碱提法高效提取植物硒蛋白的方法

摘要

本发明公开了碱提法高效提取植物硒蛋白的方法，包括以下步骤：(1)前处理；(2)提取、沉淀：将发酵后的浆液、促进剂和碱性溶液放入反应器中，在80～95℃下回流反应10～12h，然后以1～3mL/min的速度加入4倍发酵后的浆液体积的冰丙酮，置于‑27～‑17℃的环境中，在超声波的声能密度为15～25W/mL的辅助处理条件下，放置3～5h以进行硒蛋白沉淀，然后离心10～15min，最后取出沉淀物并进行喷雾干燥后，得到硒蛋白成品。本发明公开的碱提法高效提取植物硒蛋白的方法，不仅能够减少植物硒蛋白的流失率，提高植物提取率的同时，还能提高植物硒蛋白的纯度，具有广大的市场推广价值。

权利要求

1.碱提法高效提取植物硒蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)前处理：按重量份数计，将150～200份富硒大米放在800～1000份去离子水中浸泡8～12h后，取出研磨成浆，加入1～3份酵母，将全部材料放入发酵罐中，在25～35℃下发酵2～3天，然后在40～52℃下液化3～6h，得到发酵后的浆液；

(2)提取、沉淀：按重量份数计，将20份发酵后的浆液、1份促进剂和100～125份碱性溶液放入反应器中，在80～95℃下回流反应10～12h，然后以1～3mL/min的速度加入4倍发酵后的浆液体积的冰丙酮，置于-27～-17℃的环境中，在超声波的声能密度为15～25W/mL的辅助处理条件下，放置3～5h以进行硒蛋白沉淀，然后在2～5℃下以10000～20000r/min的速度离心10～15min，最后取出沉淀物并进行喷雾干燥后，得到硒蛋白成品；

步骤(2)所述的促进剂由下述方法制备：按重量份数计，将100份苯乙炔、5～10份过硫酸钠和10份质量分数为10～20％的氯化铜溶液放入反应器中，在温度为50～65℃和搅拌速度为100～300r/min的条件下反应10～15h，然后用四氯化碳溶液进行萃取，取出机层物质，在真空度为0.05～0.07MPa的条件下进行减压蒸馏12～24h，得到促进剂α，α-二氯苯乙酮。

2.根据权利要求1所述的碱提法高效提取植物硒蛋白的方法，其特征在于：所述的萃取处理在微波条件下进行。

3.根据权利要求1所述的碱提法高效提取植物硒蛋白的方法，其特征在于：步骤(1)所述的研磨成浆所采用的技术为磁力研磨技术。

4.根据权利要求1所述的碱提法高效提取植物硒蛋白的方法，其特征在于：步骤(2)所述的碱性溶液由按重量比为10：3～6：1的质量分数为1％的氢氧化钠溶液、质量分数为1％的醋酸钠和氯化钠混合而成。

5.根据权利要求1所述的碱提法高效提取植物硒蛋白的方法，其特征在于：步骤(2)所述的超声波的频率为30000～40000Hz。

说明书

碱提法高效提取植物硒蛋白的方法

【技术领域】

[0001] 本发明涉及植物硒蛋白的提取领域，特别涉及碱提法高效提取植物硒蛋白的方法。【背景技术】

[0002] 硒是人和动物的必需微量元素之一，硒可以提高免疫力，能加速免疫球蛋白及抗体产生。保护心血管与心肌，降低心血管病与心绞痛的发生率。在抗氧化抗衰老与抗癌防癌等方面有多种作用，并具有降低重金属毒害等特殊生理功能。被国内外科学家们誉为人类“抗癌之王、长寿元素、生命的火种、天然解毒剂、心脏守护神”。

[0003] 硒可分为有机硒和无机硒，无机硒主要以硒酸盐、亚硒酸盐为主，占硒总量的8％，一般具有较强的毒性。有机硒可分为大分子硒和小分子硒化物，占硒总量的80％以上，一般以硒代氨基酸和硒蛋白的形式存在，在生物体内发挥作用的主要是有机硒化物。在植物体内，硒积聚能力较强的植物硒结合蛋白较少，所以硒可能作为含硫氨基酸代谢中间产物类似物存在。在非积聚植物中，硒与蛋白质往往比较多，而且主要以硒代蛋氨酸存在，也有硒代半胱氨酸存在。研究发现在水稻硒蛋白中存在着两种硒结合态：硒代氨基酸和硒代半胱氨酸。

[0004] 大米的成分有脂类、水分、淀粉和蛋白质，其中淀粉和蛋白质大米的两大主要成分，其含量分别约为62-86％和9-15％之间。按蛋白溶解性的不同,大米蛋白质可分为4种类型：水溶性白蛋白、盐溶性球蛋白、碱溶性谷蛋白和醇溶蛋白。其中谷蛋白和醇溶蛋白为主要成分，各自占69％和11.5％，清蛋白和球蛋白各占9％和10.5％。硒蛋白中的硒主要以硒代甲硫氨酸存在，要准确检测其中硒含量，必须找到合适的硒蛋白提取方法，提取出硒蛋白。

[0005] 目前硒蛋白主要提取方法有溶剂提取法、柱分离技术、生物学方法、辅助提取技术等。其中有机溶剂提取法中应用最广的是碱提法，但是碱提法存在着硒蛋白流失严重的问题。因此，研究一种具有高效提取硒蛋白的方法具有广阔的市场推广价值。【发明内容】

[0006] 本发明目的在于提供碱提法高效提取植物硒蛋白的方法，本发明先对富硒大米进行发酵的前处理，使得富硒大米的结构物质进行初步的降解，有利于后续的植物硒蛋白的溶出；然后在碱性溶液环境中进行提取处理；最后在冰丙醇的沉淀作用下，辅助以超声波的技术手段，可以减少植物硒蛋白的流失率，进而提高植物硒蛋白的提取率。本发明公开的碱提法高效提取植物硒蛋白的方法，不仅能够减少植物硒蛋白的流失率，提高植物提取率的同时，还能提高植物硒蛋白的纯度，具有广大的市场推广价值。

[0007] 为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：碱提法高效提取植物硒蛋白的方法，包括以下步骤：

[0008] (1)前处理：按重量份数计，将150～200份富硒大米放在800～1000份去离子水中浸泡8～12h后，取出研磨成浆，加入1～3份酵母，将全部材料放入发酵罐中，在25～35℃下发酵2～3天，然后在40～52℃下液化3～6h，得到发酵后的浆液；

[0009] (2)提取、沉淀：按重量份数计，将20份发酵后的浆液、1份促进剂和100～125份碱性溶液放入反应器中，在80～95℃下回流反应10～12h，然后以1～3mL/min的速度加入4倍发酵后的浆液体积的冰丙酮，置于-27～-17℃的环境中，在超声波的声能密度为15～25W/mL的辅助处理条件下，放置3～5h以进行硒蛋白沉淀，然后在2～5℃下以10000～20000r/min的速度离心10～15min，最后取出沉淀物并进行喷雾干燥后，得到硒蛋白成品。

[0010] 在本发明中，作为进一步说明，步骤(2)所述的促进剂由下述方法制备：按重量份数计，将100份苯乙炔、5～10份过硫酸钠和10份质量分数为10～20％的氯化铜溶液放入反应器中，在温度为50～65℃和搅拌速度为100～300r/min的条件下反应10～15h，然后用四氯化碳溶液进行萃取，取出机层物质，在真空度为0.05～0.07MPa的条件下进行减压蒸馏12～24h，得到促进剂α，α-二氯苯乙酮。

[0011] 在本发明中，作为进一步说明，所述的萃取处理在微波条件下进行。

[0012] 在本发明中，作为进一步说明，步骤(1)所述的研磨成浆所采用的技术为磁力研磨技术。

[0013] 在本发明中，作为进一步说明，步骤(2)所述的碱性溶液由按重量比为10：3～6：1的质量分数为1％的氢氧化钠溶液、质量分数为1％的醋酸钠和氯化钠混合而成。

[0014] 在本发明中，作为进一步说明，步骤(2)所述的超声波的频率为30000～40000Hz。

[0015] 部分原料的功能介绍如下：

[0016] 富硒大米，在本发明中用作制备植物硒蛋白的原料。

[0017] 苯乙炔，在本发明中用作制备促进剂α，α-二氯苯乙酮的原料，在反应中生成苯乙酮基团。

[0018] 过硫酸钠，在本发明中用作制备促进剂α，α-二氯苯乙酮的原料，用于和苯乙炔进行氧化还原反应，生成苯乙酮基团。

[0019] 氯化铜，在本发明中用作制备促进剂α，α-二氯苯乙酮的原料，为α，α-二氯苯乙酮提供氯离子。

[0020] 氢氧化钠、醋酸钠和氯化钠，在本发明中用作制备碱性溶液的主要原料。

[0021] 本发明具有以下有益效果：

[0022] 1.本发明能够高效制备富硒大米植物硒蛋白。本发明以富硒大米为原料，通过浸泡的技术手段，使富硒大米的组织结构由于吸收大量的水分而变得松散，有利于后续植物硒蛋白的提取步骤的进行；然后通过研磨成浆的技术手段，使富硒大米的外部结构能够初步被打破，植物硒蛋白的保护层被打破，促进植物硒蛋白溶出；最后采用在发酵技术手段，使浆液中的物质进行降解，部分大分子降解为小分子，提高了植物硒蛋白在浆液中的含量，有利于后续的提取步骤的进行。本发明所采用的各个技术手段相互作用、相互配合、层层递进，能够共同促进后续的提取步骤的进行，提高了提取效率，所产生的总体效果远远高于单个技术手段所产生的效果的简单加和。

[0023] 2.本发明采用在超声波辅助处理、促进剂作用和碱性溶液环境的条件下，使用冰丙酮在-27～-17℃的低温环境中对植物硒蛋白进行沉淀，不仅能高效的沉淀植物硒蛋白，还可以使植物硒蛋白的纯度提高，进而有利于人体吸收。一方面，本发明采用冰丙酮沉淀植物硒蛋白的技术手段，避免了常温下丙酮会使蛋白质变质现象的发生，保障了所提取的植物硒蛋白品质的稳定，提高了植物硒蛋白的纯度。另一方面，本发明还采用了超声波辅助处理的技术手段，在超声条件下，植物硒蛋白与丙酮的接触面积增加，在超声波的振动下，植物硒蛋白也随之不断振动，避免了植物硒蛋白团聚现象的发生，进而提升了植物硒蛋白的提取率，而且超声波的使用，结合促进剂的加快作用，还可以使植物硒蛋白能够更好的融入在碱性溶液中，也有利于植物硒蛋白的提取。

[0024] 3.本发明所制备的促进剂能够更高效地促进碱性溶液对于植物硒蛋白的提取，进而提高提取效率。本发明采用苯乙炔和过硫酸钠进行氧化还原反应，生成苯乙酮基团，然后和氯化铜生成促进剂α，α-二氯苯乙酮。利用促进剂中氯离子和苯环的催化作用，能够促进植物硒蛋白的溶解，进而提高植物硒蛋白的提取率。【具体实施方式】

[0025] 实施例1：

[0026] 1.前期准备：

[0027] 促进剂的制备：按重量份数计，将100份苯乙炔、5份过硫酸钠和10份质量分数为10％的氯化铜溶液放入反应器中，在温度为50℃和搅拌速度为100r/min的条件下反应10h，然后在微波照射条件下用四氯化碳溶液进行萃取，取出机层物质，在真空度为0.05MPa的条件下进行减压蒸馏12h，得到促进剂α，α-二氯苯乙酮。

[0028] 碱性溶液的制备：按重量份数计，将10份氢氧化钠、3份质量分数为1％的醋酸钠和1份氯化钠相混合，搅拌均匀后，得到碱性溶液。

[0029] 将上述前期制备而得的物质用于下述碱提法高效提取植物硒蛋白的方法上。

[0030] 2.碱提法高效提取植物硒蛋白的方法，包括以下步骤：

[0031] (1)前处理：按重量份数计，将150份富硒大米放在800份去离子水中浸泡8h后，取出后采用磁力研磨技术研磨成浆，加入1份酵母，将全部材料放入发酵罐中，在25℃下发酵2天，然后在40℃下液化3h，得到发酵后的浆液；

[0032] (2)提取、沉淀：按重量份数计，将20份发酵后的浆液、1份促进剂和100份碱性溶液放入反应器中，在80℃下回流反应10h，然后以1mL/min的速度加入4倍发酵后的浆液体积的冰丙酮，置于-27℃的环境中，在超声波的声能密度为15W/mL、频率为30000Hz的辅助处理条件下，放置3h以进行硒蛋白沉淀，然后在2℃下以10000r/min的速度离心10min，最后取出沉淀物并进行喷雾干燥后，得到硒蛋白成品。

[0033] 实施例2：

[0034] 1.前期准备：

[0035] 促进剂的制备：按重量份数计，将100份苯乙炔、7份过硫酸钠和10份质量分数为12％的氯化铜溶液放入反应器中，在温度为55℃和搅拌速度为170r/min的条件下反应11h，然后在微波照射条件下用四氯化碳溶液进行萃取，取出机层物质，在真空度为0.06MPa的条件下进行减压蒸馏17h，得到促进剂α，α-二氯苯乙酮。

[0036] 碱性溶液的制备：按重量份数计，将10份氢氧化钠、4份质量分数为1％的醋酸钠和1份氯化钠相混合，搅拌均匀后，得到碱性溶液。

[0037] 将上述前期制备而得的物质用于下述碱提法高效提取植物硒蛋白的方法上。

[0038] 2.碱提法高效提取植物硒蛋白的方法，包括以下步骤：

[0039] (1)前处理：按重量份数计，将180份富硒大米放在850份去离子水中浸泡9h后，取出后采用磁力研磨技术研磨成浆，加入1.5份酵母，将全部材料放入发酵罐中，在30℃下发酵2.5天，然后在42℃下液化4h，得到发酵后的浆液；

[0040] (2)提取、沉淀：按重量份数计，将20份发酵后的浆液、1份促进剂和105份碱性溶液放入反应器中，在85℃下回流反应11h，然后以2mL/min的速度加入4倍发酵后的浆液体积的冰丙酮，置于-22℃的环境中，在超声波的声能密度为17W/mL、频率为33000Hz的辅助处理条件下，放置3.5h以进行硒蛋白沉淀，然后在3℃下以14000r/min的速度离心12min，最后取出沉淀物并进行喷雾干燥后，得到硒蛋白成品。

[0041] 实施例3：

[0042] 1.前期准备：

[0043] 促进剂的制备：按重量份数计，将100份苯乙炔、9份过硫酸钠和10份质量分数为14％的氯化铜溶液放入反应器中，在温度为57℃和搅拌速度为200r/min的条件下反应11h，然后在微波照射条件下用四氯化碳溶液进行萃取，取出机层物质，在真空度为0.055MPa的条件下进行减压蒸馏18h，得到促进剂α，α-二氯苯乙酮。

[0044] 碱性溶液的制备：按重量份数计，将10份氢氧化钠、5份质量分数为1％的醋酸钠和1份氯化钠相混合，搅拌均匀后，得到碱性溶液。

[0045] 将上述前期制备而得的物质用于下述碱提法高效提取植物硒蛋白的方法上。

[0046] 2.碱提法高效提取植物硒蛋白的方法，包括以下步骤：

[0047] (1)前处理：按重量份数计，将170份富硒大米放在900份去离子水中浸泡10h后，取出后采用磁力研磨技术研磨成浆，加入2份酵母，将全部材料放入发酵罐中，在28℃下发酵2.5天，然后在45℃下液化4h，得到发酵后的浆液；

[0048] (2)提取、沉淀：按重量份数计，将20份发酵后的浆液、1份促进剂和110份碱性溶液放入反应器中，在85℃下回流反应10.5h，然后以2mL/min的速度加入4倍发酵后的浆液体积的冰丙酮，置于-20℃的环境中，在超声波的声能密度为20W/mL、频率为36000Hz的辅助处理条件下，放置3.5h以进行硒蛋白沉淀，然后在3℃下以14000r/min的速度离心11min，最后取出沉淀物并进行喷雾干燥后，得到硒蛋白成品。

[0049] 实施例4：

[0050] 1.前期准备：

[0051] 促进剂的制备：按重量份数计，将100份苯乙炔、6份过硫酸钠和10份质量分数为16％的氯化铜溶液放入反应器中，在温度为60℃和搅拌速度为220r/min的条件下反应11h，然后在微波照射条件下用四氯化碳溶液进行萃取，取出机层物质，在真空度为0.065MPa的条件下进行减压蒸馏19h，得到促进剂α，α-二氯苯乙酮。

[0052] 碱性溶液的制备：按重量份数计，将10份氢氧化钠、4份质量分数为1％的醋酸钠和1份氯化钠相混合，搅拌均匀后，得到碱性溶液。

[0053] 将上述前期制备而得的物质用于下述碱提法高效提取植物硒蛋白的方法上。

[0054] 2.碱提法高效提取植物硒蛋白的方法，包括以下步骤：

[0055] (1)前处理：按重量份数计，将180份富硒大米放在850份去离子水中浸泡9h后，取出后采用磁力研磨技术研磨成浆，加入2.5份酵母，将全部材料放入发酵罐中，在27℃下发酵2天，然后在47℃下液化4.5h，得到发酵后的浆液；

[0056] (2)提取、沉淀：按重量份数计，将20份发酵后的浆液、1份促进剂和108份碱性溶液放入反应器中，在90℃下回流反应10h，然后以2.5mL/min的速度加入4倍发酵后的浆液体积的冰丙酮，置于-22℃的环境中，在超声波的声能密度为22W/mL、频率为37000Hz的辅助处理条件下，放置4.5h以进行硒蛋白沉淀，然后在3℃下以14000r/min的速度离心13min，最后取出沉淀物并进行喷雾干燥后，得到硒蛋白成品。

[0057] 实施例5：

[0058] 1.前期准备：

[0059] 促进剂的制备：按重量份数计，将100份苯乙炔、9份过硫酸钠和10份质量分数为16％的氯化铜溶液放入反应器中，在温度为63℃和搅拌速度为250r/min的条件下反应14h，然后在微波照射条件下用四氯化碳溶液进行萃取，取出机层物质，在真空度为0.06MPa的条件下进行减压蒸馏22h，得到促进剂α，α-二氯苯乙酮。

[0060] 碱性溶液的制备：按重量份数计，将10份氢氧化钠、4份质量分数为1％的醋酸钠和1份氯化钠相混合，搅拌均匀后，得到碱性溶液。

[0061] 将上述前期制备而得的物质用于下述碱提法高效提取植物硒蛋白的方法上。

[0062] 2.碱提法高效提取植物硒蛋白的方法，包括以下步骤：

[0063] (1)前处理：按重量份数计，将180份富硒大米放在950份去离子水中浸泡11h后，取出后采用磁力研磨技术研磨成浆，加入2.5份酵母，将全部材料放入发酵罐中，在34℃下发酵2天，然后在50℃下液化5h，得到发酵后的浆液；

[0064] (2)提取、沉淀：按重量份数计，将20份发酵后的浆液、1份促进剂和115份碱性溶液放入反应器中，在88℃下回流反应11h，然后以2mL/min的速度加入4倍发酵后的浆液体积的冰丙酮，置于-20℃的环境中，在超声波的声能密度为19W/mL、频率为35000Hz的辅助处理条件下，放置4.5h以进行硒蛋白沉淀，然后在3℃下以16000r/min的速度离心14min，最后取出沉淀物并进行喷雾干燥后，得到硒蛋白成品。

[0065] 实施例6：

[0066] 1.前期准备：

[0067] 促进剂的制备：按重量份数计，将100份苯乙炔、10份过硫酸钠和10份质量分数为20％的氯化铜溶液放入反应器中，在温度为65℃和搅拌速度为300r/min的条件下反应15h，然后在微波照射条件下用四氯化碳溶液进行萃取，取出机层物质，在真空度为0.07MPa的条件下进行减压蒸馏24h，得到促进剂α，α-二氯苯乙酮。

[0068] 碱性溶液的制备：按重量份数计，将10份氢氧化钠、6份质量分数为1％的醋酸钠和1份氯化钠相混合，搅拌均匀后，得到碱性溶液。

[0069] 将上述前期制备而得的物质用于下述碱提法高效提取植物硒蛋白的方法上。

[0070] 2.碱提法高效提取植物硒蛋白的方法，包括以下步骤：

[0071] (1)前处理：按重量份数计，将200份富硒大米放在1000份去离子水中浸泡12h后，取出后采用磁力研磨技术研磨成浆，加入3份酵母，将全部材料放入发酵罐中，在35℃下发酵3天，然后在52℃下液化6h，得到发酵后的浆液；

[0072] (2)提取、沉淀：按重量份数计，将20份发酵后的浆液、1份促进剂和125份碱性溶液放入反应器中，在95℃下回流反应12h，然后以3mL/min的速度加入4倍发酵后的浆液体积的冰丙酮，置于-17℃的环境中，在超声波的声能密度为25W/mL、频率为40000Hz的辅助处理条件下，放置5h以进行硒蛋白沉淀，然后在5℃下以20000r/min的速度离心15min，最后取出沉淀物并进行喷雾干燥后，得到硒蛋白成品。

[0073] 对比例1：碱提法高效提取植物硒蛋白的方法所采用的原料与实施例1基本相同，不同点在于：没有采用前处理步骤。

[0074] 对比例2：碱提法高效提取植物硒蛋白的方法所采用的原料与实施例1基本相同，不同点在于：步骤(2)没有采用促进剂。

[0075] 对比例3：碱提法高效提取植物硒蛋白的方法所采用的原料与实施例1基本相同，不同点在于：步骤(2)所采用的丙酮为常温下的丙酮，且沉淀的温度也为常温。

[0076] 对比试验1：将对比例1-3与实施例1-6的方法提取植物硒蛋白，计算植物硒蛋白的提取率，检测结果见表1。

[0077] 对比试验2：将对比例1-3与实施例1-6的方法提取植物硒蛋白，采用考马斯亮蓝G－250试剂比色法。AA800紫外原子荧光光度计595nm处测定吸光度值，用牛血清蛋白制作标准曲线，求曲线回归方程，算出硒蛋白质含量，计算纯度。检测结果见表1。

[0078] 表1：

[0079]  提取率％ 纯度％
对比例1 30.5 91.8
对比例2 43.8 92.4
对比例3 41.7 65.3
实施例1 60.1 99.9
实施例2 58.9 99.8
实施例3 59.5 99.9
实施例4 60.7 99.9
实施例5 59.8 99.8
实施例6 60.4 99.9

[0080] 表1的结果表明：提取率越高，说明碱提法高效提取植物硒蛋白的方法效率越高。对比例1的提取率最低，实施例4的提取率最高，说明通过对富硒大米进行前处理，能够达到高效提取植物硒蛋白的效果；

[0081] 纯度越高，说明碱提法高效提取植物硒蛋白的方法效率越高。对比例3的纯度最低，实施例1、3、4、6的纯度最高，说明通过采用冰丙醇在低温进行沉淀处理，能够达到提高纯度的效果。

[0082] 上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。