体内筛选对肿瘤细胞生物学有影响生物大分子的动物模型

摘要

本发明涉及体内筛选对肿瘤细胞生物学有影响生物大分子的动物模型，具体的涉及一些对肿瘤血管生成有影响的基因或蛋白，无法通过体内试验证明其对肿瘤生物学功能有影响，利用此模型可以有效屏蔽新生血管影响肿瘤生长这一干扰因素。本发明对现有肿瘤血管生成因子和抑制因子的进一步功能的研究提供可靠模型，为他们的临床应用提供基础，具有重要的意义。

权利要求

1.一种用于体内筛选对肿瘤细胞生物学有影响的生物大分子的动物模型，模型制备方法包括：(1)采用微囊技术将肿瘤细胞微囊化处理，形成肿瘤细胞微囊复合体；

(2)检测微囊囊壁是否符合半透膜微孔径标准；

(3)将肿瘤细胞微囊复合体分组植入裸鼠皮下不同区域，观察各组肿瘤细胞微囊复合体与机体的生物相容性及有无毒副作用；

(4)移植后，在其中一组肿瘤细胞微囊复合体周围注射待检测生物大分子作为刺激组，在另一组肿瘤细胞微囊复合体周围先注射待检测生物大分子阻断剂后注射待检测生物大分子作为阻断组，对照组肿瘤细胞微囊复合体周围注射生理盐水；

(5)每隔1-7天重复步骤(4)，3-15次后终止实验；

(6)将各组植入皮下的肿瘤细胞微囊复合体取相同数量经破囊后收集囊内细胞团块，进行肿瘤细胞生物学检测。

2.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，每隔1-4天重复步骤(4)，2-4周后终止实验。

3.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，生物大分子为基因或蛋白。

4.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，生物大分子指对肿瘤血管生成有影响的基因或蛋白。

5.根据权利要求4所述的动物模型，其特征在于，对肿瘤血管生成有影响的基因或蛋白包括肿瘤血管生成因子和肿瘤血管生成抑制因子。

6.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，对肿瘤细胞生物学的影响是指对肿瘤细胞的周期、增殖、粘附、侵袭、迁移及凋亡的影响。

7.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，微囊囊材选自明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、淀粉、壳聚糖、甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇或聚氨酯中的一种或几种。

8.权利要求1所述的动物模型，其特征在于，微囊囊材为海藻酸钠。

9.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，半透膜微孔径为5-200nm。

10.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，半透膜微孔径为50-100nm。

11.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，肿瘤细胞微囊复合体周围先注射待检测生物大分子阻断剂后10-60分钟后注射待检测生物大分子。

12.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，生物大分子浓度为0-50μg/m1。

13.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，在制备动物模型前，将肿瘤细胞分成

3-10组，每组采用含不同浓度生物大分子的无血清培养基，各组每天MTT检测一次，连续检测5-7天，根据MTT检测值绘制不同生物大分子浓度作用下肿瘤细胞生长曲线，从中选出最佳的生物大分子浓度。

14.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，生物大分子阻断剂浓度为0.2-2μg/

105个细胞。

15.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，在制备动物模型前，将肿瘤细胞分成

3-10组，每组采用含不同浓度生物大分子阻断剂的无血清培养基，10-60分钟后注射待检测生物大分子，培养2-4天后MTT实验检测。

16.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，生物大分子为TSP-1蛋白；生物大分子阻断剂为CD36和/或CD47。

说明书

体内筛选对肿瘤细胞生物学有影响生物大分子的动物模型

技术领域

[0001] 本发明属于动物模型制备领域，具体涉及一种用于体内筛选对肿瘤细胞生物学有影响生物大分子的动物模型及其应用，更具体的涉及一些对肿瘤血管生成有影响的基因或蛋白，无法通过体内试验证明其对肿瘤生物学功能有影响，利用此模型可以解决该瓶颈。

背景技术

[0002] 肿瘤生长依赖于血管生成的概念始于20世纪70年代初，但其重要意主并未受到重视。近十年，由于发现了血管生成因子对血管生成的作用，以及血管生成对肿瘤生长和侵入转移、特别对肿瘤早期发生的重要影响，肿瘤血管生成成为近年来肿瘤研究的热点之一，为肿瘤治疗开辟了一个新的思路。

[0003] 目前已经报道了很多相关蛋白和因子，包括肿瘤血管生成因子和肿瘤血管生成抑制因子。但是，其中很多蛋白和因子没有进一步研究验证其是否对肿瘤细胞生物学有影响。这主要受制于目前的实验技术。肿瘤血管生成常用的体内实验有鸡胚绒毛尿囊膜实验、角膜微囊实验、海绵植入实验、圆盘血管生成系统、基质胶栓实验、海绵-基质胶实验，鸡胚绒毛尿囊膜实验使用鸡胚为实验体，鸡属于鸟纲，与哺乳动物有差距，角膜微囊实验需要在显微镜下手术，用刀片在靠近瞳孔的角膜上作1.5-2mm长的切口，不切透角膜，再用自制的虹膜铲沿眼球的弧度从切口向角巩膜缘推进，形成一个1.5mm×0.8mm大小的微囊，需要很精细的操作，不容易掌握，海绵植入皮下容易引起炎症反应等。

[0004] 本发明的目的在于提供一种用于体内筛选对肿瘤细胞生物学有影响基因的动物模型及其应用，对一些对肿瘤血管生成有影响的基因，想验证其是否对肿瘤细胞生物学有影响时，利用此模型可以有效屏蔽新生血管影响肿瘤生长这一干扰因素。本发明对现有肿瘤血管生成因子和抑制因子的进一步功能的研究提供可靠模型，为他们的临床应用提供基础，具有重要的意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种用于体内筛选对肿瘤细胞生物学有影响的生物大分子的动物模型，模型制备方法包括：

[0006] (1)采用微囊技术将肿瘤细胞微囊化处理，形成肿瘤细胞微囊复合体；

[0007] (2)检测微囊囊壁是否符合半透膜微孔径标准；

[0008] (3)将肿瘤细胞微囊复合体分组植入裸鼠皮下不同区域，观察各组肿瘤细胞微囊复合体与机体的生物相容性及有无毒副作用；

[0009] (4)移植后，在其中一组肿瘤细胞微囊复合体周围注射待检测生物大分子作为刺激组，在另一组肿瘤细胞微囊复合体周围先注射待检测生物大分子阻断剂后注射待检测生物大分子作为阻断组，对照组肿瘤细胞微囊复合体周围注射生理盐水；

[0010] (5)每隔1-7天重复步骤(4)，3-15次后终止实验；

[0011] (6)将各组植入皮下的肿瘤细胞微囊复合体取相同数量经破囊后收集囊内细胞团块，进行肿瘤细胞生物学检测。

[0012] 进一步，生物大分子包括蛋白质、基因、碳氢化合物，优选的，生物大分字为基因或蛋白。

[0013] 优选的，生物大分子指对肿瘤血管生成有影响的基因或蛋白，更优选的，肿瘤血管生成有影响的基因或蛋白包括肿瘤血管生成因子和肿瘤血管生成抑制因子。

[0014] 肿瘤血管生成因子一般包括VEGF及其受体家族、细胞外基质与基质金属蛋白酶、ETs家族成员、纤维母细胞生长因子家族及其受体、血小板源内皮细胞生长因子，具体如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、血小板起源生成长因(PDGF)、血小板活化因子(PAF)、转化生长因子α(TGF-α)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、白细胞介素-1、4、6、8、15(IL-1、4、6、8、15)、血管生成素、纤连蛋白、肿瘤坏死因子α、内毒素、金属蛋白酶(MMP)等；

[0015] 肿瘤血管生成抑制因子主要包括大分子蛋白前体酶解片段、细胞因子、丝氨酸蛋白酶抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂和抑癌基因，具体如血小板反应蛋白(TSP)、Angiostatin(血管抑制)、endostatin(内皮抑制)、苏拉明、干扰素α、β、γ、干扰素μ诱导的蛋白10、白细胞介素-12(IL-12)、血小板因子4等。

[0016] 进一步，对肿瘤细胞生物学的影响是指对肿瘤细胞的周期、增殖、粘附、侵袭、迁移及凋亡的影响。

[0017] 优选的，流式细胞检测细胞周期。

[0018] 优选的，采用MTT实验检测细胞增殖。

[0019] 优选的，使用酶标仪检测细胞粘附。

[0020] 优选的，采用Transwell小室技术检测细胞侵袭。

[0021] 优选的，采用划痕实验方法检测细胞迁移。

[0022] 优选的，采用荧光双染技术以及流式检测细胞凋亡。

[0023] 肿瘤细胞微囊化是用一层半透膜将细胞包裹在珠状的微囊里，从而使生物大分子和肿瘤细胞不能从微囊里溢出，而小分子的物质、培养基的营养物质可自由出入半透膜。

[0024] 微囊囊材选自明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、淀粉、壳聚糖、甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚氨酯等。优选的，微囊囊材为海藻酸钠。

[0025] 微囊制备方法包括物理化学法、化学法和物理机械法等3大类，物理化学法包括相分离法(单凝聚法、复凝聚法、溶剂-非溶剂法、改变温度法)、液中干燥法；化学法包括界面聚合法、单体聚合法、辐射法、液中硬化包衣法；物理机械法包括喷雾干燥法、喷雾冷凝法、空气悬浮包衣法、静电沉积法、多乳离心法、锅包法。

[0026] 进一步，半透膜微孔径为5-200nm，优选的，半透膜微孔径为50-100nm。

[0027] 进一步，肿瘤细胞微囊复合体周围分1-3个点注射生物大分子。

[0028] 进一步，肿瘤细胞微囊复合体周围先注射待检测生物大分子阻断剂后10-60分钟后注射待检测生物大分子。

[0029] 优选的，生物大分子浓度为0-50μg/m1。优选的，在制备动物模型前，将肿瘤细胞分成3-10组，每组采用含不同浓度生物大分子的无血清培养基，各组每天MTT检测一次，连续检测5-7天，根据MTT检测值绘制不同生物大分子浓度作用下肿瘤细胞生长曲线，从中选出最佳的生物大分子浓度。

[0030] 优选的，生物大分子阻断剂浓度为0.2-2μg/105个细胞。优选的，在制备动物模型前，将肿瘤细胞分成3-10组，每组采用含不同浓度生物大分子阻断剂的无血清培养基，10-60分钟后注射待检测生物大分子，培养2-4天后MTT实验检测。

[0031] 进一步，每隔1-4天重复步骤(4)，2-4周后终止实验。

[0032] 优选的，生物大分子为TSP-1蛋白。

[0033] 优选的，生物大分子阻断剂为CD36和/或CD47。

[0034] 优选的，TSP-1蛋白浓度为0-50μg/m1，更优选的，TSP-1蛋白浓度为40μg/m1。

[0035] 优选的，生物大分子阻断剂CD36和/或CD47浓度为0.2-2μg/105个细胞，更优选的，生物大分子阻断剂CD36和/或CD47浓度为1μg/105个细胞。

附图说明

[0036] 图1是分离纯化出口腔唾液腺MEC细胞图；(A)高分化唾液腺MEC组织块培养第5天(×100)；(B)中分化唾液腺MEC组织块培养第5天(×100)；(C)低分化唾液腺MEC组织块培养第5天(×100)；(D)高分化唾液腺MEC细胞培养第二代(×100)；(E)中分化唾液腺MEC细胞培养第二代(×100)；(F)低分化唾液腺MEC细胞培养第二代(×100)；(G)高分化唾液腺MEC细胞培养第十代(×100)；(H)中分化唾液腺MEC细胞培养第十代(×100)；(I)低分化唾液腺MEC细胞培养第十代(×100)；

[0037] 图2是不同分化程度的唾液腺MEC中TSP-1的表达图

[0038] 图3是WB方法检测唾液腺MEC中TSP-1，CD36及CD47的表达图

[0039] 图4是最佳细胞接种浓度检测图

[0040] 图5是最佳TSP-1作用浓度检测图

[0041] 图6是细胞增值指数及MTT检测OD值图

[0042] 图7是细胞粘附能力检测图

[0043] 图8是细胞划痕实验图

[0044] 图9是制备的微囊图

[0045] 图10是扫描电镜下微囊结构图；(A)扫描电镜下微囊整体外观；(B)扫描电镜下微囊剖面，类似海绵样可见大量微孔；(C)和(D)囊壁孔隙明显；

[0046] 图11是细胞增殖曲线图

[0047] 图12是粘液表皮样癌细胞微囊化体内移植后处死裸鼠后皮下植入微囊内成瘤情况图；(A)对照组；(B)TSP-1诱导组；(C)CD36阻断组；(D)CD47阻断组。

具体实施方式

[0048] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

[0049] 实施例1唾液腺MEC细胞原代培养，分离纯化及鉴定

[0050] 培养，分离纯化：采用组织块直接培养法对无菌取材的组织标本进行原代培养。在无菌条件下取出已用双抗处理的瘤组织，以无菌RPMI–1640完全培养基(含有10％胎牛血清)轻轻漂洗3次；用无菌眼科剪将各组肿瘤组织剪碎至约2mm3大小，将剪碎的肿瘤组织分散置入培养瓶中，缓慢将培养瓶翻转，先加入2ml完全培养基，然后于5％CO2、37℃孵箱内进行组织块培养；4h后再翻转至正常状态并补加少量培养液继续培养。并常规更换培养液直至细胞细胞汇合达70％-80％，0.25％胰酶消化细胞并重新贴壁，2h后弃去悬浮成分，之后每隔3-4天重复上述消化步骤1次。利用肿瘤细胞与成纤维细胞的贴壁时间不同的特点，多次应用反复贴壁法将肿瘤细胞与成纤维细胞逐步分开。进一步分离纯化唾液腺MEC细胞。

[0051] 鉴定：将纯化后的口腔唾液腺黏液表皮样癌(Mucoepidermoid Carcinoma，MEC)细胞以2×104/ml的浓度每孔2ml接种到事先放入盖玻片的6孔板内，待细胞生长并达到60-80％，取出盖玻片，常规免疫细胞染色，1:100的鼠抗人细胞角蛋白(Cytokeratin，pan)单克隆抗体或鼠抗人波形蛋白(vimentin)单克隆抗体4度过夜，生物素标记的兔抗鼠IgG二抗(l:200)37度孵育30min，加1:100过氧化物酶标记的链霉卵白素孵育30分钟(37℃)后；常规DAB显色等步骤后，于显微镜下观察。

[0052] 本发明已经成功培养、分离纯化出口腔唾液腺低分化MEC细胞，稳定传代72代，目前传代细胞生长良好，活力正常；相关实验结果如图1。

[0053] 实施例2肿瘤细胞的选择

[0054] 采用免疫荧光及Western Blot试验方法对高，中，低分化的唾液腺MEC进行TSP-1，CD36，CD47的表达进行检测。免疫荧光同样采取细胞爬片的方法，2×104/ml的浓度每孔2ml接种到事先放入盖玻片的6孔板内，1:100鼠抗人的TSP-1单克隆抗体4℃孵育过夜，避光滴加FITC荧光标记的兔抗鼠IgG二抗(l:200)，生物素标记的羊抗兔IgG二抗(l:200)，DAPI进行胞核的荧光染色2-3min，封片避光于荧光显微镜下观察。CD36与CD47的免疫荧光双重染色具体方法与TSP-1大致相同。其中CD36与CD47的一抗均为(1:50)，人生物素化—抗兔IgG二抗(l:200)，清洗后，滴加SABC-Cy3复合物，经荧光显微镜下观察已出现特异性荧光，再进行FITC—抗鼠IgG二抗(l:200)的孵育，时间相同，封片，避光置于湿盒内。随后在显微镜下观察。

[0055] Western Blot方法检测高，中，低分化的唾液腺MEC中TSP-1，CD36及CD47的表达；以2x105个/孔的浓度均匀接种于6孔板中培养，接种第二天进行细胞裂解及蛋白提取。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度；调整样本终浓度为2μg/μl精心电泳，每泳道20μl，转膜，脱脂奶粉封闭1Hr，一抗1:100孵育过夜，二抗1:1000孵育1Hr，TBST清洗后显影观察。

[0056] 研究中发现TSP-1蛋白特异表达于口腔唾液腺MEC胞浆中，并随恶性程度的增强TSP-1蛋白表达下降明显，见图2，同时发现TSP-1的受体CD36以及CD47在不同分化程度的唾液腺MEC中的表达无显著性差异。WesternBlot结果显示低分化唾液腺MEC中TSP-1的表达量显著低于高分化和中分化唾液腺MEC；TSP-1的受体CD36和CD47在高、中、低分化唾液腺MEC中表达无明显差异(见图3)。选择TSP-1表达最弱，同时又表达CD36与CD47蛋白的肿瘤细胞。

[0057] 实施例3选择合适的接种浓度以及TSP-1实验作用浓度和检测时间点

[0058] 将选择的肿瘤细胞分别以5×103/ml、1×104/ml、2×104/ml、5×104/ml的初浓度，接种96孔板。每种浓度细胞各分7组，每组接种6个复孔，每孔滴加200μl单细胞悬液，置于5％CO2 37℃培养。24h后，运用MTT法检测各浓度组中的第一小组各孔中的MTT值，如此连续测量7天，将记录结果以横轴为时间，纵轴为MTT值绘制各浓度接种组的细胞生长曲线。根据各组结果选择合适的细胞接种浓度，结果见图4。

[0059] 将所选肿瘤细胞以相同合适的细胞接种浓度接种于96孔板中，细胞完全贴壁后，更换不同TSP-1蛋白浓度的无血清培养基，0μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml，40μg/ml，50μg/ml六组；各组每天MTT法检测一次，共连续检测五天，其中每组每天检测六个复孔，根据各组MTT值绘制不同TSP-1浓度作用下的细胞生长曲线，从中选择出较理想的TSP-1作用浓度。

[0060] MTT分析吸光值(OD)显示TSP-1对MEC细胞生长的抑制作用在低于40μg/m1的浓度时有剂量依赖性，50μg/m1时抑制作用在各时间点与40μg/m1均无差别(见图5)。

[0061] 实施例4选择受体CD36、CD47的阻断抗体浓度

[0062] 将所选肿瘤细胞以相同合适的细胞接种浓度接种于96孔板，分空白对照组，TSP-1蛋白刺激组，CD36受体阻断组及CD47受体阻断组；CD36及CD47阻断组的阻断抗体浓度分别5 5 5
分为1μg/10个细胞、3μg/10个细胞、5μg/10个细胞。抗体阻断过程先加入阻断抗体，培养箱中孵育30min，再加入TSP-1刺激蛋白，继续培养72小时后MTT法检测各组中的光吸收值。
实验结果显示5μg/m1效果最佳。

[0063] 实施例5TSP-1及其受体CD36，CD47对唾液腺MEC生物学行为检测

[0064] 细胞周期及增殖能力检测：实验细胞以相同合适浓度接种于6孔板中，分为空白对照组，TSP-1刺激组(最佳作用浓度)，CD36受体阻断组及CD47受体阻断组四组，每组3个复孔，于5％CO2 37℃中培养72Hr后收集细胞，经固定清洗后，5％PI染液1ml，4℃避光染色30min，上流式细胞仪检测细胞周期；增殖能力采用MTT实验检测。

[0065] 流式细胞周期检测结果发现，对照组中G0/Gl期细胞数低于TSP-1及CD47阻断组，并存在显著性差异，而与CD36阻断组无显著性差异；TSP-1组中S期和G2/M期细胞数减少，并显著低于对照组和CD36阻断组，与CD47阻断组无明显差异。CD47阻断组G0/G1期细胞数明显高于CD36阻断组，而其G2/M期细胞数显著降低于CD36阻断组，两组间S期细胞数无显著性差异。细胞增值指数(A)及MTT检测OD值(B)分析提示，在TSP-1蛋白刺激组(40μg/m1)、CD36阻断组、CD47阻断组中，MEC细胞生长速度显著低于对照组。各组之间两两比较也有显著性差异，但CD36阻断后较明显缓解了TSP-1对唾液腺MEC细胞生长的抑制作用；而在CD47阻断组中缓解作用不如CD36阻断组明显(见图6)。

[0066] 细胞粘附能力检测：将各实验组及对照组细胞培养72Hr消化后接种于粘附板用无血清培养基培养2Hr后，清洗掉未粘附细胞加入MTT溶液继续无血清培养基培养4Hr后上酶标仪检测并同时对各组细胞进行HE染色观察。

[0067] 通过细胞计数及MTT检测方法发现：TSP-1组，CD36阻断组，D47阻断组胞粘附力均显著低于对照组(p<0.05)，但三组之间的组细胞粘附能力比较，两两之间无显著性差异(见图7)。

[0068] 细胞侵袭能力检测：采用Transwell小室技术对穿过小室的细胞进行HE染色，对穿膜细胞数计数进行各实验组及对照组的比较。

[0069] 细胞迁移能力检测：采用划痕实验方法，将肿瘤细胞接种于6孔板内待长至对数生长期时，于孔板内用洗头划出3mm宽的无细胞生长区，随机分为空白对照组，TSP-1蛋白刺激组(最佳作用浓度)，CD36受体阻断组及CD47受体阻断组四组，并更换相应组的培养基，连续观察5日后记录各组迁移进入划痕区的肿瘤细胞数。

[0070] 细胞划痕实验发现：TSP-l组中，迁移进入划痕区域的细胞数，显著低于对照组，而抗体阻断CD36或CD47后，TSP-l抑制细胞迁移的作用虽有一定的缓解，但并不显著(p>0.05)，具体见图8。

[0071] 细胞凋亡能力检测：采用透射电镜对TSP-1诱导唾液腺MEC细胞凋亡过程分别与8，16，32小时进行观察。采用荧光双染技术以及流式对TSP-1对唾液腺MEC细胞凋亡能力定性及定量检测。

[0072] 与对照组相比，TSP-1组明显促进肿瘤细胞凋亡，抗体CD47阻断后，细胞凋亡率与对照组比较无差异(p>0.05)；抗体CD36阻断后，细胞凋亡率与对照组及TSP-1组比较均有显著性差异(p<0.05)。

[0073] 实施例6微囊化唾液腺MEC细胞的制备和增殖

[0074] 于制备微囊前12小时收集前期筛选的唾液腺MEC细胞于无菌藻酸钠溶液中，保证6
浓度为5×10 个细胞/mL的细胞悬液，该悬液经由注射器的泵的针头被压出，运用脉冲微囊仪剪切注射器泵滴出的液滴，将成型的藻酸钙珠浸泡于多聚赖氨酸液体中，使胶珠表面与多聚赖氨酸发生络合反应并形成膜，进而形成微囊结构，将微囊重新浸泡于低浓度藻酸钠液体中，中和微囊表面的正电荷，再将微囊浸泡于3％的柠檬酸钠中，使溶液中的钠离子置换出藻酸钙凝胶中的钙离子，并用无菌生理盐水清洗后置于含20％胎牛的RPMI-1640培养基中，37℃5％CO2中培养。

[0075] 微囊制备成功后外观呈透明的圆形胶囊样，微囊表面光滑并有光泽，冻干后呈圆形白色不透明球状物(图9A)。制备完成的微囊在培养基中可均匀分布并能够在长期、时间内不发生溶胀破溃现象(图9B)。微囊化的唾液腺MEC细胞在制备24h后即可聚集成团。随着培养时间的延长，微囊内的肿瘤细胞团直径逐渐增大(图9C中箭头所示)。通过电镜扫描微囊结构，微囊内面凸凹不平，有利于增大微囊内表面积，为细胞附着提供有力环境(具体见图10)。

[0076] 实验细胞以相同合适浓度接种于24孔板中，分为对照组和微囊组，每组三个重复并且细胞数量相同，采用MTT实验检测，每天计算细胞生殖情况，直至7天，绘制生殖曲线，结果见下表。

[0077]

[0078] 第一天和第二天对照组和微囊组数值无统计学差异(t＝2.143,P>0.05；t＝1.116,P>0.05)，从第三天开始，微囊组OD值明显高于对照组，并且增殖曲线显示对照组在第五天达到峰值，第六天开始有凋亡，但是在微囊组直到第七天都没有达到峰值，也没有出现凋亡，显示微囊组较对照组显示更好的增殖活性(见图11)。

[0079] 实施例7肿瘤细胞微囊复合物的裸鼠皮下移植及细胞增殖检测

[0080] 将对照组及各实验组微囊化的粘液表皮样癌细胞体外短期培养3天后，选择各组形态完好，未溶胀破损的微囊进行裸鼠皮下四个区域的体内移植，移植后密切观察裸鼠生活情况，未见明显异常及死亡现象，说明移植入皮下的微囊对裸鼠无毒副作用。

[0081] 将四实验组相同细胞浓度(2×104/m1)的微囊分别于每个裸鼠的不同四个区域进行皮下移植。移植后第7天开始于移植的TSP-1诱导组微囊周围分3点注射40μg/m1TSP-1 0.5ml；在CD36阻断组微囊周围分3点先注射5μg/m1的Anti-CD36单抗0.5ml，30分后再注射
40μg/m1TSP-1 0.5ml；在CD47阻断组微囊周围分3点先注射5μg/m1的Anti-CD47单抗0.5ml，
30分后再注射40μg/m1TSP-1 0.5ml；对照组以等量生理盐水代替，每3天重复注射一次，移植后3周终止实验，将各组植入皮下微囊取相同数经破囊后收集囊内细胞团块，处死裸鼠收集植入微囊及周围组织进行固定、包埋、切片和HE染色。

[0082] 结果发现植入皮下的各组微囊囊壁外周虽然均有不同程度的新生血管，但由于囊壁的屏蔽作用未见血管长入微囊内，与对照组相比TSP-1组囊内的细胞数量明显少于对照组；抗体阻断CD36后囊内细胞数量明显增加并接近对照组，抗体阻断CD47后囊内细胞数量与TSP-1组比较无明显差别(结果见图12)，说明TSP-1在不依赖抑制肿瘤血管生长的前体下对粘液表皮样癌细胞的增殖有较明显的抑制作用，而此过程是通过TSP-1与细胞表面受体CD36结合后而活化的；TSP-1蛋白分子可以在体内复杂三维环境中通过受体CD36抑制粘液表皮样癌细胞增殖。TSP-1蛋白分子可以在抑制肿瘤血管新生的同时又通过与细胞表面受体CD36相作用抑制肿瘤细胞增殖的双重途径抑制粘液表皮样癌的发展。

[0083] 同时，结果表明，通过本发明提供的动物模型能够在体内研究对肿瘤血管生成有影响的基因或蛋白是否对肿瘤细胞生物学有影响，有效解决了目前科学研究中的瓶颈，填补了国内外空白，具有重要的应用价值。