叶酸靶向Pyro光敏的合成和应用转让专利
申请号 : CN201710550348.1
文献号 : CN107337685B
文献日 : 2019-11-22
发明人 : 洪章勇 , 黄伟强
申请人 : 康宏耀源(天津)科技有限公司
摘要 :
本发明采用长链聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)连接Pyro与小分子叶酸来发展新型的光动力治疗药物。Pyro是一种有潜力的光敏化合物，具备高效的单线态氧产生能力和较高消光系数。叶酸分子与肿瘤细胞具有很强的亲和能力。这种经长链聚乙二醇修饰的新型的叶酸靶向的Pyro光敏剂能够明显增加光敏剂在肿瘤组织中的积累能力，并且明显提高光敏剂的光动力治疗效果，不同长度链长的聚乙二醇对光敏剂在肿瘤部位的富集作用及光动力治疗效果有不同的影响。
权利要求 :
1.一种以叶酸为靶向配基的靶向光敏衍生物，其特征在于：该光敏剂以叶酸分子为靶向配基，以聚乙二醇(PEG)为连接链，以叶酸偶联焦脱镁叶绿酸a(Pyro)为光敏基团，其结构为：其中连接链聚乙二醇(PEG)的分子量为1-20kD。
2.如权利要求1所述的光敏衍生物，其特征在于：连接链聚乙二醇(PEG)的分子量为
1kD。
3.如权利要求1或2所述的光敏衍生物在制备治疗肿瘤药物中的用途。
4.如权利要求1或2所述的光敏衍生物在制备肿瘤成像诊断试剂中的用途。
5.如权利要求1或2所述的光敏衍生物的制备方法，其合成路线为：
1)合成如下具有巯基反应基团的叶酸衍生物FA-Cys-SH
2)合成如下具有自由胺基基团的焦脱镁叶酸a衍生物Pyro-Lys-NH2
3)合成如权利要求1所示的光敏衍生物。
说明书 :
叶酸靶向Pyro光敏的合成和应用
[0001] 本发明涉及长链聚乙二醇偶联的叶酸靶向Pyro光敏剂(简称为FA-PEG-Pyro)的合成以及在肿瘤光动力治疗及肿瘤成像诊断方面的应用。
背景技术
[0002] 目前，临床上治疗癌症的方法主要包括放疗、化疗和手术治疗三种手段，然而，这些传统的治疗方法在杀伤肿瘤组织的同时，也会损伤机体正常的组织，造成全身的毒性。光动力治疗(Photodynamic Therapy,PDT)，作为临床上应用的一种微创型治疗策略越来越受到重视。当通过特定波长的光激发光敏剂时，PDT利用组织中的O2产生单线态氧，从而产生一系列的光化学及光生物学过程导致肿瘤组织不可逆的光敏损伤(Dolmans et al.,2003；Dougherty et al.,1998；Sharman et al.,1999)。此外，研究发现PDT还具备其它重要特性，例如：PDT可以重复给药治疗而不会产生耐药性问题(Nseyoet al.,1998)，能够激活机体的抗肿瘤免疫反应(Castano et al.,2006；Triesscheijn et al.,2006)。PDT由于其光学特性也可以作为成像诊断试剂，从而实现肿瘤的诊断和治疗一体化(Josefsen and Boyle,2012)。因此，PDT成为一种越来越重要的肿瘤治疗方法，目前已经被包括中国，美国，欧盟在内的世界上十多个国家的食品和药品监督部门批准用于临床治疗。随着光敏药物被研发升级，光动力治疗在肿瘤治疗方面的研究也越来越深入。
[0003] 然而，由于缺乏理想的光敏剂，限制了光动力治疗作为一线的肿瘤治疗方法的应用(Detty et al.,2004)。目前，尽管美国食品药品监督局(FDA)已经批准了一些光敏类药物进入临床使用，并且很多的光敏剂正在进行临床前研究(Agostinis et al.,2011)，它们都远不是理想的光敏剂。理想的光敏剂应该首先具有高效的光动力杀伤功能，能高效率的杀伤肿瘤细胞；其次它应该具有理想的肿瘤富集功能，增加药物在肿瘤部位的浓度而提高对肿瘤的杀伤能力，同时降低对正常组织的光毒副作用。开发理想的光敏剂对于肿瘤的光动力治疗的临床应用非常重要。Photofrin作为临床上被批准的应用最为广泛的第一代光敏剂，但其治疗波长偏短(630nm)，而且其消光系数不理想(1170L mol-1cm-1)(Van Geel et al.,1995)，因而其产生单线态氧的能力有限，在临床使用中的治疗效果也非常有限(Moriwaki S I et al，2001)。相比photofrin，化合物焦脱镁叶绿酸a(Pyropheophorbide a,Pyro)是一种在某些方面具有更理想特性的光敏剂，它在更长的波长(668nm)下的消光系数(3.79×104L mol-1cm-1)(Jasinski,2009；Sunand Leung,2002)是Photofrin的30倍以上，具有理想的单线态氧量子产率(约为50％)，因此具有强得多的细胞光动力杀伤活性。但是，Pyro也具有致命的缺点限制其在临床上的应用。Pyro的水溶性差，它的药代动力学特性使它无法直接应用于肿瘤治疗；其次它基本不具有肿瘤定位能力，肿瘤组织的浓度低，而正常组织中的药物浓度高，光动力治疗过程会对正常组织产生较为严重的光毒副作用。通过对Pyro进行结构改造，解决它的临床应用的限制缺点，有望发展出理想的光敏剂。
[0004] 提高光敏剂在肿瘤部位的富集能力，能有效增强肿瘤光动力治疗的效果。光敏剂在肿瘤组织中高效靶向富集能提高药物在肿瘤部位的浓度，从而提高杀伤效果，降低给药剂量(Celli et al.,2010；Stefflova et al.,2007)，同时它相对提高肿瘤对于周边正常组织的浓度差，从而减轻对正常组织的损伤(Majumdar et al.,2014)。光敏剂在正常组织中的积累分布，不可避免会在光动力治疗过程中对正常组织造成损伤，而且为追求对肿瘤组织的杀伤作用最大化，使用的光照强度越高，对正常的组织器官的损伤就会越严重(Allison R R et al，2004)。例如，临床上针对肺部病变的光动力治疗，会造成肺部正常组织的大量的坏死而导致急性气管阻塞(Kato H et al，1998)。其次，提升肿瘤富集能力，降低药物在正常组织的分布与积累，还能显著减轻对皮肤，眼睛等的光毒性问题。替莫泊芬(Temoporfin，商品名：Foscan)于2001年在欧洲被批准用于人头颈部鳞状细胞癌的治疗(Brown S B et al,2004)，但由于对正常组织的伤害使得病人非常痛苦，治疗须在病人麻醉的条件下进行，而且由于药物长时间在正常组织中滞留，治疗后需要进行至少两周的严格避光，严重限制了其在门诊和临床上的应用。正是由于其在临床实验中对正常组织严重的副作用，美国FDA禁止批准替莫泊芬进入美国进行临床使用。当前，光动力治疗正是由于缺少高效并且具有高度肿瘤靶向性的光敏药物，导致临床上更多地考虑使用Photofrin等治疗效率较低但是副作用也相对低的光敏剂用于光动力治疗。开发新型的具有靶向能力，代谢速率快，细胞吸收效率高，光化学活性强的光敏剂对于临床肿瘤光动力治疗非常关键。
[0005] 研究表明，通过偶联肿瘤表面高表达受体的靶向配基，可赋予光敏剂主动靶向肿瘤的能力，成为制备肿瘤特异性光敏剂的有效策略。叶酸受体普遍高表达于多数肿瘤细胞表面(Detty et al.,2004；Low and Kularatne,2009；Sudimack and Lee,2000)，叶酸与叶酸受体的亲和力高达0.1-1nM(Kamen and Smith,2004)。此外，叶酸不具有免疫原性和具有更好的肿瘤组织穿透能力(Hilgenbrink and Low,2005；Lu and Low,2002；Mahato et al.)，因此，小分子叶酸可以作为理想的肿瘤靶向分子被广泛应用于肿瘤成像和治疗领域(Amato et al.,2013)。叶酸和异硫氰酸荧光素连接物(folate-FITC，EC17),已经进入到了临床II的实验，其作为一种荧光探针在卵巢癌手术治疗过程中提供实时的指导(Tummers et al.,2016)。99mTc和叶酸相连接(Etarfolatide)也已经进入临床III期实验(Palmer et al.,2013)。叶酸和tubulysin的连接物(EC1456)在临床I期的实验中体现出对实体瘤的良好的治疗效果(Srinivasarao et al.,2015)。我们前期的研究也发现，将小分子叶酸作为靶向基团与Pyro直接相连，对叶酸阳性的皮下肿瘤体现出了良好的选择能力和非常有效的治疗效果(Hong Z et al,2016；中国发明专利，申请号：201610628964.X)。由于叶酸的水溶性以及很强的肿瘤亲和能力，叶酸与Pyro连接物能够提高Pyro的水溶性质和肿瘤富集能力，进而提高光动力治疗效果。
[0006] 光敏剂的高度脂溶性特点给制备高效靶向性的光敏药物带来了困难，传统的光敏剂分子为增强在肿瘤部位的富集，往往被设计成高度脂溶性的结构(Jori G et al.,1992)，这些高度脂溶性的结构给配基偶联型的光敏剂的设计造成问题。首先，光敏剂的高度脂溶性会干扰靶向配基对受体的亲和作用，影响靶向选择能力，导致光敏基团虽然与配基分子偶联，但往往并不具有理想的肿瘤靶向特性，其次，光敏剂分子在体内的代谢分布性质与光敏剂自身的亲脂性和亲水性直接相关，脂溶性高的分子易与血浆蛋白相结合，导致容易在组织中积累和延长体内滞留时间，对光敏剂来说就容易产生严重的光毒副作用，而强亲水性的光敏剂分子则有望从体内快速代谢清除。比如说，Talaporfin就是一种强亲水性修饰的Pyro的类似物，2004年在日本被批准用于肺癌的治疗(Matsumura H et al.,
2008)，分子的亲水性非常好，光动力治疗后基本没有光毒性的副作用，无需长时间避光。因此为了提高配基偶联型的光敏剂对肿瘤的亲和能力及改善体内药代动力学特性，我们需要对设计的配基偶联的光敏剂分子进行结构改造。文献中报道，对传统光敏剂进行化学修饰，显著增强分子的亲水性能，能大大提高配基偶联型的靶向光敏剂对肿瘤的选择性，同时大大降低体内的滞留时间。例如：Mingfeng Bai课题组和Hisataka Kobayashi分别在Cell和Nature medicine上报道了一种高度水溶性的酞菁硅类光敏剂用于靶向的光动力治疗(Spring B Q et al.,2014)。我们实验室之前也开发了一系列的具有高度水溶性的酞菁类的光敏剂用于靶向光动力治疗(Li Y et al.,2015)，也显著增强了对肿瘤的选择能力。
2008)，分子的亲水性非常好，光动力治疗后基本没有光毒性的副作用，无需长时间避光。因此为了提高配基偶联型的光敏剂对肿瘤的亲和能力及改善体内药代动力学特性，我们需要对设计的配基偶联的光敏剂分子进行结构改造。文献中报道，对传统光敏剂进行化学修饰，显著增强分子的亲水性能，能大大提高配基偶联型的靶向光敏剂对肿瘤的选择性，同时大大降低体内的滞留时间。例如：Mingfeng Bai课题组和Hisataka Kobayashi分别在Cell和Nature medicine上报道了一种高度水溶性的酞菁硅类光敏剂用于靶向的光动力治疗(Spring B Q et al.,2014)。我们实验室之前也开发了一系列的具有高度水溶性的酞菁类的光敏剂用于靶向光动力治疗(Li Y et al.,2015)，也显著增强了对肿瘤的选择能力。
[0007] 然而，对于大多数卟啉类光敏剂而言，由于自身固定结构的限制，对母核结构直接进行改造来改善亲水/疏水性质是比较困难的。采用一些相对简便的方法来增强光敏剂的亲水性能，同时改善光敏剂分子中高度脂溶性结构对肿瘤靶向配基的亲和能力的影响，是一个更为实用有效的策略。聚乙二醇(PEG)是一种以氧乙烯基为基本骨架的聚合物，具有很好的生物相容性，没有毒副作用，已经被FDA批准应用于各类药物的改造。聚乙二醇具有良好的水溶性特点，因此与脂溶性药物相连能显著提高药物的水溶性能。例如，聚乙二醇能够使得非常难溶解的抗肿瘤药物喜树碱的溶解度增加近800倍；聚乙二醇化大大提高紫杉醇的溶解度，增加其对肿瘤的治疗效果(GreenwaldR B et al.,2003)。而且，聚乙二醇能显著降低分子被细胞非特异性的吸附，防止靶向药物在投递过程中被正常细胞非特异性结合(Veronese F M et al.,2005)。聚乙二醇作为连接链被广泛用于高灵敏的靶向选择性肿瘤检测成像试剂的研究(Chen X,2004)，例如，Yueqing Gu等人报道了以叶酸为靶向，聚乙二醇修饰的ICG分子能够高效地靶向叶酸阳性的肿瘤组织，其肿瘤部位荧光强度与正常组织部位荧光强度的比值达到了10:1(Liu F et al.,2010)。Lee Josephson等人以聚乙二醇连接RGD靶向配基与成像试剂Cy5.5和DOTA两种成像分子，能够有效地通过荧光成像和SPECT/CT聚乙二醇成像双成像体系指示肿瘤组织细胞(Guo Y et al.,2012)。Tayyaba Hasan等人使用聚乙二醇作为链接链介导了脂溶性光敏剂BDP衍生物(Benzoporphyrinderivative)和抗EGFR的抗体Cetuximab相偶联，能够特异性地杀伤转移的卵巢癌肿瘤组织细胞(Spring B Q et al.,2014)。
[0008] 为了解决Pyro光敏剂的高脂溶性问题，及提高我们前期制备的叶酸偶联Pyro光敏剂对肿瘤的富集及杀伤效果，在本发明中，我们选择采用一系列不同链长的聚乙二醇(分子量分别为1千，3.5千，5千和1万)作为连接链介导小分子靶向配基叶酸和光敏化合物Pyro的连接。选用高度亲水的聚乙二醇链来连接Pyro与叶酸分子，显著改善了叶酸偶联Pyro的光敏剂分子的性能，合成后的化合物具有良好的水溶性，并极大增强了对肿瘤的靶向富集能力，改善了光敏剂在体内的代谢分布特性，同时显著增强了动物水平上的光动力治疗能力，显著降低药物的治疗用量，增强药物治疗效果。这些优势使得新合成的聚乙二醇偶联的叶酸靶向Pyro光敏剂具有很好的临床开发应用的潜力。实验还发现，随着连接链聚乙二醇分子量的不同，其在动物肿瘤模型上的药代动力学特性，肿瘤富集能力与富集时间，肿瘤光动力杀伤能力等也有较大的区别，在肿瘤的光动力治疗及肿瘤的光学成像诊断的应用上可能也会有所不同。
发明内容
[0009] 一种以聚乙二醇为连接链偶联的以叶酸为靶向配基的光敏化合物(简称为FA-PEG-Pyro)，其结构为：
[0010]
[0011] 其中连接链聚乙二醇(聚乙二醇)的分子量可以是1kDa，3.5kDa，5kDa和10kDa，相应的FA-PEG-Pyro化合物分别简称为FA-PEG1K-Pyro，FA-PEG3.5K-Pyro，FA-PEG5K-Pyro和FA-PEG10K-Pyro。
[0012] 最优选化合物分子式如下：
[0013]
[0014] 其中聚乙二醇连接链的分子量在1千左右。
[0015] 本发明还提供所述光敏衍生物在制备治疗肿瘤药物和肿瘤成像诊断试剂中的用途。
[0016] 本发明还提供所述光敏化合物的制备方法，其合成路线如附图1所示。
[0017] 在本发明中，我们使用叶酸作为靶向配基，聚乙二醇(PEG)作为连接链以改善提高光敏剂焦脱镁叶绿酸a(Pyro)的体内代谢分布，增加药物的水溶性及对肿瘤组织的靶向富集能力。我们合成了上述的一系列化合物，并在细胞水平及动物肿瘤模型上评价了这些化合物在肿瘤光动力治疗及肿瘤成像方面的潜力。化合物在体外细胞水平实验上，对KB口腔鳞癌细胞系及4T1乳腺癌细胞系具有很强的杀伤力，并对叶酸受体高表达的KB口腔鳞癌细胞系及叶酸受体低表达的A549肺癌细胞系显示出理想的选择性。在杀伤力方面，分子量大的聚乙二醇修饰会降低分子的光动力治疗活性，尤其是5千或1万分子量的聚乙二醇，修饰后的光敏剂光动力活性下降非常明显，但分子量1千的聚乙二醇链的修饰对分子的光动力活性影响不大。在构建的小鼠的肿瘤模型上，活体成像系统研究实验结果证实，通过选用长链聚乙二醇作为链接臂偶联叶酸与Pyro分子，显著增强光敏剂在肿瘤部位的富集能力，在给药剂量相同的条件下，随着聚乙二醇连接链的加长，光敏剂在肿瘤部位的富集能力也也会进一步增强，但药物在体内的循环时间相应延长，导致体内的滞留时间也在增强，短链的分子量1千的聚乙二醇偶联的叶酸与Pyro分子FA-PEG1K-Pyro能够在相对较短的时间内，快速地在肿瘤组织中积累富集。所以从肿瘤富集的角度来看，分子量较大的聚乙二醇链的修饰可能有利于成像试剂在肿瘤的更好的富集，增强肿瘤与正常组织的对比度，延长肿瘤部位成像的时间，这更有利于制备光学成像诊断试剂；而相对分子量较小的短链聚乙二醇修饰有利于光敏剂在体内的快速清除，减少光动力治疗后的避光时间，更有利于用来制备光动力治疗用的光敏剂。在小鼠KB口腔鳞癌动物模型肿瘤治疗实验显示，分子量1千的聚乙二醇修饰的FA-PEG1K-Pyro光敏剂光动力治疗效果明显地增强，相比叶酸与Pyro直接相连的光敏剂(FA-Pyro)，此光敏剂在动物水平的治疗剂量显著降低，只需在五到十分之一的剂量下就能达到对肿瘤的完全杀伤。本发明制备的不同链长聚乙二醇修饰的光敏剂在肿瘤的光动力治疗及肿瘤的光学成像诊断方面具有应用价值。
[0018] 此外本发明通过固相合成和液相合成相结合的方式，以非常简单实用的方式得到了一系列靶向光敏药物。
[0019] 本发明中最优选化合物FA-PEG1K-Pyro(连接链聚乙二醇的长度为1千分子量左右)具有很好的药代动力学性质，在肿瘤组织中有较强的富集能力，并且快速的从体内清除，同时具有高效的光动力杀伤能力，具有很好的选择杀伤叶酸受体高表达的肿瘤细胞的能力和对实体瘤的治疗效果，是能够用于肿瘤光动力治疗的光敏类药物。通过对KB口腔鳞癌和NCI-N87胃癌细胞系的杀伤，及KB口腔鳞癌动物模型的肿瘤治疗实验，结果显示FA-PEG1K-Pyro能有效地杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤组织的增长；而在相同剂量条件下光敏剂Pyro并没有明显的肿瘤抑制作用。因此，FA-PEG1K-Pyro具有制备抗肿瘤的光动力治疗药物及肿瘤光学成像诊断试剂的用途。
附图说明
[0020] 图1是分子FA-PEG-Pyro合成过程示意图
[0021] 图2是FA-PEG-Pyro在细胞水平上光动力药物活性研究
[0022] 图3是聚乙二醇连接链为1kDa分子量的FA-PEG1K-Pyro选择杀伤能力[0023] 图4是聚乙二醇连接链为1kDa分子量的FA-PEG1K-Pyro化合物的暗毒性分析[0024] 图5是FA-PEG-Pyro在小鼠KB细胞异种移植瘤模型体内随时间分布的药代动力学研究
[0025] 图6是FA-PEG-Pyro在小鼠N87细胞异种移植瘤模型体内随时间分布的药代动力学分析
[0026] 图7是聚乙二醇连接链为1kDa分子量的FA-PEG1K-Pyro对KB小鼠皮下异种移植瘤的体内治疗效果研究
具体实施方式
[0027] 下述实施例用于进一步说明本发明但不意味着限制本发明。
[0028] 实施例1简称为FA-PEG-Pyro的靶向光敏化合物的合成(附图1)
[0029] 1、简称为FA-Cys-SH的化合物的合成
[0030] FA-Cys-SH采用Fmoc为基础的固相合成的方法进行合成。称取1g三苯基氯树脂树脂(1g,0.5mmol,1.0eq)于固相合成器中，加入3ml二氯甲烷(DCM)溶胀5小时。将Fmoc-Cys(Trt)-OH(1.05g,1.8mmol，3.6eq)用2ml二氯甲烷溶解后加入到固相合成器中，室温反应过夜。配置封闭液(甲醇：水＝17:2)，将树脂封闭液加入到固相合成器中，室温封闭30min。用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗树脂5次，5％哌啶DMF溶液脱Fmoc基团2小时。DMF洗树脂5次，叶酸(FA,780mg,1.8mmol,3.6eq)和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU,379mg,1mmol,2eq)溶于4mlDMF中，加入到反应体系中，室温反应过夜。DMF洗5次，加入树脂切割液(三氟乙酸/三异丙基硅烷/苯酚/水(90％:5％:2.5％:2.5％))反应5分钟,将FA-Cys-SH从树脂上切下来。乙醚沉淀3次，水洗3次，甲醇洗5次，真空干燥后即得产物FA-Cys-SH(HRMS(ESI):
calcd for C22H24N8O7S[M+Na]+567.1386,found 567.1385.)。
calcd for C22H24N8O7S[M+Na]+567.1386,found 567.1385.)。
[0031] 2、简称为Pyro-Lys-NH2的化合物的合成
[0032] Pyro-Lys-NH2的合成采用Fmoc(9-芴甲氧羰基)为基础的固相合成方法进行。称取500mg 2-氯三苯甲基氯树脂(0.5mmol)置于固相合成其中，加入1ml二氯甲烷后，将固相合成器置于脱色摇床上，摇晃4小时使得树脂充分溶胀。20min后，称取460mgFmoc保护的赖氨酸即，Fmoc-Lys(mtt)-OH(0.75mmol)，溶于10ml二氯甲烷(DCM)中。将溶胀树脂的二氯甲烷抽滤出去后，加入上述10ml的混合液，室温摇晃4小时，使Fmoc-Lys(mtt)-OH和树脂充分连接。过夜反应后，抽滤除去反应液，用二氯甲烷充分洗涤树脂5次。配置树脂封闭液(甲醇:
DCM＝1:7)，树脂用该封闭液封闭2次，30min/次，将树脂上没有反应的活性位点封闭。充分封闭后，抽滤除去封闭液，树脂用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗5次，1min/次。加入5％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液2次，15min/次，使得Fmoc保护集团被充分脱除。N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂5次后，得到NH2-Lys(mtt)-树脂。提前称取600mg Pyro(1.15mmol)溶于3ml的DMF中，使用前加入缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)380mg(1.0mmol)，DIPEA
250μl(1.5mmol)，充分溶解后，加入到已经被脱除Fmoc的NH2-Lys(mtt)-树脂中，室温继续反应过夜得到Pyro-Lys(mtt)-树脂。N,N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷分别洗涤树脂5次，
5min/次，抽滤除去二氯甲烷后，加入树脂切割液即三氟乙酸(TFA):三异丙基硅烷:二氯甲烷＝5％:5％:90％30min。将Pyro-Lys(mtt)-NH2从树脂上切割下来并去除保护基mtt得到Pyro-Lys(mtt)-NH2的溶液，产物用无水乙醚沉淀3次去除切割液中的物质，挥发除去乙醚后即得到最终产物Pyro-lys-NH2。
DCM＝1:7)，树脂用该封闭液封闭2次，30min/次，将树脂上没有反应的活性位点封闭。充分封闭后，抽滤除去封闭液，树脂用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗5次，1min/次。加入5％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液2次，15min/次，使得Fmoc保护集团被充分脱除。N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂5次后，得到NH2-Lys(mtt)-树脂。提前称取600mg Pyro(1.15mmol)溶于3ml的DMF中，使用前加入缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)380mg(1.0mmol)，DIPEA
250μl(1.5mmol)，充分溶解后，加入到已经被脱除Fmoc的NH2-Lys(mtt)-树脂中，室温继续反应过夜得到Pyro-Lys(mtt)-树脂。N,N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷分别洗涤树脂5次，
5min/次，抽滤除去二氯甲烷后，加入树脂切割液即三氟乙酸(TFA):三异丙基硅烷:二氯甲烷＝5％:5％:90％30min。将Pyro-Lys(mtt)-NH2从树脂上切割下来并去除保护基mtt得到Pyro-Lys(mtt)-NH2的溶液，产物用无水乙醚沉淀3次去除切割液中的物质，挥发除去乙醚后即得到最终产物Pyro-lys-NH2。
[0033] 3、简称为FA-PEG-Pyro的化合物的合成
[0034] 用分析天平称取5mg Pyro-Lys-NH2(7.55μmol)，溶于25μL二甲基亚砜中。称取1.0eq双官能团的聚乙二醇连接链(聚乙二醇)。该连接链也被命名为MAL-聚乙二醇-NHS。连接链聚乙二醇的(聚乙二醇)的分子量分别为1kDa，3.5kDa，5kDa，10kDa。将Mal-聚乙二醇-NHS溶于适量体积的二甲基亚砜中。将上述两种溶液混合后，室温反应30min，加入三乙胺(TEA)6.2μL，室温搅拌条件下继续反应4h。称取5.4mg FA-Cys-SH(9.9μmol)溶于10μL二甲基亚砜中，加入到上面的反应体系中，室温搅拌条件下继续反应1h。乙醚沉淀分离得到产物。
[0035] 图1中FA-PEG1K-Pyro，FA-PEG3.5K-Pyro，FA-PEG5K-Pyro和FA-PEG10K-Pyro分别对应于中间PEG链的分子量为1K，3.5K，5K和10K的FA-PEG-Pyro化合物。实施例2FA-PEG-Pyro在细胞水平上药物活性的评价(附图2)
[0036] 从液氮中取出冻存的KB和4T1细胞系，置于37℃水浴锅中迅速解冻，然后1000rpm/min,离心5min。换弃上清，加入预热的完全培养基，置于5％CO2，37℃培养箱中培养过夜。第二天更换培养基。继续培养至细胞铺满皿底。传代培养2-3次。将KB细胞或4T1细胞以1×104个/孔的细胞密度铺于96孔板中，放置于37℃，5％的二氧化碳培养箱中培养过夜。将上层清液去除后，每孔加入用新鲜的培养基配置的含不同药物浓度的FA-PEG-Pyro(聚乙二醇链的分子量分别为1K，3.5K，5K和10K)，放回37℃，5％二氧化碳培养箱中，使药物与细胞孵育4h。将细胞培养板取出，用660nm光源在距离培养板约2cm处给予40mW/cm2,10min的光辐射剂量。并将96孔细胞培养板放回到细胞培养相中继续过夜培养。用新鲜的培养基配制0.5mg/ml的MTT溶液，将96孔板中的培养基去除后，每孔加入100μL含有MTT的培养基，放回细胞培养箱中继续培养4h后，去除细胞培养液，每孔加入100μL的二甲基亚砜，室温摇晃10min，于多功能酶联免疫仪中测定490nm的吸光度。并根据吸光度计算细胞的存活率，然后绘制细胞存活率和加药浓度之间关系的药物活力抑制曲线，并计算相应的半抑制浓度(IC50值)。每个实验组做5个孔，数据表示为mean±SEM.
[0037] 实验结果及结论：
[0038] 为验证不同链长的聚乙二醇对细胞活性的影响，我们合成了具有不同连接链FA-PEG-Pyro，分别由分子量为1kDa，3.5kDa，5kDa，10kDa的双官能团的聚乙二醇连接链组成。该衍生物也分别被命名为FA-PEG1K-Pyro，FA-PEG3.5K-Pyro，FA-PEG5K-Pyro和FA-PEG10K-Pyro。通过细胞毒性实验(MTT)来研究FA-PEG-Pyro的药物活性变化。由图2所示，我们使用了两种肿瘤细胞系KB和4T1来研究FA-PEG-Pyro的药物活性。FA-PEG-Pyro的药物活性会随着聚乙二醇连接链组成分子量的增加即链长的增长而下降，当分子量由1kDa增加到10kDa时，相应的药物活性由原来的约100nM的半抑制浓度增加到约为2μM。这可能是由于聚乙二醇连接链的增长，导致整体化合物的拥有高度的亲水性同时长链的聚乙二醇掩盖掉了部分的叶酸的靶向结合作用而引起。然而，聚乙二醇连接链为1kDa的FA-PEG1K-Pyro药物活性与FA-Pyro，Pyro对细胞的药物活性相当，半抑制浓度均为100nM左右。因此分子量为1千的聚乙二醇链修饰的FA-PEG1K-Pyro在细胞系水平上的实验中显示具有较好的光动力杀伤活性。
[0039] 附图2中聚乙二醇链的分子量分别为1K，3.5K，5K和10K。所针对的肿瘤细胞系分别为KB口腔表皮鳞癌细胞(A)及4T1乳腺癌细胞系(B)。FA-PEG1K-Pyro，FA-PEG3.5K-Pyro，FA-PEG5K-Pyro和FA-PEG10K-Pyro分别对应于中间PEG链的分子量为1K，3.5K，5K和10K的FA-PEG-Pyro化合物。
[0040] 实施例3聚乙二醇连接链为1kDa的FA-PEG1K-Pyro药物活性的选择杀伤能力和暗毒性分析(附图3，4)
[0041] 分别取对数期的叶酸受体高表达的KB口腔鳞癌细胞和叶酸受体低表达A549肺癌细胞，分别以8×103个细胞/孔的细胞密度100μL细胞悬液加入96孔板中，37℃培养箱孵育24h。更换含有不同浓度的聚乙二醇连接链为1kDa的FA-PEG1K-Pyro,继续培养12h后，给予不同的光照剂量(0min,5min,10min,20min),继续培养4h后,更换含0.5mg/mL MTT的新鲜培养基继续孵育4h。酶联免疫检测仪在490nm处测量各孔的吸光值。
[0042] 实验结果及结论：
[0043] 我们使用聚乙二醇连接链为1kDa的FA-PEG1K-Pyro研究其对叶酸受体表达量不同肿瘤细胞系的杀伤能力，如图3所示为FA-PEG1K-Pyro对KB细胞和A549细胞的细胞毒性实验结果，由图中对KB细胞的杀伤结果所示，FA-PEG1K-Pyro的药物活性具有浓度依赖性质和光照剂量依赖的性质。KB细胞的细胞存活率随着药物浓度的增加而降低，同时随着光照时间的延长而降低。但在具有相同药物浓度的条件下，660nm，40mW/cm2的光照射后10min和20min的细胞活性相差并不是很大，说明光辐射10min就能充分低利用光敏剂FA-PEG1K-Pyro产生足够的光动力活性杀伤肿瘤组织细胞。这种快速的光动力活性能够满足临床上对光敏剂药物活性的要求。由图4所示，在不给予光辐射的条件下，KB细胞和A549细胞的细胞存活率均在90％以上，说FA-PEG1K-Pyro对KB细胞和A549细胞几乎没有产生暗毒性。在药物浓度由0.1μM增加到1.0μM，光照时间为5min到20min条件下，KB细胞的死亡率由50％达到
90％以上，而在相同的条件，对于叶酸受体表达量较低的阴性细胞系A549而言，存活率均在
80％以上。说明FA-PEG1K-Pyro并对A549细胞没有产生明显的细胞毒性作用。以上的实验结果表明，FA-PEG1K-Pyro能够通过与叶酸受体的相互作用选择性地杀伤叶酸受体高表达的KB肿瘤细胞，而对受体表达量较低的KB肿瘤细胞的杀伤能力有限。体现出叶酸受体在FA-PEG1K-Pyro选择杀伤能力上所发挥的重要作用。
90％以上，而在相同的条件，对于叶酸受体表达量较低的阴性细胞系A549而言，存活率均在
80％以上。说明FA-PEG1K-Pyro并对A549细胞没有产生明显的细胞毒性作用。以上的实验结果表明，FA-PEG1K-Pyro能够通过与叶酸受体的相互作用选择性地杀伤叶酸受体高表达的KB肿瘤细胞，而对受体表达量较低的KB肿瘤细胞的杀伤能力有限。体现出叶酸受体在FA-PEG1K-Pyro选择杀伤能力上所发挥的重要作用。
[0044] 实施例4FA-PEG-Pyro在小鼠体内KB口腔鳞癌肿瘤模型和NCI-N87胃癌肿瘤模型上的随时间分布的药物代谢过程(图5，6)
[0045] 构建小鼠皮下瘤KB肿瘤模型，待小鼠的皮下瘤长到200mm3时，首先通过小动物活体成像仪扫描荷瘤小鼠的背景荧光值，然后通过小鼠尾静脉注射分别给予不同实验组的小鼠120nmol Pyro，FA-Pyro，FA-PEG-Pyro(聚乙二醇分子量分别为1K，3.5K，5K和10K)。在给药后的不同代谢时间点，用小动物活体成像仪扫描小鼠，监测给药后在不同的时间点药物在小鼠体内的代谢分布情况。我们同样构建小鼠皮下瘤N87小鼠的肿瘤模型，然后通过小鼠尾静脉注射分别给予不同实验组的小鼠60nmol Pyro，FA-Pyro，FA-PEG-Pyro(聚乙二醇分子量分别为1K，3.5K，5K和10K)。在给药后的不同代谢时间点，用小动物活体成像仪扫描小鼠，监测给药后在不同的时间点药物在小鼠体内的代谢分布情况(λexc＝640nm；λem＝695-770nm,曝光时间为5s)。
[0046] 实验结果及结论：
[0047] 我们利用小动物活体成像体统研究FA-PEG-Pyro在KB肿瘤模型小鼠体内的药物分布随时间变化的过程。由图5所示，当经尾静脉给予相同药物剂量的Pyro，FA-Pyro，FA-PEG-Pyro后，不同时间点用异氟烷将小鼠麻醉，扫描此时小鼠体内的药物分布特点，由图6所示，在给予Pyro 2h后，其所发射的荧光信号主要集中于肝脏和心脏位置，药物随着时间的延长而逐渐代谢，但绝大多数的药物仍集中富集于肝组织处，在6～9小时时，可以观察到Pyro在肿瘤组织中有微弱的积累。对于FA-Pyro而言，如图所示，给药后药物由全身分布逐渐在肝脏和肿瘤组织中富集，6～9小时时在肿瘤组织中所发射的荧光强度高于Pyro组。为比较不同链长的聚乙二醇对Pyro的生物分布的影响，我们选用了分子量为1kDa，3.5kDa，5kDa，10kDa的聚乙二醇与Pyro和FA形成复合物，并评价该复合物在小鼠体内的药代分布情况。由图中所示，FA-PEG1K-Pyro在给药后4h时，药物主要集中于小鼠的肾脏和肿瘤组织部位，随着药物被逐渐代谢，在给药后6-9小时，药物集中分布于小鼠的肿瘤组织部位。而随着聚乙二醇分子量的增加(3.5kD到10kD)，药物在小鼠体内的滞留循环的时间延长，尽管在经过较长的时间后，药物在小鼠的肿瘤组织中也会有富集作用，但仍有大部分药物出于全身循环过程中，此现象在分子量为10kD组的小鼠中的药物分布尤为明显。为更好地监测药物在小鼠体内随代谢时间的分布变化，我们将药物的注射剂量降低一半即60nmol，并在N87肿瘤小鼠模型中研究各个组分药物代谢分布的特点(图6)，Pyro和FA-Pyro在N87肿瘤模型中的药物分布特点与上述KB肿瘤模型小鼠中的分布特点相似。FA-PEG1K-Pyro在2h时即可观察到肿瘤组织部位明显的药物富集，同时通过肾脏代谢。而更长的聚乙二醇链使得药物在小鼠体内的代谢时间延长，需要更长的时间达到在肿瘤组织部位的明显富集作用。以上实验结果表明，注射相同剂量的药物情况下，FA-PEG1K-Pyro具有较强的肿瘤富集能力，并且在体内的循环相对较短，综合肿瘤富集能力，体内滞留时间，光动力杀伤活性，FA-PEG1K-Pyro具有更为理想的治疗能力。
[0048] 实施例5聚乙二醇连接链为1kDa的FA-PEG1K-Pyro的体内治疗效果的评价(附图7)[0049] 使用构建的小鼠KB细胞皮下肿瘤模型来对比研究Pyro，FA-Pyro和FA-PEG1K-Pyro的治疗效果。具体的实验过程简述如下：6-8周龄的BALB/c裸鼠背部右后侧接种3×106个KB肿瘤细胞，大约12天后，小鼠的肿瘤体积达到与100mm3，小鼠被随机分为如下组：(1)60nmol FA-PEG1K-Pyro，光照(2)60nmolFA-PEG1K-Pyro，不光照(3)磷酸缓冲液，光照(4)磷酸缓冲液不光照(5)60nmolPyro光照(肿瘤体积约为250-300mm3)(6)60nmol FA-PEG1K-Pyro，光照3 2
(肿瘤体积约为250-300mm)小鼠给药时间点为给药后4h，光照射剂量为200mW/cm ,15min，光照治疗后用游标卡尺监测记录各组小鼠肿瘤的体积变化，同时观察小鼠的生理状态并记录小鼠的体重变化。在各组中小鼠的肿瘤体积达到或超过1000mm3后即停止对小鼠肿瘤体积和体重的监测记录。小鼠的肿瘤体积用如下公式进行计算：肿瘤体积＝长×宽2×0.5。
(肿瘤体积约为250-300mm)小鼠给药时间点为给药后4h，光照射剂量为200mW/cm ,15min，光照治疗后用游标卡尺监测记录各组小鼠肿瘤的体积变化，同时观察小鼠的生理状态并记录小鼠的体重变化。在各组中小鼠的肿瘤体积达到或超过1000mm3后即停止对小鼠肿瘤体积和体重的监测记录。小鼠的肿瘤体积用如下公式进行计算：肿瘤体积＝长×宽2×0.5。
[0050] 实验结果及结论：
[0051] 我们使用荷瘤小鼠通过监测肿瘤体积和体重的变化来评价FA-PEG1K-Pyro在小鼠体内的光动力治疗效果。如图7A中所示，当构建的小鼠皮下KB肿瘤模型的体积为100mm3，尾静脉给予60nmol的FA-PEG1K-Pyro，并在给药后4h给予光辐射(680nm，200mW/cm2，15min)，由图A所示，治疗组的小鼠在给药后第2天肿瘤组织部位开始出现结痂，小鼠肿瘤体积开始持续缩小。在治疗后的第33前后，治疗组的小鼠肿瘤开始出现再次生长的趋势，当肿瘤体积约为70mm3给予第二次相同的光动力治疗。小鼠肿瘤体积的变化趋势与第一次光动力治疗相似。小鼠在被监测的80天内，没有出现肿瘤复发的状况。而对于注射磷酸缓冲液(PBS)组，光照或FA-PEG1K-Pyro二者缺一的对照组中，小鼠的肿瘤体积增长很快。在开始实验的22天前后，小鼠的肿瘤体积即达到了1000mm3左右。证实光动力治疗只有在光和光敏剂同时存在的情况下才能产生光化学反应。如图7B中所示，小鼠同样被皮下接种了KB肿瘤，当肿瘤体积相对较大(250-300mm3)时,通过尾静脉注射60nmol Pyro和FA-PEG1K-Pyro。并使用与上述方法相同的实验条件进行光动力治疗。由图中所示，使用FA-PEG1K-Pyro作为光敏剂进行光动力治疗的小鼠肿瘤体积逐渐收缩，在给予两次光动力治疗后，小鼠的肿瘤体积在观测的32天内没有出现增长。而以Pyro为光敏剂进行光动力治疗的小鼠，肿瘤体积的增长没有被抑制，在治疗后的第12天肿瘤体积即达到了1000mm3。如图7C，D中所示为两次治疗实验过程中小鼠体重随监测时间的变化曲线。各组的小鼠体重均趋于平稳，并呈缓慢上升的趋势。并没有对小鼠正常的生理活动产生明显的影响。综合以上实验结果表明，FA-PEG1K-Pyro是一种高效，低毒副作用的可用于抗肿瘤光动力治疗的光敏剂。