一种富GSH-硒多形汉逊酵母的制备方法

摘要

本发明提供了一种富GSH‑硒多形汉逊酵母的制备方法。采用多形汉逊酵母进行发酵，在发酵前期加入亚硒酸钠，最终亚硒酸钠转化率高达97.28％，有机硒得到最大程度富集，得到了富GSH‑硒多形汉逊酵母。本发明具有成本低、产量高、易于放大培养等优点。

权利要求

1.一种富GSH-硒多形汉逊酵母的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将多形汉逊酵母种子接种于发酵培养基中进行恒温发酵，恒温发酵过程中添加终浓度为20µg/mL 30µg/mL的亚硒酸钠；所述恒温发酵的条件包括：接种后，于36 37℃及100~ ~ ~

120r/min条件下振荡培养46 50h；所述亚硒酸钠的加入时间为接种后10 12h；

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所述多形汉逊酵母种子的接种量按照种子培养液与发酵培养基的体积比计算为4%~

5%；

多形汉逊酵母选自H.polymorpha DL-1菌株。

2.根据权利要求1所述一种富GSH-硒多形汉逊酵母的制备方法，其特征在于：所述多形汉逊酵母种子的获取方法包括以下步骤：将保存的多形汉逊酵母接入YEPD固体培养基中活化，将活化后的多形汉逊酵母接种至YEPD液体培养基，然后于100 120r/min及36 37℃条件~ ~下，振荡培养10 12h，得种子培养液。

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3.根据权利要求1所述一种富GSH-硒多形汉逊酵母的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基包括以下组分：酵母浸粉10g/L、葡萄糖400g/L以及蛋白胨20g/L。

4.根据权利要求3所述一种富GSH-硒多形汉逊酵母的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基中还含有微量元素锰。

5.根据权利要求1所述一种富GSH-硒多形汉逊酵母的制备方法，其特征在于：所述恒温发酵的条件为：接种后于37℃及120r/min条件下培养48h；所述多形汉逊酵母种子接种量为

4%，亚硒酸钠的加入时间为接种后12h，终浓度为30µg/mL。

6.一种富GSH-硒多形汉逊酵母的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将多形汉逊酵母种子接种于发酵培养基中进行变温发酵，变温发酵过程中添加终浓度为20µg/mL 30µg/mL的亚硒酸钠；所述变温发酵的条件为：接种后，先于37 45℃及100~ ~ ~

120r/min条件下震荡培养12 16h，然后将温度降为36 37℃，继续培养30 32h；所述亚硒酸~ ~ ~钠的加入时间为接种后10 12h；

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所述多形汉逊酵母种子的接种量按照种子培养液与发酵培养基的体积比计算为5%；

多形汉逊酵母选自H.polymorpha DL-1菌株。

7.根据权利要求6所述一种富GSH-硒多形汉逊酵母的制备方法，其特征在于：所述多形汉逊酵母种子的获取方法包括以下步骤：将保存的多形汉逊酵母接入YEPD固体培养基中活化，将活化后的多形汉逊酵母接种至YEPD液体培养基，然后于100 120r/min及36 37℃条件~ ~下，振荡培养10 12h，得种子培养液。

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说明书

一种富GSH-硒多形汉逊酵母的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物发酵技术领域，特别涉及一种多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha，H.polymorpha)同时富集谷胱甘肽和有机硒(富GSH-硒)的方法。

背景技术

[0002] 硒(Selenium)是人、动物以及植物体必不可少的微量元素之一，它对维持机体正常新陈代谢以及多种疾病的发生均相关。硒在人体以硒蛋白质的形式存在，是构成谷胱甘肽过氧化酶活性的中心，其药理作用是通过构建谷胱甘肽过氧化酶来发挥抗氧化作用。硒在人体内以共价键结合蛋白质，涉及硒蛋氨酸，硒半胱氨酸，人体缺硒会引发心血管病、糖尿病、心功能不全、头晕目眩和癌症等40多种疾病。目前，对于补硒的方法大多数是以无机硒的形态补充，但吸收率低，且对人体有一定的毒副作用，而有机硒对人体没有毒性，所以如何将无机硒转化为有机硒，使微量元素的利用率提高、毒性降低越来越受到国内外有关学者的关注。

[0003] 目前，无机硒转化为有机硒的途径有动物转化法、植物自然转化法、微生物转化法等。动物转化法虽然能提高动物肉产品中的含硒量，但转化率、含量较低；植物转化法因长期施加硒肥，不仅成本高，而且容易造成环境污染；微生物转化法具有高吸收、天然安全、培养便利、各种条件易于控制、营养均衡的特点，可以作为将无机硒转化为有机硒的主要来源。

[0004] 研究表明，不少微生物具有良好的富硒能力，如酵母同化无机硒后得到的总硒中97％是有机硒，并且有机硒比无机硒生物活性高，天然安全，适合人体吸收。

[0005] 多形汉逊酵母(Hansenula Polymorpha，H.polymorpha)属于真菌门、酵母科、汉逊酵母属，为单细胞低等真核生物，多形汉逊酵母是一种耐热酵母，最高生长温度达49℃，最适温度为37～43℃。并且具有分裂速度快，生存力强，易于高密度发酵培养的优点，能在廉价的合成或半合成培养基上高密度生长。这不仅可以缩短发酵时间，而且降低了对发酵设备的制冷要求，从而极大地减少大规模培养成本和其发酵时受污染的风险。

[0006] 谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的活性三肽，几乎存在于生物体的所有细胞中。由于半胱氨酸上所具有的活性基团巯基可与重金属、碘乙酸等毒素相结合，使其具有整合解毒作用，即GSH具有广谱解毒作用；此外，GSH还具有抗氧化作用，达到延缓机体衰老的功效。因此，GSH在医药、保健食品和化妆品等行业有着广泛的应用。

[0007] 目前，国内GSH的市场需求量日益增多，但我国GSH几乎完全依赖进口。GSH的生产方法有化学合成法、萃取法、酶法和发酵法。其中，发酵生产GSH因其产量高、生产成本低、易分离、无污染等优点，日益备受国内外学者关注。目前，用于发酵GSH最常用的菌株主要为酵母菌，其中GSH含量较高的为多形汉逊酵母属。

[0008] 目前尚未见到发酵生产富GSH-硒酵母的方法报道。主要原因为：酵母富硒通常采用生物转化方式，由酵母将胞外亚硒酸钠转化为胞内的有机硒。但是，对于多形汉逊酵母而言，按照现有的亚硒酸钠的加入方式以及浓度，会抑制酵母菌体数量增加和胞内GSH合成。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于提供一种富GSH-硒多形汉逊酵母的制备方法，为富GSH-硒生物发酵的工业化生产提供实践依据。

[0010] 为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

[0011] 将多形汉逊酵母种子接种于发酵培养基中进行恒温发酵，恒温发酵过程中添加终浓度为20μg/mL～30μg/mL的亚硒酸钠；所述恒温发酵的条件包括：接种后，于36～37℃及100～120r/min条件下振荡培养46～50h；所述亚硒酸钠的加入时间为接种后10～12h。

[0012] 或者，将多形汉逊酵母种子接种于发酵培养基中进行变温发酵，变温发酵过程中添加终浓度为20μg/mL～30μg/mL的亚硒酸钠；所述变温发酵的条件为：接种后，先于37～45℃及100～120r/min条件下震荡培养12～16h，然后将温度降为36～37℃，继续培养30～32h；所述亚硒酸钠的加入时间为接种后10～12h。

[0013] 优选的，所述多形汉逊酵母种子的接种量按照种子培养液计算为2％～6％。

[0014] 优选的，所述多形汉逊酵母种子的获取方法包括以下步骤：将保存的多形汉逊酵母接入YEPD固体培养基中活化，将活化后的多形汉逊酵母接种至YEPD液体培养基，然后于100～120r/min及36～37℃条件下，振荡培养10～12h，得种子培养液。

[0015] 优选的，多形汉逊酵母选自H.polymorpha DL-1菌株。

[0016] 优选的，所述发酵培养基包括以下组分：酵母浸粉10g/L、葡萄糖400g/L以及蛋白胨20g/L。

[0017] 优选的，所述发酵培养基中还含有微量元素锰。

[0018] 优选的，所述恒温发酵的条件为：接种后于37℃及120r/min条件下培养48h；多形汉逊酵母种子接种量为4％，亚硒酸钠的加入时间为接种后12h，终浓度为30μg/mL。

[0019] 本发明的有益效果体现在：

[0020] 本发明通过控制发酵时间、温度等发酵条件以及亚硒酸钠的加入时机和浓度，利用多形汉逊酵母将亚硒酸钠转化成为有机硒，并激活酵母机体产生大量的GSH，从而制备富集有机硒和谷胱甘肽的复合酵母。该方法具有成本低、周期短、操作简单、产量高等优点。

具体实施方式

[0021] 下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。

[0022] 本发明中，将低温保存的多形汉逊酵母接入YEPD培养基中进行活化并冷藏备用，通过优化温度、接种量、微量元素的加入、亚硒酸钠浓度及加入时间，确定多形汉逊酵母转化亚硒酸钠的影响因素。通过确定多形汉逊酵母发酵的最佳条件，从而获得高产量的富谷胱甘肽及有机硒酵母。

[0023] (1)菌株

[0024] 多形汉逊酵母(H.polymorpha DL-1)，来源于ATCC No.26012，保藏于陕西科技大学天然产物生物合成实验室。

[0025] (2)培养基

[0026] YEPD固体培养基：酵母浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，琼脂粉20g/L，pH 6.5。

[0027] YEPD液体培养基(种子培养基)：酵母浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH 6.5。

[0028] 发酵培养基：酵母浸粉10g/L，葡萄糖400g/L，蛋白胨20g/L，pH 6.5。

[0029] (3)活菌数的测定

[0030] 稀释涂布平板计数法：在无菌条件下，取1mL的多形汉逊酵母培养液于9mL无菌水中，稀释成1/10稀释液，按此方法进行10倍递增，稀释至合适浓度，取0.1mL稀释液均匀涂布于已灭菌的YEPD固体培养基中，每个样品做两个稀释度，每个稀释度3个平行，然后置于37℃恒温培养箱培养48h，选取30-300个之间的菌落群，计算单位活菌数。

[0031] (4)硒含量测定

[0032] 1)采用紫外分光光度法(UV)

[0033] 测定原理：有机硒不能与3,3’-二氨基联苯胺(DAB)络合生成黄色络合物(Se-DAB)，而无机硒在酸性条件下，可与3,3’-二氨基联苯胺作用，生成Se-DAB。在pH7.0～7.5左右时，用甲苯萃取，根据有机层显色的程度，用分光光度法测定吸光度，从而确定亚硒酸钠的含量。

[0034] 具体操作：准确量取5mL的菌液置于离心管中，4000r/min离心20min，取上清液。再加入5mL的水复洗1次，取上清液，加入5mL的蒸馏水，用甲酸调节pH至2～3。加入4mL、0.2M的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)以掩盖干扰离子，然后加2mL 0.5％的DAB摇匀，于60℃水浴20min，取出，用浓氨水调节pH至7～7.5，准确移入4mL甲苯剧烈晃动1min，静置3～4min分层，然后将有机层通过脱脂棉滤到1cm的比色皿中，于420nm处测定溶液的吸光度，得到亚硒酸钠的含量，计算得到亚硒酸钠的转化率。

[0035] 2)采用催化吸光光度法

[0036] 测定原理：硒能够催化氯酸钾氧化苯腆生成偶氮离子，继而与变色酸偶合成红色偶氮染料，生成的红色偶氮染料的吸光度与一定浓度范围的硒成正比，因而可利用催化吸光光度法测定酵母中的有机硒含量。

[0037] 具体操作：将新鲜的硒酵母放于Tris-HCl-甘油缓冲液中，加入二氧化硅进行研磨，在电子显微镜下观察，待酵母细胞完全破碎后，装入事先处理好的透析袋内，扎紧上端，于蒸馏水中透析，其间不断换水，用无机硒和有机硒的定性鉴别方法，分别检测透析外液和透析内液，直到透析外液中检测不出无机硒时，停止透析。称取透析袋内样品于锥形瓶中，加入一定量的混合酸(浓硝酸与高氯酸按4:1体积比混匀)加热至发烟，待溶液变为淡黄色后，再加热2～3min。此时溶液变为无色，冷却后定容，测定，计算胞内有机硒的含量。

[0038] (5)谷胱甘肽的测定

[0039] 测定原理：谷胱甘肽含有疏基，按照疏基的测定方法可求出GSH的含量。

[0040] 具体操作：取多形汉逊酵母的新鲜发酵液5mL，离心，细胞沉淀用于测定胞内GSH的含量。将离心得到的新鲜酵母用蒸馏水洗涤两次，加入等量的破壁试剂，在沸水浴中水浴30min，7000r/min离心10min得上清液，用于胞内GSH检测。将经破壁处理后得到的上清液，加入1.5mL 0.06％NaOH和0.5mL 0.03％甲醛中摇匀，静置2min，再加入2.5mLDTNB分析液，摇匀，25℃水浴5min，测412nm吸光值，再根据吸光度与GSH浓度的关系计算出样品中GSH的含量。

[0041] 所述DTNB(5,5'-二硫代双2-硝基苯甲酸)分析液由1mL 0.01mol/L DTNB溶液与99mL0.25mol/L Tris-HCl缓冲液混合组成，pH8.0。

[0042] 所述破壁试剂由1％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.1mol/L的醋酸锂、蒸馏水组成。

[0043] (6)细胞干重的测定

[0044] 称取离心管的重量，取新鲜的发酵液2mL，8000r/min离心5min，蒸馏水洗涤2～3次，在85℃烘干至恒重，称重，用恒重后的重量减去初始离心管的重量，得到细胞干重。

[0045] (7)发酵液pH值的测定

[0046] 配制pH值为7的磷酸缓冲液，标定pH计，用标定过的pH计测定新鲜酵母液的pH。

[0047] (8)在600nm波长下测定多形汉逊酵母的生长曲线

[0048] (9)富GSH-硒多形汉逊酵母的制备工艺路线

[0049] 将4℃保存的多形汉逊酵母接入YEPD固体培养基中，于37℃活化24h，显微镜检无杂菌后，再以5％(v/v)的接种量接入YEPD固体培养基中活化两次，挑取一个菌落接种至装有10mL种子培养基的50mL三角瓶中进行种子培养，120r/min、37℃，振荡培养12h得种子培养液。将种子培养液按照一定的接种量接种至装有50mL发酵培养基的100mL三角瓶中进行发酵培养(装液量为50mL/100mL)，120r/min，37℃，振荡培养48h得最终发酵液。发酵期间将一定浓度的亚硒酸钠加入到三角瓶中。发酵结束后收集菌体。

[0050] 利用紫外分光光度计测定谷胱甘肽的标准曲线，谷胱甘肽的标准曲线为Y＝0.7154X-0.0004(R2＝0.9999)。线性关系良好，利用此标准曲线最终获得胞内谷胱甘肽的含量。亚硒酸钠的标准曲线为y＝0.0547x+0.0062(R2＝0.9995)。

[0051] (10)多形汉逊酵母转化亚硒酸钠的影响因素(单因素)

[0052] 1)多形汉逊酵母生长曲线的测定及培养时间的确定

[0053] 将多形汉逊酵母种子按照2％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，置于37℃、120r/min摇床培养48h，每隔6个小时测其活菌数、湿重以及pH值，结果显示，菌体在18～24h达到对数生长末期，此时培养液中的活菌数为1.1×107CFU/mL，pH值为5.17，菌体湿重为
4.34×10-2g/mL；24h～36h为稳定期，活菌数和干重保持相对稳定，从36h后活菌数开始下降，菌体开始进入衰亡期。由于菌体在对数生长的中后期时，菌体生长旺盛，细胞比生长速率最大，所以选择培养时间为24h。

[0054] 2)亚硒酸钠的添加浓度对转化率的影响

[0055] 制作加入亚硒酸钠浓度为10、20、30、40、50μg/mL的YEPD固体培养基，每个平板平均划分为三组，每组三个小格，第一组点5μL的原菌液(种子培养液)，第二组点5μL的稀释10倍后的原菌液，第三组点5μL的稀释100倍后的原菌液，观察多形汉逊酵母在培养基上的生长情况，确定添加亚硒酸钠的浓度。结果显示，原菌液在每个培养基上都能生长且生长状况良好，稀释10倍的菌液在加入20μg/mL亚硒酸钠浓度的培养基上生长减弱，而在加入30μg/mL亚硒酸钠浓度的培养基上生长明显减弱，且出现小面积红色，查阅文献可知，红色为单质硒，在加入40μg/mL、50μg/mL浓度亚硒酸钠的培养基上会出现大面积的红色。由此可知，多形汉逊酵母将亚硒酸钠转化成为有机硒时，发酵液中亚硒酸钠最大浓度30μg/mL。

[0056] 3)亚硒酸钠的加入时间对转化率的影响

[0057] 根据多形汉逊酵母的生长曲线，以5％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，在种子接入后的0h、12h、24h分别加入20μg/mL的亚硒酸钠，置于37℃、120r/min摇床培养48h，结果显示，12h时加入亚硒酸钠，多形汉逊酵母对亚硒酸钠的转化率最高，为94.55％。

[0058] 4)变温对多形汉逊酵母转化亚硒酸钠的影响

[0059] 将多形汉逊酵母种子按照5％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中(装液量为50mL/250mL)，在37℃(培养48h)、45-37℃(45℃培养16h后将温度降为37℃，继续培养32h)、
37-30℃(37℃培养16h后将温度降为30℃，继续培养32h。)三种条件下进行发酵，按照3)中确定的时间加入亚硒酸钠，使发酵液亚硒酸钠初始浓度为20μg/mL，120r/min摇床培养，测定多形汉逊酵母对亚硒酸钠的转化率，考察温度对多形汉逊酵母转化亚硒酸钠的影响。结果表明，45-37℃条件下转化率最高，为95.79％。说明变温培养可以提高多形汉逊酵母对亚硒酸钠的转化率。

[0060] 5)变温对多形汉逊酵母生产谷胱甘肽的影响

[0061] 在3)的三种温度条件下，测定细胞内谷胱甘肽的含量。结果表明，45-37℃条件下细胞内GSH的含量最高，为55.57mg/g。

[0062] 6)接种量对多形汉逊酵母转化亚硒酸钠的影响

[0063] 分别用2％、3％、4％、5％、6％(v/v)的接种量将多形汉逊酵母种子接种于发酵培养基(装液量为50mL/250mL)中，按照3)中确定的时间加入亚硒酸钠，使发酵液亚硒酸钠初始浓度为20μg/mL，在37℃、120r/min摇床培养48h，测定多形汉逊酵母对亚硒酸钠的转化率。结果显示，当接种量为4％时，转化率达到最大值，为96.40％。

[0064] 7)微量元素对多形汉逊酵母转化亚硒酸钠的影响

[0065] 分组分别加入质量分数1％的不同微量元素母液(KCl、Na2MOO4·2H2O、MnSO4·H2O的水溶液)各1-2mL/50mL培养基，按照3)中确定的时间加入亚硒酸钠，使发酵液亚硒酸钠初始浓度为20μg/mL，在37℃、120r/min摇床培养48h，测定多形汉逊酵母对亚硒酸钠的转化率。结果显示，空白组(未添加微量元素)亚硒酸钠的转化率为95.11％，对比空白组，只有硫酸锰的加入促进了多形汉逊酵母对亚硒酸钠的转化，其它转化率均低于空白组。加入硫酸锰后转化率为95.66％，但促进效果不明显。

[0066] (11)多形汉逊酵母生产有机硒的最佳条件(多因素)

[0067] 通过对接种量、加入亚硒酸钠的时间、加入亚硒酸钠的量、培养温度等多个因素的联合考察，得到多形汉逊酵母发酵的最适条件为：接种4％的多形汉逊酵母菌液(种子)，在培养至12h时，加入亚硒酸钠，使发酵液中亚硒酸钠浓度为30μg/mL，摇床120r/min及在37℃培养48h，此时亚硒酸钠的转化率最高，转化率为97.28％，细胞内GSH的含量为31.54mg/g。

[0068] 根据最佳条件结合实验分析，多形汉逊酵母在发酵过程中需要先通过无亚硒酸钠培养环境和一定培养条件下获得针对亚硒酸钠逆境的抵抗能力，通过快速转化培养基中的亚硒酸钠为细胞内的有机硒，并且，多形汉逊酵母在将亚硒酸钠转化成为有机硒的同时，其合成的谷胱甘肽可以和过量的亚硒酸钠产生氧化应激反应，从而减小亚硒酸钠对细胞的毒性；本发明还发现在亚硒酸钠转化过程中可以协同促进多形汉逊酵母体内GSH的生物合成。

[0069] 总之，本发明提供的富GSH-硒多形汉逊酵母的制备方法，具有成本低，产量高，易于操作等优点。亚硒酸钠转化率高达97.28％(经有机硒含量测定，胞内富集有机硒达到最大值)，相应的细胞内GSH的含量高达31.54mg/g。