一种提高霍山石斛原球茎生物碱含量的方法

摘要

本发明提供的是一种提高霍山石斛原球茎生物碱含量的方法，以霍山石斛原球茎作为材料，利用拟茎点霉诱导子提高霍山石斛原球茎的生物碱含量。本发明研究了拟茎点霉诱导子对霍山石斛原球茎悬浮培养时生物碱含量的影响，旨在为霍山石斛大规模工厂化生产生物碱等药用成分提供新思路，为以后霍山石斛的药源开发提供理论基础。

权利要求

1.一种提高霍山石斛原球茎生物碱含量的方法，其特征在于：将霍山石斛原球茎放于含有拟茎点霉诱导子的培养基中培养。

2.根据权利要求1所述的一种提高霍山石斛原球茎生物碱含量的方法，其特征在于：具体方法包括如下：（1）取长期保存的霍山石斛原球茎，取出后置于1/2固体培养基中培养继代，筛选出长势良好，无分化的原球茎；

（2）筛选出的霍山石斛原球茎接种于1/2 MS液体培养基中，在光照强度为2000 lx的条件下，用摇床以110 r/min的转速对霍山石斛原球茎进行液体震荡培养，培养基pH为5.8，霍山石斛球茎的培养周期为45 d，每隔45 d继代一次，防止原球茎出现分化或褐化；

（3）将未活化的拟茎点霉菌株接种于PDA培养基中进行活化复壮培养1周；挑选拟茎点霉长势良好的菌落转入到上述不添加琼脂的PDA液体培养基中，在黑暗、28 ℃、110 r/min的环境条件下，进行大量增殖培养2周，获得拟茎点霉诱导子；

（4）将步骤（2）获得的霍山石斛原球茎于培养基1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+KT 0.05 mg/L+

20 g/L蔗糖中培养，pH调为5.4，同时加入拟茎点霉诱导子100-300 mg/L，于温度为25±2 ℃，光照时间为12 h/d，光照强度为2000 lx，摇床转速为110 r/min的条件下培养5-11 d。

说明书

一种提高霍山石斛原球茎生物碱含量的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高霍山石斛原球茎生物碱含量的方法。

背景技术

[0002] 霍山石斛(Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng)，俗称米斛，为兰科石斛属的多年生附生草本植物，产于大别山区的安徽省霍山县，不仅是安微道地药材之一，还是被2005版《中华人民共和国药典》记录在册的九种药用石斛之一。具有生津益胃、明目清喉、抗癌防癌、缓解疲劳等多种功效。霍山石斛常与苔藓、石苇等草本植物附生在一起，多生长于温凉高湿的地方，故其生长地域极为狭窄，再加上其自然繁育能力低，生长速度慢，药用价值高使人类过度采挖利用，野生的霍山石斛资源已所剩无几。所幸从20世纪50年代末开始，国内的学者就开始对霍山石斛资源的可持续发展与利用进行了调查和研究。目前常用的技术是离体快繁，但是由于霍山石斛繁殖周期长，特别是药用成分含量低的现象却一直无法得到解决，降低了其药用价值。

[0003] 霍山石斛主要成分为生物碱和多糖，其药理作用与二者有着密切关联。特别是生物碱类物质具有清音明目、止痛退热、抗白内障、保护胃肠道等多种作用，是石斛中最重要的有效活性成分之一。生物碱是一种碱性有机化合物，并具有显著的生理活性，由于其在植物体内的广泛存在，因而又被称为“植物碱”。石斛属植物生物碱的首次分离是1932年由日本的铃木秀干在金钗石斛上完成的，并将之命名为石斛碱(Dendrobine)。后人又不断从石斛属植物中提取分离出了十多种生物碱，1964年，犬伏康夫确认了石斛属植物霍山石斛生物碱的结构为为倍半萜骨架结构。但生物碱在石斛属植物中的含量普遍都较少，并且不同种类的石斛其生物碱含量也会有所不同。诸燕等对17个种质41个样品的铁皮石斛进行了研究，发现其生物碱含量会因石斛的种质和种植年限的不同而有所差异。丁亚平把安微霍山县内的3种石斛的茎部的总生物碱含量进行了测定，其结果为：霍山石斛0.0291%，铁皮石斛0.024%，铜皮石斛0.028%。

[0004] 真菌诱导子是一种特殊的生化信号，其来自于真菌，具有专一、高效、有选择性地诱导某些特定基因的表达的作用。其在与植物的互相作用过程中，能和胞外特定受体蛋白相结合，然后刺激细胞分泌信号分子，进而调控次生代谢途径的相关基因，从而促进合成、积累植物体内特定的次生代谢产物。初次报道真菌诱导子是在 1968年，Cruickshand等人将来自于丛梗孢菌的菌丝体中的一种多肽提取出来，作用于菜豆上，发现这种多肽能够诱导菜豆的内果皮形成并且积累菜豆素，随后人们对真菌诱导子进行了更为广泛的研究。孙美玲发现真菌诱导子能够促进白桦悬浮细胞中白桦酯醇的生成。王红等对青蒿的发根用3种真菌诱导子来进行处理，结果发现均能促进青蒿发根中次生代谢物青蒿素的积累。而本发明所采用的拟茎点霉诱导子是通过分离拟茎点霉菌丝体，将细胞灭活破碎制备而成的含有拟茎点霉菌丝体及其代谢物的无菌溶液。拟茎点霉诱导子作为真菌诱导子其中的一个种类，能促进植物体产生代谢物质，这与徐小萍关于龙眼拟茎点霉诱导子能明显提高龙眼胚性愈伤组织中的多糖含量的研究结果一致。

[0005] 由此可见，通过添加真菌诱导子来调节植物的次生代谢途径，是提高植物组织细胞培养中次生代谢产物产量的重要方式。本发明采用拟茎点霉的菌丝提取物来作为真菌诱导子，通过其对霍山石斛的不同处理来对霍山石斛生物碱的含量的影响做进一步的探讨，以期为霍山石斛大规模工厂化生产次生代谢物打下基础。

[0006] 植物细胞的悬浮培养是从植物愈伤组织的液体培养基础上发展而来的一种更高效的培养方式，充分利用霍山石斛原球茎易分散、繁殖速率快、代谢全能性的特性来进行液体悬浮培养克服了试管苗生根弱、移栽困难的限制，可以大幅度提高原球茎增殖速率及其药用成分含量，是解决植物药用资源紧缺的一大重要途径。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种提高霍山石斛原球茎生物碱含量的方法。

[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0009] 一种提高霍山石斛原球茎生物碱含量的方法，将霍山石斛原球茎放于含有拟茎点霉诱导子的培养基中培养。

[0010] 具体方法包括如下：

[0011] （1）取长期保存的霍山石斛原球茎，取出后置于1/2固体培养基中培养继代，筛选出长势良好，无分化的原球茎；

[0012] （2）筛选出的霍山石斛原球茎接种于1/2 MS液体培养基中，在光照强度为2000 lx的条件下，用摇床以110 r/min的转速对霍山石斛原球茎进行液体震荡培养，培养基pH为5.8，霍山石斛球茎的培养周期为45 d，每隔45 d继代一次，防止原球茎出现分化或褐化；

[0013] （3）将未活化的拟茎点霉菌株接种于PDA培养基中进行活化复壮培养1周；挑选拟茎点霉长势良好的菌落转入到上述不添加琼脂的PDA液体培养基中，在黑暗、28 ℃、110 r/min的环境条件下，进行大量增殖培养2周，获得拟茎点霉诱导子；

[0014] （4）将步骤（2）获得的霍山石斛原球茎于培养基1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+KT 0.05 mg/L+20 g/L蔗糖中培养，pH调为5.4，同时加入拟茎点霉诱导子0-300 mg/L，于温度为25±2 ℃，光照时间为12 h/d，光照强度约为2000 lx，摇床转速为110 r/min的条件下培养5-11 d。

[0015] 本发明的优点在于：利用250 mg/L拟茎点霉诱导子浓度处理霍山石斛原球茎7 d时其生物碱含量能达到0.09033%。因此，利用拟茎点霉诱导子处理霍山石斛原球茎对其工厂化大规模生产生物碱具有重要意义。

附图说明

[0016] 图1 拟茎点霉复壮培养1周。

[0017] 图2 拟茎点霉增殖培养2周。

具体实施方式

[0018] 1材料与方法

[0019] 1.1试验材料

[0020] 本试验的材料为体外诱导并长期保存的霍山石斛原球茎，来源于福建农林大学园艺植物生物工程研究所。取出后置于1/2固体培养基中培养继代，筛选出长势良好，无分化的原球茎作为试验材料。

[0021]  1.2试验方法

[0022] 1.2.1液体培养

[0023] 将前期在1/2 MS固体培养基上培养并筛选出的霍山石斛原球茎接种于1/2 MS液体培养基中，在光照强度约为2000 lx的条件下，用摇床以110 r/min的转速对霍山石斛原球茎进行液体震荡培养，培养基pH在高压前调节为5.8，培养容器使用200 mL锥形瓶，装液量为60 mL左右。霍山石斛诱导子的培养周期为45 d，因此应每隔45 d继代一次，防止原球茎出现分化或褐化。

[0024]  1.2.2真菌拟茎点霉诱导子的制备

[0025] 将未活化的拟茎点霉的菌株接种于PDA培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、H2O 1 L）中进行活化复壮培养1周，如图1；挑选拟茎点霉长势良好的菌平板分成大小适中的小块分别转入到上述不添加琼脂的PDA液体培养基中，在黑暗、28 ℃、110 r/min的环境条件下，进行大量增殖培养2周，如图2；对获得的培养基进行减压抽滤去除菌液，并且用蒸馏水重复抽滤3遍，称取5 g菌丝用细胞匀浆器破碎研磨，并定容至100 mL在121 ℃高压条件下灭菌20 min后，置于4 ℃冰箱中贮存待用。用苯酚硫酸法测定所得菌液中总糖含量的浓度，并以此浓度来标定菌液的浓度。

[0026] 1.2.3样品的处理方法

[0027] 本试验以霍山石斛原球茎作为材料，根据吕凯强对霍山石斛原球茎离体培养优化的最佳条件：1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+KT 0.05 mg/L为基本培养基，加入20 g/L蔗糖，pH调为5.4，并按试验处理需要，加入拟茎点霉诱导子，浓度分别为0、100、150、200、250、300 mg/L，在含有50 mL处理培养基的200 mL锥形瓶中接入4.0 g的霍山石斛原球茎，于温度为25±2 ℃，光照时间为12 h/d，光照强度约为2000 lx，摇床转速为110 r/min的条件下分别培养5、
7、9、11 d。试验材料收获后，用双蒸水将所得的霍山石斛原球茎清洗3 5遍并除杂后，将原~
球茎放置于恒温干燥箱中，在60 ℃的温度下进行烘干至重量保持不变，接着将干燥后的试验材料用小型粉碎机粉碎，过40目筛，密封于放有干燥剂的密封袋中，待用。

[0028] 1.2.4生物碱标准曲线的制作

[0029] 采用酸性染料比色法测定生物碱含量。精密称取1.00 mg石斛碱对照品，用氯仿溶解后定容至100 mL，分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL石斛碱溶液加入到60 mL分液漏斗中，补充氯仿至体积为10.0 mL。加入5.0 mL领苯二甲酸钾-氢氧化钠PH 4.6，1.0 mL溴甲酚绿0.04 %溶液，剧烈震荡3 min，静置30 min。用氯仿并干燥的药棉过滤氯仿层，取续滤液6.0 mL，加入0.01 mol/L氢氧化钠无水乙醇溶液1.0 mL，摇匀后静置。以未添加石斛碱对照品溶液为空白对照，用紫外分光光度计在620 nm波长下比色测定吸光值。以稀释后的石斛碱浓度为横坐标，样品的吸光度为纵坐标制作标准曲线。

[0030] 1.2.5霍山石斛原球茎生物碱的测定

[0031] 精密称取霍山石斛原球茎干燥粉末样品0.4 g放入60 ml磨口三角烧瓶中，用适量(2.0 ml)浓氨水密塞浸润30 min。加入氯仿10.0 ml，称重记录。60 ℃超声波震荡提取30 min，再补充氯仿至原重。过滤，取续滤液2.0 ml，续滤液加入60 ml分液漏斗中，再加入氯仿8.0 mL。加入5.0 mL的邻苯二甲酸氢钾pH4.6和1.0 mL的溴甲酚绿0.04%溶液，将分液漏斗剧烈震荡3 min，静置30 min。过滤氯仿层，取续滤液6.0 mL，加入1.0 mL的0.01 mol/L氢氧化钠无水乙醇溶液，充分震荡摇匀后静置。以未添加石斛碱对照品溶液的作为为空白对照，用紫外分光光度计在620 nm波长下比色测定吸光值。

[0032] 参照上述标准曲线，通过所测定出来的吸光值，计算出对应吸光值下标准溶液中的霍山石斛生物碱含量，以公式：生物碱含量(%)= C * D/W计算出所提取的霍山石斛生物碱含量，其中C为样品溶液中石斛碱的浓度，D为样品溶液的稀释倍数，W为所测样品的实际重量。

[0033] 1.2.6数据分析

[0034] 本试验采取SPSS 19.0和EXCEL数据处理软件对所得到的数据进行具体分析、总结。

[0035] 2结果与分析

[0036] 2.1标准曲线回归方程建立

[0037] 通过紫外分光光度计在620 nm波长下测定的吸光值，由此绘制的生物碱标准曲线，经统计分析得到标准曲线回归方程式为y = 0.0046x +0.005，R² = 0.9975，说明所制作标准曲线可用于霍山石斛生物碱的测定。

[0038]  2.2拟茎点霉诱导子不同浓度处理 5 d对原球茎生物碱含量影响的分析[0039] 通过统计分析发现，将霍山石斛原球茎于拟茎点霉诱导子不同浓度下处理5 d而后测定其生物碱含量，结果见表1；通过表1可知，当拟茎点霉诱导子浓度为250 mg/L时，其生物碱含量最高，为0.051%；当拟茎点霉诱导子浓度为0 mg/L时，其生物碱含量最低，为0.00633%。在处理天数为5 d的情况下，霍山石斛原球茎生物碱的含量随拟茎点霉诱导子浓度的升高呈现出先上升后下降的趋势。

[0040] 表1 拟茎点霉诱导子不同浓处理5 d时原球茎生物碱的含量

[0041]

[0042] 2.3拟茎点霉诱导子不同浓度处理 7 d对原球茎生物碱含量影响的分析[0043] 通过统计分析发现，将霍山石斛原球茎于拟茎点霉诱导子不同浓度下处理7 d而后测定其生物碱含量，结果见表2和；通过表2可知，当拟茎点霉诱导子浓度为250 mg/L时，其生物碱含量最高，为0.09033%；当拟茎点霉诱导子浓度为0 mg/L时，其生物碱含量最低，为0.013%。在处理天数为7 d的情况下，霍山石斛原球茎生物碱的含量随拟茎点霉诱导子浓度的升高呈现出两个峰值，但总体呈现出先上升后下降的趋势。

[0044] 表2 拟茎点霉诱导子不同浓度处理7 d时原球茎生物碱的含量

[0045]

[0046] 2.4拟茎点霉诱导子不同浓度处理 9 d对原球茎生物碱含量影响的分析[0047] 通过统计分析发现，将霍山石斛原球茎于拟茎点霉诱导子不同浓度下处理9 d而后测定其生物碱含量，结果见表3；通过表3可知，当拟茎点霉诱导子浓度为200 mg/L时，其生物碱含量最高，为0.07%；当拟茎点霉诱导子浓度为0 mg/L时，其生物碱含量最低，为0.017%。在处理天数为9 d的情况下，霍山石斛原球茎生物碱的含量随拟茎点霉诱导子浓度的升高呈现出两个峰值，但总体呈现出先上升后下降的趋势。

[0048] 表3 拟茎点霉诱导子不同浓度处理9 d时原球茎生物碱的含量

[0049]

[0050] 2.5拟茎点霉诱导子不同浓度处理 11 d对原球茎生物碱含量影响的分析[0051] 通过统计分析发现，将霍山石斛原球茎于拟茎点霉诱导子不同浓度下处理11 d而后测定其生物碱含量，结果见表4；通过表4可知，当拟茎点霉诱导子浓度为200 mg/L时，其生物碱含量最高，为0.0903%；当拟茎点霉诱导子浓度为0 mg/L时，其生物碱含量最低，为0.01233%。在处理天数为11 d的情况下，霍山石斛原球茎生物碱的含量随拟茎点霉诱导子浓度的升高呈现出先上升后下降的趋势。

[0052] 表4 拟茎点霉诱导子不同浓度处理11 d时原球茎生物碱的含量

[0053]

[0054] 2.6拟茎点霉诱导子不同浓度及不同处理天数对原球茎生物碱含量影响的总体分析

[0055] 通过试验数据分析发现，将霍山石斛原球茎分别接种于拟茎点霉诱导子浓度为0、100、150、200、250、300 mg/L的液体悬浮培养基中，培养5、7、9、11 d后统计其生物碱含量，结果见表5。通过表5可以看出，拟茎点霉诱导子浓度为250 mg/L，处理天数为7 d 下原球茎生物碱含量最高，为0.09033%；添加拟茎点霉诱导子培养的处理组均比未添加诱导子培养的的生物碱含量高，说明拟茎点霉诱导子在一定程度上可以促进霍山石斛原球茎生物碱含量的生成与累积。同一诱导子浓度下，原球茎生物碱含量随处理天数的增加呈现先增加后下降的趋势；同一处理天数下，原球茎生物碱含量随诱导子浓度的增加总体呈现先上升后下降的趋势。

[0056] 表5拟茎点霉诱导子不同浓度及不同处理天数下原球茎生物碱的含量

[0057]

[0058] 对试验结果进行主效应方差分析（见表6 ），结果发现处理天数、处理浓度及两者的交互作用的显著性P值均为0，小于0.01，说明真菌诱导子的处理天数、浓度及两者的交互作用对霍山 石斛原球茎生物碱含量的影响在0.01水平上均具有极显著性差异。通过比较这几个因素的F值得大小可知，影响霍山石斛原球茎生物碱含量累积因素的主次顺序为诱导子浓度>处理天数>处理天数*浓度。综上可知，对霍山石斛原球茎生物碱含量积累影响最大的因素是诱导子浓度，最小的是处理天数浓度。

[0059] 表6 拟茎点霉诱导子的不同处理天数和浓度对原球茎生物碱含量影响的主效应检验

[0060]

[0061] 对24个处理进行描述与多重比较分析，再筛选出最优处理及与其不存在显著性差异的处理进行描述与多重比较，最后选出最有利于霍山石斛原球茎生物碱含量积累的最佳处理。

[0062] 经F检验发现（表6），试验中三个因素间存在交互作用，因此在24个处理中选择最有利于霍山石斛原球茎生物碱含量积累的最佳处理，由下表3 各个处理的描述可知，最优处理为处理11，其生物碱含量均值为0.09033%。

[0063] 表 7 拟茎点霉诱导子的不同处理天数和浓度对原球茎生物碱含量影响的描述[0064]

[0065] 对获得的实验结果用SPSS 19.0软件进行方差齐次性检验（见表8），可以分析得知：不同处理天数及不同浓度的拟茎点霉诱导子对霍山石斛原球茎生物碱含量的积累具有显著的影响。由于显著性P值为0.010，,小于0.05，说明各处理之间存在显著差异，不存在方差齐次性。

[0066] 表 8 拟茎点霉诱导子的不同处理天数和浓度对原球茎生物碱含量影响的方差齐性检验

[0067]

[0068] 由于方差不存在齐次性，因此运用Dunnett T3法进行两两比较。由之前的分析可知最佳处理为处理11，因此选择处理11与其他处理的多重比较表进行分析，通过下表9、表10可知，处理11与处理10、处理12、处理16、处理22、处理23的显著性P值分别为0.064、
0.991、0.274、0.919、0.091.均大于0.05，说明处理11与处理处理10、12、16、22、23对霍山石斛原球茎生物碱含量的积累不存在显著性差异；处理11与处理5、处理18、处理21的显著性P值分别为0.012、0.030、0.016，大于0.01，小于0.05，说明处理11与处理5、18、21对霍山石斛原球茎生物碱含量的积累存在显著性差异，但不存在极显著性差异；而处理11与24个处理中的其他处理的P值均小于0.01，说明处理11与其他处理均对霍山石斛原球茎生物碱含量的积累存在极显著性差异。因此，处理5、10、11、12、16、18、21、22和23为最有利于霍山石斛原球茎生物碱含量积累的处理。

[0069] 表9 拟茎点霉诱导子的不同处理天数和浓度对原球茎生物碱含量影响的多重比较

[0070]

[0071] * 均值差的显著性水平为 0.05。

[0072] 表 10 拟茎点霉诱导子的不同处理天数和浓度对原球茎生物碱含量影响的多重比较

[0073]

[0074] * 均值差的显著性水平为 0.01。

[0075] 通过以上分析可知，最优处理及与其不存在显著性差异的处理为处理5、10、11、12、16、18、21、22和23，这9个处理的具体情况如下表11 ，综合考虑大规模工厂化生产的时间、成本问题，则当拟茎点霉诱导子浓度为 250 mg/L的培养基中处理7 d为最有利于霍山石斛原球茎生物碱积累的处理。

[0076] 表 11 最优处理情况筛选表

[0077]

[0078] 3讨论

[0079] 3.1拟茎点霉诱导子促进霍山石斛原球茎生物碱含量的积累

[0080] 本试验研究发现，添加了拟茎点霉诱导子的处理组均比未添加诱导子的空白组的生物碱含量高；250 mg/L拟茎点霉诱导霍山石斛原球茎7 d能显著提高霍山石斛原球茎生物碱含量，能达到0.09033%。本试验所测出的最高生物碱含量(0.09033%)均高于丁亚平(0.0291%)、罗建平(0.0261%测出的生物碱含量，霍山石斛中诱导子作为植物组织培养中的一种添加剂可以通过调节植物细胞的酶活性来有效调节植物的次生代谢途径，真菌诱导子目前已被广泛用于植物愈伤组织或悬浮细胞中次生代谢物的生产。本试验初步探讨了拟茎点霉诱导子对霍山石斛原球茎悬浮培养时生物碱含量的影响，旨在为霍山石斛大规模工厂化生产生物碱等药用成分提供新思路，为以后霍山石斛的药源开发提供理论基础。

[0081] 本试验结果表明拟茎点霉诱导子能显著提高霍山石斛原球茎生物碱的含量，可能原因是：生物碱是植物中与抗性相关的代谢产物，而拟茎点霉诱导子里含有活性物质，这些活性物质里的某些成分可能诱导了霍山石斛原球茎细胞内的防卫反应，加速其次生代谢途径，促进了次生代谢物，譬如生物碱的积累，这与Hahlbrock等发现在欧芹中加入缩氨酸诱导子其与防卫反应有关的基因被激活可能有类似作用。

[0082] 3.2 不同浓度和天数的拟茎点霉诱导子处理霍山石斛原球茎会影响生物碱含量的积累

[0083] 试验结果发现不同浓度和不同天数的拟茎点霉诱导子处理对霍山石斛原球茎生物碱含量有着不同的影响。在相同培养天数下，霍山石斛原球茎生物碱含量随着诱导子浓度的增加总体呈现先上升后下降的趋势，这与林艳君得出的结论相一致。低浓度拟茎点霉诱导子(100 mg/L、150 mg/L)对霍山石斛原球茎生物碱含量的促进作用很不显著，可能原因是诱导子浓度过低影响细胞间信号传导的过程。在拟茎点霉诱导子同浓度条件下，随着培养天数的增加，霍山石斛原球茎生物碱的含量总体呈现先上升后下降的趋势。在原球茎生长初期，还需要逐步适应新的培养基环境，这时对拟茎点霉诱导子的刺激反应比较迟钝，代谢也比较缓慢；等到原球茎适应后，拟茎点霉诱导子可以通过改变原球茎参与次生代谢途径的酶的活性来提高其生物碱的含量；而当原球茎在诱导子处理下培养时间过久，拟茎点霉诱导子可能会对原球茎的细胞产生毒害作用，从而影响其生物碱的合成与积累。

[0084] 真菌诱导子诱导植物体次生代谢物的合成主要受其诱导子种类、浓度、诱导时间及加入时期等方面影响。本试验研究了拟茎点霉诱导子不同浓度和不同诱导时间对霍山石斛原球茎生物碱含量的影响，但未涉及诱导子加入时期对其生物碱含量的影响。Brodelius表示，真菌诱导子在植物组织培养的细胞生长阶段作用更加显著。为进一步为霍山石斛工厂化大规模增殖及次生代谢物的生产做出贡献，可研究在霍山石斛原球茎的不同生长时期加入真菌诱导子对其生长和次生代谢物的积累有何影响。

[0085] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。