测定用的是百斯杰淀粉酶单位(BAU)。一个BAU被定义为在pH6.0、70℃条件下，1分钟液化1mg可溶性淀粉所需要的酶量。

[0134] tDS:每吨干物质

[0135] 从地衣芽孢杆菌细胞中表达并分离获得的淀粉酶变体首先用玉米淀粉进行第一轮液化测试。测试条件：18波美度(°Bé)、充分混匀、pH用盐酸调节至5.2。加入0.4kg/tDS的淀粉酶，分别采用喷射温度100、105、108、112、115℃，维持5-8min后闪蒸，95度维持120min。液化后进行DE和碘试测试，同时注意观察蛋白絮凝和粘度情况，以Wild type为对照,结果见表格1和图4。

[0136] 表1:不同喷射温度条件下，淀粉酶液化应用比较

[0137] 温度(℃) Wild type DE(％) 8008突变体5DE(％)100 18.02 19.77
105 17.79 19.47
108 15.00 17.48
112 13.85 18.72
115 7.05 13.91

[0138] 结果显示，8008突变体5(即上述制备的本发明α淀粉酶变体)明显优于wild type，8008突变体在不同喷射温度情况下，100、105、108℃液化过头，112℃液化正合适，而且蛋白絮凝好，而在115℃，液化效果仍较好，蛋白絮凝正常，说明本发明α淀粉酶变体具有非常好的耐热性，而wild type不能耐受115℃的高温。

[0139] 其次，我们通过在不同淀粉浆浓度条件下的液化实验，测定了淀粉酶对高底物浓度的耐受性。液化反应条件同上所述，喷射温度为108℃,以Wild type为对照,结果见表2和图5。

[0140] 表2:不同淀粉浆浓度下，淀粉酶液化应用比较

[0141]

[0142]

[0143] 如表2所示，8008突变体5明显优于wild type，8008突变体在不同淀粉浆浓度条件下，淀粉浆浓度高达22°Bé条件下，本发明α淀粉酶变体仍能正常液化，说明本发明α淀粉酶变体可以进行浓浆液化，有效节约工厂成本。

[0144] 然后，我们测定了淀粉酶的耐酸性，同时进行不同加酶量条件下的液化性能。液化反应条件同上所述，pH为5.0，加酶量分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6kg/tDS，以wild type为对照，结果见表3和图6。

[0145] 表3:在pH5.0下，淀粉酶不同加酶量液化应用比较

[0146] 加酶量(kg/tDS) Wild type DE(％) 8008突变体5DE(％)0.2 8.24 11.35
0.3 11.61 15.66
0.4 14.98 18.29
0.5 15.16 18.47
0.6 16.77 20.15

[0147] 如表3所示，8008突变体5明显优于wild type，8008突变体5在低pH、0.2-0.3kg/tDS添加量条件下，L型淀粉酶变体仍能正常液化，说明该L型淀粉酶变体对低pH具有较强的耐受性，同时在0.2kg/tDS低加酶量条件下，本发明α淀粉酶变体仍能正常液化，这可有效降低工厂用酶成本。

[0148] 另外，我们进行了淀粉酶对糖化的影响测试，同时以Wild type淀粉酶、Liquozyme Supra(购自Novozymes)液化制得的液化液进行对比，测试条件：32％干物质(DS)、充分混匀、pH用盐酸调节至4.3。加入0.45kg/tDS复合糖化酶，200ml的反应在60℃分别反应24和48小时。样品经0.22um膜过滤及100℃灭活后用于HPLC分析。结果见表4。

[0149] 表4:淀粉酶对糖化的影响

[0150]

[0151] 如表4所示，使用本发明α淀粉酶变体液化液和Wild type液化液，本发明α淀粉酶变体糖化效果明显优于Wild type，同时使用本发明α淀粉酶变体液化液和Liquozyme Supra液化液，两者糖化效果完全一样，说明本发明α淀粉酶变体可以应用于淀粉糖行业。

[0152] 另外，我们进行了淀粉酶对小麦淀粉的影响测试，测试条件：22、25、28、30％(W/W)不同底物浓度、充分混匀、pH用盐酸调节至5.6。加入0.4kg/tDS的淀粉酶，采用91-95℃维持120min。液化后进行DE和碘试测试，同时注意观察蛋白絮凝和粘度情况，以wild type为对照，结果见表5和图7。

[0153] 表5:不同底物浓度条件下，淀粉酶液化应用比较

[0154] 底物浓度(％) Wild type DE(％) 8008突变体5DE(％)22 20.85 21.61
25 20.21 20.29
28 19.64 19.71
30 18.14 19.48

[0155] 结果显示，8008突变体5与wild type结果相似，在不同底物浓度情况下，22-25％液化正合适，而且蛋白絮凝好，而在28和30％，液化效果仍较好，蛋白絮凝正常，说明本发明α淀粉酶变体可以进行浓浆液化，有效节约工厂成本。

[0156] 其次，我们测定了淀粉酶的耐酸性，同时进行不同pH条件下的液化性能。液化反应条件同上所述，pH分别为4.8、5.2、5.6、6.0，加酶量为0.4kg/tDS，以wild type为对照，结果见表6和图8。

[0157] 表6:在不同pH下，淀粉酶液化应用比较

[0158]pH Wild type DE(％) 8008突变体5DE(％)
4.8 8.11 14.45
5.2 20.43 19.76
5.6 21.77 20.30
6.0 21.97 21.10

[0159] 如表6所示，在pH4.8条件下，本发明α淀粉酶变体仍能正常液化，说明本发明α淀粉酶变体对低pH具有较强的耐受性，而wild type不能耐低pH。

[0160] 随后，我们进行了淀粉酶对大米的影响测试，测试条件：12、15、18、20波美度(°Bé)不同底物浓度、充分混匀、pH用盐酸调节至5.2。加入0.4kg/tDS的淀粉酶，喷射温度108℃，维持5-8min后闪蒸，95度维持120min。液化后进行DE和碘试测试，同时注意观察蛋白絮凝和粘度情况，以wild type为对照，结果见表格7和图9。

[0161] 表7:不同底物浓度条件下，淀粉酶液化应用比较

[0162] 底物浓度(°Bé) Wild type DE(％) 8008突变体5DE(％)12 19.53 22.93
15 18.87 21.75
18 17.06 21.46
20 15.72 20.89

[0163] 结果显示，8008突变体5明显优于wild type，8008突变体5在不同底物浓度情况下，12-18°Bé液化正合适，而且蛋白絮凝好，而在20°Bé，液化效果仍较好，蛋白絮凝正常，说明本发明α淀粉酶变体可以进行浓浆液化，有效节约工厂成本。

[0164] 其次，我们通过在不同淀粉pH(4.8、5.2、5.4、5.6、5.8)条件下的液化实验，测定了淀粉酶对高底物浓度的耐受性。液化反应条件同上所述，喷射温度为108℃，加酶量为0.4kg/tDS，以wild type为对照，结果见表8和图10。

[0165] 表8:在不同pH下，淀粉酶液化应用比较

[0166]pH Wild type DE(％) 8008突变体5DE(％)
4.8 7.46 16.17
5.2 16.89 20.33
5.4 17.42 20.79
5.6 17.96 21.35
5.8 18.44 21.81

[0167] 如表8所示，在pH4.8-5.8条件下，本发明α淀粉酶变体仍能正常液化，说明本发明α淀粉酶变体对低pH具有较强的耐受性，而wild type耐酸性较差。

[0168] 最后，因为淀粉酶在酒精工业生产上有重要应用，我们还测试了淀粉酶在酒精生产上的液化效果，配制不同料水比的玉米粉(40目)，用盐酸调节pH至5.8，加入0.145kg/tDS淀粉酶。在95℃蒸煮液化120min。反应结束后，测定样品DE和粘度，同时与Liquozyme Supra(购自Novozymes)进行对比试验，。结果见表9和图11。

[0169] 表9:淀粉酶在玉米酒精液化上的应用比较

[0170]料水比 DE(％) 粘度(mPas)
淀粉酶-1:2 12.36 1529
淀粉酶-1:2.3 12.95 1007
淀粉酶-1:2.5 13.24 498
淀粉酶-1:2.7 13.64 381
Liquozyme Supra-1:2 12.19 1702
Liquozyme Supra-1:2.3 12.78 1114
Liquozyme Supra-1:2,5 12.88 506
Liquozyme Supra-1:2.7 13.32 352

[0171] 如表9所示，本发明α淀粉酶变体与Liquzoyme Supra可以达到同样的应用效果。说明其可以应用于玉米酒精工业。

[0172] 综上所述，依照本发明中的实验结果，该系列L型淀粉酶变体有较好的耐热性、pH耐受性，能应用于高浓度淀粉浆液化，因此能应用于淀粉糖行业和酒精行业。

[0173] 本发明的实施例除了应用了本领域内的技术方法外，更离不开发明主旨的指导。因此，本发明不仅限于所公开的具体实施例，更要覆盖本发明精神和范围内的修订条款，详见权利要求。