LncRNA-TUG1在调控PDLSCs成骨分化及组织再生中的作用

摘要

本发明公开了LncRNA‑TUG1在调控PDLSCs成骨分化及组织再生中的作用。本发明通过研究LncRNA‑TUG1调控PDLSCs成骨分化和组织再生的体内外实验，LncRNA‑TUG1在牙周膜干细胞成骨分化和组织再生过程中起了重要的调控作用，LncRNA‑TUG1可作为组织再生治疗的潜在靶点，推动开发出新的关于LncRNA‑TUG1相关药物或因子，并最终将其运用到再生医学领域，达到临床上真正的精准医疗。

权利要求

1.LncRNA-TUG1作为非疾病诊断和治疗用途的靶点在调控牙周膜干细胞成骨分化和/牙周组织再生中的应用，其特征在于，所述应用中，LncRNA-TUG1表达提高，促进牙周膜干细胞成骨分化和/牙周组织再生；LncRNA-TUG1表达下降，牙周膜干细胞成骨向分化和牙周组织再生能力受到抑制。

2.LncRNA-TUG1促进剂在制备促进牙周膜干细胞成骨分化和/牙周组织再生药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述LncRNA-TUG1促进剂是指提高LncRNA-TUG1的活性、增加LncRNA-TUG1表达量的物质。

4.LncRNA-TUG1抑制剂在制备抑制牙周膜干细胞成骨分化和/牙周组织再生药物中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述LncRNA-TUG1抑制剂包括降低LncRNA-TUG1的活性和/减少LncRNA-TUG1表达量的拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂。

说明书

LncRNA-TUG1在调控PDLSCs成骨分化及组织再生中的作用

技术领域

[0001] 本发明涉及口腔组织再生领域技术领域，具体涉及LncRNA-TUG1在调控PDLSCs成骨分化及组织再生中的作用。

背景技术

[0002] 口腔干细胞研究为人类牙齿和牙周组织实现生物学再生和生物功能修复提供了可能。近年来，关于牙齿干细胞及组织工程技术的研究进展给生物学再生带来了新的研究方向。牙齿干细胞以活力强、取材方便、低免疫排斥等优势，可运用与人体多部位的软硬组织再生，如牙齿和牙周组织的修复和再生、眼睛的创伤后修复、皮肤的愈合和再生、脂肪细胞的组织重建、免疫系统的自我修复等。牙周膜干细胞(PDLSCs)是一类在口腔临床工作中较易获得的成体干细胞；也是一种具有多向分化潜能和自我更新能力的成体干细胞。自04年Seo等利用单细胞克隆技术从人体的牙周膜组织中成功分离和鉴定，牙周膜干细胞就备受口腔医学和其他生物再生领域研究者的关注。它在体外通过适当的诱导能够形成骨、软骨、神经、脂肪、血管等多种组织；具备潜在分化为成骨细胞或成牙骨质细胞的能力，并能在体内移植后形成牙骨质-牙周膜-牙槽骨样结构物，为口腔临床的骨组织维持、骨再生、修复及正畸的牙周改建提供了重要的临床应用价值。

[0003] 本申请发明人课题组前期已在国际上率先提出利用牙齿相关干细胞进行生物牙根再生的新理念，并进行了系列相关体内、外实验，如在小型猪动物模型上成功再生出可正常行使功能的生物牙根；将自体异体牙周膜干细胞及Vc诱导的牙周膜干细胞膜片用于组织再生，取得了良好的效果；利用低温冷冻技术，优化牙周膜干细胞膜片的生物学性能和储藏条件，为不同时间点进行自体异体干细胞组织再生和修复提供了可能。

[0004] 在人类基因组中，约有93％的DNA都会转录为RNA，但仅有2％的RNA具有编码蛋白质的功能，众多的DNA最终转录为非编码RNA。长链非编码RNA(long non coding RNA,LncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA。过去被认为是转录过程中的杂音，没有实际作用。但近些年来，随着研究的深入，科学家们发现其在表观遗传、转录及转录后基因表达中都起着重要的调控作用。研究显示，LncRNAs参与多种生命活动的调节作用：可对蛋白编码基因进行表观遗传学调节；直接调节基因转录及蛋白质降解；参与某些细胞器的生成过程及细胞内分子的亚细胞运输；并常与基因印迹现象密切相关。目前，研究LncRNAs最重要的作用可能是通过多种机制促进或抑制肿瘤的发生发展及侵袭转移，包括肝细胞癌、胰腺癌、白血病等。在干细胞研究方面，近年的研究表明某些LncRNA与干细胞的生物学行为密切相关。在人类脂肪干细胞成骨向分化过程中，LncRNA-MEG3通过调控miR-140-5p从而达到抑制ADMSC的脂肪向分化和诱导成骨向表达能力增强；同样，降低在脂肪干细胞中LncRNA-MIAT的表达，可以促进其向成骨细胞的分化。在人类骨髓间充质干细胞中，敲除Long Non-Coding RNA NONHSAT009968后可以加速成骨分化基因的表达；LncRNA-H19参与骨髓基质干细胞向成骨细胞和神经细胞的分化，当H19下调时BMSC可向神经细胞分化的能力增强；同时，lncRNA(Esco2、Pcdhb18和RGD1560277)也参与调控BMSC向神经细胞和成骨细胞分化。

[0005] 牛磺酸上调基因1(Taurine  upregulated gene 1,TUG1)位于人类染色体22q12.2，长度为约7.1kb，具有数个开放阅读框架但最长的编码不超过100个氨基酸，因此认为它是一种长链非编码RNA。TUG1最早发现于小鼠视网膜细胞，在视网膜细胞的细胞核和细胞质中均有表达；将TUG1敲除后会引起视网膜细胞生长减慢、凋亡能力增加，引起小鼠发育畸形。LncRNA-TUG1可以招募甲基化的polycomb repressive complex 2(PRC2)蛋白，从而调控某些细胞生长控制基因的表达。对于视网膜祖细胞进行TUG1siRNA转染后三天，几种与细胞凋亡通路相关的基因表达上调(如Klf2)，细胞死亡增加，TUG1的正常表达可能对于抑制某些细胞凋亡相关基因起到重要作用。TUG1对血管平滑肌细胞中SM22α具有调节作用。
沉默TUG1后，细胞生长减慢或凋亡增加，SM22αmRNA表达上调；它可以与多梳蛋白抑制复合体2(PRC2)中EZH2蛋白结合，从而调控某些生长控制基因的表达；胞浆中的EZH2具有甲基转移酶活性并且在PDGF诱导的细胞伪足的形成过程中起关键作用，得出TUG1与EZH2、F-actin之间的相互作用机制及其对血管平滑肌细胞骨架的调节作用。研究人员还发现TUG1启动子附近包括一些高度保守的P53绑定位点，能够被P53介导的DNA损伤应答所刺激并表达上调。
此外，TUG1与PRC2结合后，再与目的基因结合进行染色质修饰，发挥调控基因表达的功能和实现沉默目的基因的表达作用。TUG1是一种调控因子，它虽然不编码蛋白质，但可以直接以RNA的形式通过与多种转录因子相互作用，调控多基因的表达，对于人类正常生长发育过程具有重要作用。但LncRNA-TUG1在牙周膜干细胞中的作用以及与牙周膜干细胞成骨分化及组织再生相关作用研究，目前未见报道。

发明内容

[0006] 针对上述现有技术，发明人结合前期实验基础(国家自然科学基金资助课题，No.81200758)，通过研究LncRNA-TUG1调控PDLSCs成骨分化和组织再生的体内外实验，进行分子水平研究和体内组织再生研究，结果显示，LncRNA-TUG1在牙周膜干细胞成骨分化和组织再生过程中起了重要的调控作用，通过反向论证，当LncRNA-TUG1下调，PDLSCs成骨向分化和牙周组织再生能力受到抑制，通过本发明阐明牙周膜干细胞介导组织再生中LncRNA-TUG1的调控功能，为调控牙齿干细胞促进口腔组织再生提供重要的依据。

[0007] 具体的，本发明涉及以下技术方案：

[0008] 首先，本发明的目的之一在于提供LncRNA-TUG1作为靶点在调控牙周膜干细胞成骨分化和/组织再生中的应用。

[0009] 具体的，所述调控包括正调控和/负调控，正调控是指促进牙周膜干细胞成骨分化和/组织再生，负调控是指抑制牙周膜干细胞成骨分化和/组织再生。

[0010] LncRNA-TUG1表达提高，可以促进牙周膜干细胞成骨分化和/组织再生；LncRNA-TUG1表达下降，PDLSCs成骨向分化和牙周组织再生能力受到抑制。

[0011] 基于上述应用，本发明公开了一种LncRNA-TUG1促进剂在制备牙周膜干细胞成骨分化和/组织再生药物中的用途。

[0012] 所述LncRNA-TUG1促进剂是指任何可以提高LncRNA-TUG1的活性、增加LncRNA-TUG1表达量的物质，例如增加LncRNA-TUG1表达量的LncRNA-TUG1的过表达载体。

[0013] 本发明还公开了LncRNA-TUG1抑制剂在制备抑制牙周膜干细胞成骨分化和/组织再生药物中的用途。

[0014] 上述应用中，所述LncRNA-TUG1抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。任何可以降低LncRNA-TUG1的活性、减少LncRNA-TUG1表达量的物质均可用于本发明。

[0015] 优选的实施方案中，所述LncRNA-TUG1抑制剂为抑制LncRNA-TUG1表达的慢病毒载体。

[0016] 基于上述应用，本发明公开了一种促进牙周膜干细胞成骨分化和/组织再生的方法，所述方法包括提高LncRNA-TUG1的活性和/增加LncRNA-TUG1的表达。

[0017] 优选的实施方案中，所述方法还包括将提高LncRNA-TUG1的活性和/增加LncRNA-TUG1表达后的牙周膜干细胞，与人工骨支架材料形成牙周膜干细胞复合物制备成骨材料的步骤。

[0018] 本发明还公开了一种抑制牙周膜干细胞成骨分化和/组织再生的方法，所述方法包括抑制LncRNA-TUG1的表达。

[0019] 牙周膜干细胞具有多种分化潜能，在体外通过适当的诱导能够形成骨、软骨、神经、脂肪、血管等多种组织，(即便在定向诱导过程中)牙周膜干细胞在诱导时也会伴随多种分化细胞的产生(成骨细胞+脂肪细胞、成骨细胞+血管细胞等)，通过部分抑制成骨分化，可以有效的诱导干细胞向其他特定组织方向分化。

[0020] 其次，本发明的目的之二在于提供一种调控牙周膜干细胞的成骨分化和/组织再生的药物组合物，所述药物组合物含有有效量的上述LncRNA-TUG1促进剂或LncRNA-TUG1抑制剂。

[0021] 进一步的，所述药物组合物中还包含：药学上可接受的载体。

[0022] 所述“药学上可接受的载体”为常规的给药载体，包括各种赋形剂或稀释剂等。

[0023] 本发明取得了以下有益效果：

[0024] 本发明通过LncRNA-TUG1调控PDLSCs成骨分化和组织再生的体内外实验，证实了LncRNA-TUG1在牙周膜干细胞成骨分化和/组织再生过程中均起了重要的调控作用；LncRNA-TUG1可作为组织再生治疗的潜在靶点，推动开发出新的关于LncRNA-TUG1相关药物或因子，并最终将其运用到再生医学领域，达到临床上真正的精准医疗。

附图说明

[0025] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

[0026] 图1牙周膜干细胞生物学特性实验结果，PDLSCS干细胞分离培养情况(A)显示原代和第3代培养的细胞(scale bar：200μm)、多向分化能力测定ALP染色、茜素红染色(B)、成骨相关因子测定(C)

[0027] 图2牙周膜干细胞成骨向诱导后的变化情况，A.牙周膜干细胞成骨向诱导7d后，RT-qPCR筛选表达明显的LncRNA；B.牙周膜干细胞成骨向诱导不同时间，TUG1的表达变化[0028] 图3转染慢病毒PDLSCs的免疫荧光变化情况，A.转染不同干扰靶点的慢病毒载体，PDLSCs荧光显微镜图Scale bar：200um.；B.RT-qPCR验证，不同干扰靶点沉默TUG1的效率情况

[0029] 图4人牙周膜干细胞成骨向诱导不同时间，沉默TUG1时相关成骨指标变化情况，A.ALP染色(1w)(scale bar：200μm)；B.茜素红染色(3w)(scale bar：200μm)；C.ALP活性；D.钙离子浓度；E.成骨因子(ALP、Runx2、OCN)的表达情况，结果显示沉默TUG1组较空载体组和空白对照组呈减弱趋势，空载体组与未加载体诱导组两者间没有显著差异(以*p<0.05有统计学意义)

[0030] 图5LncRNA-TUG1调控牙周膜干细胞体内组织再生能力。HE染色(8w，12w)，scale bar：100μm

具体实施方式

[0031] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

[0032] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

[0033] 实施例1 牙周膜干细胞生物学特性

[0034] 1、人牙周膜干细胞的分离和培养

[0035] 麻醉下无菌拔除人阻生第三磨牙或正畸矫治用的第一、二前磨牙，轻轻剥离其周围的牙周组织，取中段的牙周组织，用PBS反复清洗，剪碎，置于含Ⅰ型胶原酶(3g/L)和DispaseⅡ酶(4g/L)的消化液，37℃下消化40分钟，过70um细胞筛收集细胞，1000转/分钟，离心5分钟，去除上层的液体，用新鲜的培养液重新悬浮成单细胞悬液。将细胞接种于25cm2细胞培养瓶中，在α-MEM培养基(含20％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中37℃、5％CO2培养，每隔2-3天，更换培养液1次，在倒置显微镜下观察细胞生长状况。当细胞生长至80％汇合状态时，用0.25％胰蛋白酶按1：2或1：3消化传代。(取第三代代细胞完成后续实验)

[0036] 2、牙周膜干细胞表面标志物的表达情况

[0037] 应用流式细胞术和免疫荧光术，观察牙周膜干细胞STRO-1,CD146,CD45,CD31等间充质干细胞标志物的表达情况。

[0038] 3、多向分化能力

[0039] 将牙周膜干细胞分别在成骨向诱导培养基和脂肪向诱导培养基培养4周，然后分别通过茜素红染色、油红O染色及RT-PCR技术检测其多向分化潜能。

[0040] 实验结果如图1所示，由结果可以看出，本发明分离培养的PDLSCs通过鉴定和诱导，可分化为成骨细胞，具备干细胞的多向分化潜能。

[0041] 实施例2 筛选LncRNA-TUG1，并对其进行细胞定位及在成骨向诱导中的表达变化1、将牙周膜干细胞分别成骨向诱导0d、7d，提取RNA，通过RT-qPCR，确定筛选出表达明显的目的非编码RNA，并进行不同时间成骨向诱导的变化趋势。。

[0042] 实验结果如图2所示，筛选出表达明显的LncRNA-TUG1，并初步证实TUG1在PDLSCs成骨分化中的表达趋势。

[0043] 2、慢病毒载体构建

[0044] 根据人LncRNA-TUG1序列(ID:55000)设计引物，引物由上海领科生物科技有限公司合成并纯化。退火后连接至线性化的pGenesil-1质粒，构建LncRNA-TUG1(沉默)的表达载体慢病毒，抑制LncRNA-TUG1的表达(因TUG1序列过大，极难成功构建过表达载体，因此本发明构建抑制LncRNA-TUG1表达的载体进行反向研究论证)。

[0045] 构建过程所用载体及引物如下：

[0046] Vector：pLenO-GFP

[0047] Lenti-hTUG1-NC序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT(SEQ ID NO:1)(Negative Control)[0048] Lenti-hTUG1-sh1

[0049] GPH-hTUG1-SH1 Forward Sequence

[0050] 5’GATCCCTGTTGACCTTGCTGTGAGAACTTCCTGTCAGATTCTCACAGCAAGGTCAACAGTTTTTG3’(SEQ ID NO:2)

[0051] GPH-hTUG1-SH1 Reverse Sequence

[0052] 5’AATTCAAAAACTGTTGACCTTGCTGTGAGAATCTGACAGGAAGTTCTCACAGCAAGGTCAACAGG3’(SEQ ID NO:3)

[0053] Lenti-h TUG1-sh2

[0054] GPH-hTUG1-SH2 Forward Sequence

[0055] 5’GATCCGCTTGGCTTCTATTCTGAATCCTTTCTTCCTGTCAGAAAAGGATTCAGAATAGAAGCCAAGCTTTTTG3’(SEQ ID NO:4)

[0056] GPH-hTUG1-SH2 Reverse Sequence

[0057] 5’AATTCAAAAAGCTTGGCTTCTATTCTGAATCCTTTTCTGACAGGAAGAAAGGATTCAGAATAGAAGCCAAGCG3’(SEQ ID NO:5)

[0058] Lenti-h TUG1-sh3

[0059] GPH-hTUG1-SH3 Forward Sequence

[0060] 5’GATCCGCTACAACTATCTTCCTTTACCTTCCTGTCAGAGTAAAGGAAGATAGTTGTAGCTTTTTG 3’(SEQ ID NO:6)

[0061] GPH-hTUG1-SH3 Reverse Sequence

[0062] 5’AATTCAAAAAGCTACAACTATCTTCCTTTACTCTGACAGGAAGGTAAAGGAAGATAGTTGTAGCG 3’(SEQ ID NO:7)

[0063] Lenti-h TUG1-sh4

[0064] GPH-hTUG1-SH4 Forward Sequence

[0065] 5’GATCCGCAAGAGATAACTATGAAAGCCTTCCTGTCAGAGCTTTCATAGTTATCTCTTGCTTTTTG 3’(SEQ ID NO:8)

[0066] GPH-hTUG1-SH4 Reverse Sequence

[0067] 5’AATTCAAAAAGCAAGAGATAACTATGAAAGCTCTGACAGGAAGGCTTTCATAGTTATCTCTTGCG 3’(SEQ ID NO:9)

[0068] 将细胞进行分组：control组、sh-NC组、sh-TUG1-1#组、sh-TUG1-2#组、sh-TUG1-3#组、sh-TUG1-4#组，按照慢病毒转染步骤说明书要求分别加入病毒。12h后换回正常培养基，孵育24h后在荧光显微镜下观察，出现绿色荧光说明转染成功。筛选转染稳定的时间(24h、48h、72h、96h)，最后选定转染时间为72h，MOI值为20。提取总RNA，完成后续RT-qPCR的相关验证。

[0069] 筛选验证结果显示：sh-TUG1-2#组的沉默效果最明显(如图3所示)。

[0070] 3、将牙周膜干细胞分别成骨向诱导不同时间(0、1、3、7、10、14d)，LncRNA-TUG1的表达变化

[0071] 用无血清培养基清洗细胞，将sh-NC和sh-TUG1-2#慢病毒，按照转染步骤说明书加入到细胞中。12h后换用正常的培养基，孵育72h，待转染稳定后给予成骨向诱导培养基培养。完成后续的LncRNA-TUG1对牙周膜干细胞成骨分化的功能研究。

[0072] 实验结果如图4所示，结果表明，LncRNA-TUG1在PDLSCs成骨向诱导不同时间，总体表达趋势呈上升趋势；ALP染色和茜素红染色显示PDLSCs成骨向诱导与空白对照组有明显差异；ALP活性和成骨能力相关因子(ALP、Runx2、OCN)的表达均较空白对照组的表达升高，再次证明PDLSCs具备成骨向细胞分化的能力。

[0073] 实施例3 LncRNA-TUG1调控牙周膜干细胞体内组织再生的研究

[0074] 将牙周膜干细胞复合物植入到裸鼠背部皮下，观察其组织形成能力。

[0075] 1、将慢病毒sh-NC空载体和sh-TUG1-2#分别转染牙周膜干细胞

[0076] 采用组织块法和酶消化法培养人的牙周膜干细胞，将生长旺盛的第三代牙周膜干细胞接种在60mm培养皿，培养成分为α-MEM培养基(含15％胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)。分别将慢病毒sh-NC空载体和sh-TUG1-2#转染牙周膜干细胞，实验分为3组：(1)正常培养牙周膜干细胞组(2)sh-NC空载体转染牙周膜干细胞组(3)sh-TUG1-2#转染牙周膜干细胞组

[0077] 2、生物支架材料的制备

[0078] 将经过高压灭菌的β-TCP生物支架材料与体外培养的牙周膜干细胞进行共培养，比例50mg：1*107个细胞。随机分为3组：(1)正常培养牙周膜干细胞膜+β-TCP组(2)sh-NC空载体转染牙周膜干细胞+β-TCP组(3)sh-TUG1-2#转染牙周膜干细胞+β-TCP组[0079] 3、支架材料/干细胞复合体体内回植

[0080] 裸鼠随机分为3组：(1)正常培养牙周膜干细胞膜+β-TCP组(2)sh-NC空载体转染牙周膜干细胞+β-TCP组(3)sh-TUG1-2#转染牙周膜干细胞+β-TCP组回植8w、12w后，分别处死裸鼠。

[0081] a.影像学检查：X线和CT检查，观察组织再生情况。

[0082] b.组织学观察：处死动物获取标本，固定，脱钙，进行HE染色，观察生物支架组织再生情况。

[0083] 实验结果显示，下调LncRNA-TUG1后体内组织再生能力的变化下降明显(H&E染色显示矿化诱导8w、12w后，证实LncRNA-TUG1对组织再生能力有促进作用)。

[0084] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。