一种基于体液中细胞源性囊泡的多功能载体及制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种基于体液中细胞源性囊泡的多功能载体及制备方法和应用，步骤是：（1）收集人的体液，经梯度超速离心，弃上清，用无菌PBS重悬沉淀；（2）将体液来源细胞源性膜性囊泡、超小粒径发光材料和电穿孔缓冲液加入到电击杯中混匀，置于电穿孔仪上处理，电穿孔结束后室温放置修复，经超速离心后用PBS重悬沉淀，获取基于体液来源细胞源性膜性囊泡并经超小粒径发光材料标记的多功能载体。该载体在制备治疗或预防肿瘤的化疗药物或基因治疗药物中应用，具备良好的生物相容性，方便载入多种治疗药物，有效抑制肿瘤生长，适用于多种良、恶性肿瘤的诊疗，尤其为颅内、胸腔内和腹腔内深部肿瘤的诊疗提供了选择。

权利要求

1.一种基于体液中细胞源性囊泡的多功能载体的制备方法，其步骤是：

(1)收集5mL循环血或唾液，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心

18-22min，取上清，再次在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，获取上清，然后在3-5℃条件下继续48000～52000g离心60min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性微粒；收集5mL循环血或唾液，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，取上清，然后在3-5℃条件下继续12000～16500g离心

20～40min，取上清，然后在3-5℃条件下继续100000～120000g离心60～70min将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性外泌体；收集5mL循环血或唾液，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，取上清，再次在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，获取上清，然后在3-5℃条件下继续100000～

120000g离心60～70min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性膜性囊泡，所述的细胞源性膜性囊泡包括体液源性微粒和体液源性外泌体；

(2)将20μg体液中细胞源性膜性囊泡、50μL超小粒径发光材料和150μL电穿孔缓冲液加入到电击杯中并混匀，设置电穿孔参数：输出脉冲电压250V，电容250μF，单次脉冲，将电击杯置于电穿孔仪上，按上述参数进行电穿孔，电穿孔结束后，将混合液室温放置28-32min，最后，将混合液在3-5℃条件下18000g～22000g离心18-22min，弃上清，用150μL PBS重悬沉淀，获取超小粒径发光材料标记的体液来源细胞源性膜性囊泡；

所述的超小粒径发光材料为直径1.8nm的超小锰磁性近红外量子点，浓度为1mg/mL；

(3)将步骤(2)中获得的基于体液来源细胞源性膜性囊泡并经超小粒径发光材料标记的多功能载体、肿瘤化疗药物或siRNA、miRNA用于基因治疗的核酸片段，以及电穿孔缓冲液混合，经电穿孔方式向该多功能载体内载入肿瘤治疗药物或基因治疗片段，反应参数同步骤(2)，电穿孔结束后，将混合液室温放置28-32min，最后，将混合液在3-5℃条件下18000g～22000g离心18-22min，弃上清，用150μLPBS重悬沉淀，获取超小粒径发光材料标记，载有化疗药物或治疗基因的体液来源细胞源性膜性囊泡。

说明书

一种基于体液中细胞源性囊泡的多功能载体及制备方法和

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物与医药新剂型、制剂技术领域，更具体涉及一种基于体液中细胞源性膜性囊泡的多功能载体，该载体具备良好的生物相容性，优越且稳定持久的活体荧光成像能力和磁共振成像能力，高效的药物荷载和安全的肿瘤靶向递送能力；更具体涉及一种基于体液中细胞源性膜性囊泡的多功能载体的制备方法，该方法简洁高效，产出率高，产物质量均一稳定；还涉及一种基于体液中细胞源性膜性囊泡的多功能载体的用途，利用该基于体液中细胞源性膜性囊泡的多功能载体实现治疗基因片段或化疗药物的特异性靶向输送，用以预防或治疗诸如口腔癌、宫颈癌、脉管畸形等多种良、恶性疾病。

背景技术

[0002] 细胞源性膜性囊泡，又被称为细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)，是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体，直径小于1000nm。细胞源性膜性囊泡主要由细胞源性微粒(Microparticles,MPs)和外泌体(Exosomes,EXOs)组成。其中，细胞源性微粒是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为100～1000nm；外泌体由细胞内的多泡小体(multivesicular bodies,MVB)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为40～100nm。细胞源性膜性囊泡广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，在许多生理病理学过程中充当细胞间信息传递载体，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。基于细胞源性膜性囊泡天然的运载属性和良好的生物安全性，细胞源性膜性囊泡被认为是极具前景的基因或药物递送平台.[0003] 与人工合成的载体(如脂质体)相比，细胞源性膜性囊泡具有多种优势，例如免疫原性和毒性低，肿瘤主动靶向性强，体液中天然稳定性好。因此，如何将细胞源性膜性囊泡改造成治疗疾病的载体是近年来相关研究领域的热点问题，而且不少学者已经取得了令人兴奋的结果。但是，目前所有的关于细胞源性膜性囊泡载体的研究中所用到的细胞源性膜性囊泡几乎都是通过体外细胞培养获得的，这一途径给膜性囊泡的实践应用带来了诸多局限和隐忧：(1)获取大量用于生产膜性囊泡的“母系细胞”是一个极其耗时耗力的工作，尤其对于那些无法增殖的细胞(例如血小板)，或者是需要从活体组织分离的原代细胞，这既增加了技术难度又耗费大量财力；(2)体外培养细胞用于获取膜性囊泡，其较低的产出率难以满足临床极大用量的需求；(3)细胞的体外培养是一个对刺激极其敏感的过程，培养条件的变异必然导致细胞生理状态的改变，继而影响其所分泌膜性囊泡的理化特性，导致实践应用中膜性囊泡生物学效应的迥异；(4)细胞在漫长的体外培养及传代过程中，交叉污染的潜在可能也严重威胁这一产物在临床应用中的生物安全性；(5)异体来源细胞所分泌的膜性囊泡在活体应用时也存在与宿主细胞发生免疫反应的担忧。当前，上述的这些弊端严重阻碍了细胞源性膜性囊泡在临床诊疗中的实践应用。

[0004] 其中，血液中含有的细胞源性膜性囊泡被称为循环膜性囊泡，包括循环微粒(Circulating microparticles，CMPs)和循环外泌体(Circulating exosomes)；唾液中含有细胞源性膜性囊泡被称为唾液来源膜性囊泡，包括唾液来源微粒(Salivary microparticles，SMPs)和唾液来源外泌体(Salivary exosomes)。相比于体外细胞培养获取的细胞源性膜性囊泡，这些体液来源的细胞源性膜性囊泡具有诸多天然优势：(1)体液种类丰富，来源众多，并且许多种类的体液来源细胞源性膜性囊泡在多种生理病理刺激情况下含量会显著上升；(2)获取体液的操作多数情况下属于微创，甚至无创；(3)直接从体液中分离微粒，避免了体外培养方法中冗长的操作步骤，以及可能存在的交叉污染，既节省了财力又保证了安全性；(4)将自体体液中分离的细胞源性膜性囊泡经功能化修饰后用于疾病的个体化诊疗，消除了免疫毒性或生物安全性的担忧，这是十分理想的应用模式；(5)循环血、唾液等多种体液量大且可重复获取，并且多种体液均含有较高浓度的细胞源性膜性囊泡，例如正常情况下循环血中微粒的浓度约13.5±7.7μg/mL，而在多种病理情况下将显著升高(例如口腔癌患者循环血中微粒浓度可达到50μg/mL)，这一较高的产率可以满足临床用量的需求。

[0005] 细胞源性膜性囊泡的标记与活体成像是评估细胞源性膜性囊泡作为疾病治疗载体安全性及研究其体内分布、代谢动力学的重要手段，为该载体的可视化治疗奠定基础。现有的技术通过对“母系细胞”的处理，例如在体外培养过程中将不同的成像材料与细胞共培养，在细胞吞噬这些材料后，再分离包裹有上述成像材料的膜性囊泡，从而间接实现对细胞源性膜性囊泡的量子点标记和(或)磁性纳米颗粒标记，实现了利用活体荧光成像和磁共振成像对细胞源性膜性囊泡的实时追踪。然而对于体液来源的细胞源性膜性囊泡，这些标记策略却效果有限，最根本的原因在于无法对活体内的细胞进行修饰处理。因此，目前对于体液来源细胞源性膜性囊泡的可视化主要依赖于各种与膜脂质直接结合的荧光染料，但是这些荧光染料的先天缺陷，例如光漂白、弱荧光信号、潜在的细胞毒性、非特异性标记等，严重限制了其在体液来源细胞源性膜性囊泡研究中的应用。

发明内容

[0006] 本发明目的是提供一种基于体液中细胞源性膜性囊泡的多功能载体，该多功能载体在血液中具有天然的稳定性，并可以延长荷载药物的半衰期和作用时间，减轻全身毒副反应；该多功能载体可自由穿透体内生物屏障，作用于常规治疗方法难以起效的深在部位，改善临床疗效；该多功能载体能够快速、大量的聚集在肿瘤部位，具有很强的肿瘤主动靶向性，利用该载体所修饰的超小粒径发光材料(超小锰磁性近红外量子点、叶绿素或碳点等)的荧光或核磁成像特性，可清晰指示活体内肿瘤部位、累及范围等信息，辅助临床诊疗；聚集在肿瘤部位的多功能载体所携带的基因治疗片段或化疗药物还能够诱导肿瘤细胞凋亡，抑制其生长，有效地将肿瘤早期诊断和可视化治疗结合在一起；该多功能载体具备良好的生物相容性，未发现任何生物毒性或免疫原性，可根据病变种类选择荷载药物类型，适用于多种良、恶性肿瘤的治疗，尤其为颅内、胸腔内和腹腔内等深部恶性肿瘤的早期诊断和可视化治疗提供了新的选择。

[0007] 本发明的另一个目的是在于提供了一种基于体液中细胞源性膜性囊泡多功能载体的制备方法。该方法通过超速离心的方法自人不同种类体液中分离获取体液来源细胞源性膜性囊泡，随后利用电穿孔的方法一步实现体液源性膜性囊泡内部超小粒径发光材料(超小锰磁性近红外量子点、叶绿素或碳点等)、治疗基因片段或化疗药物的载入，同期实现了体液来源细胞源性膜性囊泡的标记和药物的荷载。该方法简便易行，不依赖复杂的操作仪器，极易推广；该制备方法可根据肿瘤的临床特征，选择敏感的合适药物载入体液来源细胞源性膜性囊泡内部，实现肿瘤的个性化治疗；并且该制备方法获得的多功能载体中，超小粒径发光材料标记和药物荷载效率接近100％，且载入量均匀一致，产物稳定性好；该制备方法对体液来源细胞源性膜性囊泡自身的理化特性以及其所携带的生物分子无显著影响，因而不存在生物毒性或免疫原性的担忧，保证了后续诊疗应用的生物安全性。该制备方法简便高效的获得了一种超小粒径发光材料标记，并且载有敏感化疗药物或治疗基因片段的生物相容性的多功能载体。

[0008] 本发明还有一个目的是在于提供了一种基于体液中细胞源性膜性囊泡的多功能载体在制备治疗或预防良、恶性肿瘤(例如口腔癌)的化疗药物或基因治疗药物中的用途。该多功能载体内部修饰有超小粒径发光材料，该材料具备优异的活体内荧光成像能力，并且信号稳定，持续时间长，同时利用病人体液来源细胞源性膜性囊泡的天然肿瘤靶向性，以及体液来源细胞源性膜性囊泡自由穿透体内多种生物屏障的特性，可以实现超小粒径发光材料在肿瘤病变部位的富集，包括颅内等深在部位，结合活体荧光成像系统或核磁共振成像系统，可以实现肿瘤的可视化，为肿瘤等病变的早期诊断提供了方法；另一方面，根据肿瘤的临床特征选择该多功能载体内部荷载药物的种类，包括化疗药物、治疗基因片段等，结合体液来源细胞源性膜性囊泡的天然肿瘤靶向性，可以实现药物向肿瘤部位的靶向递送，改善治疗效果，同时减轻全身毒副作用。这一应用为肿瘤的早期诊断，治疗和可视化诊疗提供了新的选择。

[0009] 为了达到上述的目的，本发明采用以下技术措施：

[0010] 其技术构思：该多功能载体主要由体液来源细胞源性膜性囊泡，超小锰磁性近红外量子点和化疗药物/基因片段构成。

[0011] 一种基于体液中细胞源性囊泡，超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体，其特征在于：体液中细胞源性膜性囊泡，超小锰磁性近红外量子点，其结构式如下：

[0012] 体液中细胞源性膜性囊泡，如图(17)所示；

[0013] 超小锰磁性近红外量子点，如图(18)所示；

[0014] 将上述制备的多功能载体(100μL，1mg/mL)经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内。活体荧光成像系统发现，上述多功能载体在注射后1h即明显富集于肿瘤部位，并且荧光信号强度随时间逐渐增强。磁共振信号检测发现，在注射后2h即可检测到肿瘤组织中T1加权信号的明显增加，表明上述多功能载体具有优异的天然肿瘤靶向性，在肿瘤组织内可快速高效的富集，可用于肿瘤的早期诊断。

[0015] 一种基于体液中细胞源性囊泡，超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的，并且载有基因治疗片段(survivin-siRNA)的多功能载体，其特征在于：体液中细胞源性膜性囊泡，超小锰磁性近红外量子点和基因治疗片段，其结构式如下：

[0016] 体液中细胞源性膜性囊泡，如图(17)所示；

[0017] 超小锰磁性近红外量子点，如图(18)所示；

[0018] 基因治疗片段，如图(19)所示；

[0019] 将上述制备的多功能载体(100μL，1mg/mL)和游离siRNA经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内后，上述多功能载体显著抑制肿瘤生长，而对裸鼠的体重无明显影响，提示其具备优异的抗肿瘤效应且生物毒性较低。进一步对分离的肿瘤组织做组织学分析后发现，上述制备的多功能载体明显抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，而游离的siRNA未见显著的上述效应。

[0020] 一种基于体液中细胞源性囊泡，超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的，并且载有化疗药物的多功能载体，其特征在于：体液中细胞源性膜性囊泡，超小锰磁性近红外量子点和化疗药物，其结构式如下：

[0021] 体液中细胞源性膜性囊泡，如图(17)所示；

[0022] 超小锰磁性近红外量子点，如图(18)所示；

[0023] 化疗药物，如图(20)所示，其中：O代表氧原子，C代表碳原子，H代表氢原子，HO(OH)代表羟基，NH2代表氨基，CH3代表甲基。

[0024] 将上述制备的多功能载体(100μL，1mg/mL)和游离化疗药物(阿霉素)经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内后，上述多功能载体显著抑制肿瘤生长，而对裸鼠的体重无明显影响，提示其具备优异的抗肿瘤效应且生物毒性较低。进一步对分离的肿瘤组织做组织学分析后发现，上述制备的多功能载体明显抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，而游离的化疗药物(阿霉素)未见显著的上述效应。

[0025] 一种基于体液中细胞源性囊泡，超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的，并且载有基因治疗片段和化疗药物的多功能载体，其特征在于：体液中细胞源性膜性囊泡，超小锰磁性近红外量子点，基因治疗片段和化疗药物，其结构式如下：

[0026] 体液中细胞源性膜性囊泡，如图(17)所示；

[0027] 超小锰磁性近红外量子点，如图(18)所示；

[0028] 基因治疗片段，如图(19)所示；

[0029] 化疗药物，如图(20)所示，其中：O代表氧原子，C代表碳原子，H代表氢原子，HO(OH)代表羟基，NH2代表氨基，CH3代表甲基。

[0030] 将上述制备的多功能载体和游离siRNA或化疗药物(阿霉素)经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内后，上述多功能载体显著抑制肿瘤生长，而对裸鼠的体重无明显影响，提示其具备优异的抗肿瘤效应且生物毒性较低。进一步对分离的肿瘤组织做组织学分析后发现，上述制备的多功能载体明显抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，而游离的siRNA或化疗药物(阿霉素)未见显著的上述效应。

[0031] 一种基于体液中细胞源性膜性囊泡多功能载体的制备方法，其步骤是：

[0032] 1.收集5mL循环血或唾液(体液)，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心(Centrifuge 5810R，Eppendorf，Germany，以下相同)18-22min，取上清，再次在
3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，获取上清，然后在3-5℃条件下继续48000～
52000g离心60min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性微粒；收集5mL循环血或唾液，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，取上清，然后在3-5℃条件下继续12000～16500g离心20～40min，取上清，然后在3-5℃条件下继续100000～120000g离心60～70min将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性外泌体；收集5mL循环血或唾液，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，取上清，再次在3-5℃条件下用1800～
2200g离心18-22min，获取上清，然后在3-5℃条件下继续100000～120000g离心60～70min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性膜性囊泡(包括体液源性微粒和体液源性外泌体)。

[0033] 2.将20μg(50μL)体液来源细胞源性膜性囊泡，50μL超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)(1mg/mL)和150μL电穿孔缓冲液(Bio-Rad)加入到电击杯中并混匀。设置电穿孔参数：输出脉冲电压250V，电容250μF，单次脉冲。将电击杯置于电穿孔仪(Bio-Rad Gene TMPulser Xcell  Electroporation System，Hercules，CA，USA)上，按上述参数进行电穿孔。
待电穿孔结束后，将混合液体室温(20-25℃，以下相同)放置28-32min。最后，将混合液在3-
5℃条件下1800g～2200g离心18-22min，弃上清，用150μL PBS重悬沉淀，获取超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的体液来源细胞源性膜性囊泡，经修饰后的体液来源细胞源性膜性囊泡可以实现荷载药物的肿瘤靶向递送，并且具备荧光及核磁双相示踪能力。

[0034] 3.将步骤2中制备的超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体进行透射电镜、荧光显微镜和流式细胞术检测，证实电穿孔非偶联式标记策略可实现对体液来源细胞源性膜性囊泡接近100％的标记效率。

[0035] 4.将步骤2中制备的超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体与步骤1中制备的未标记的体液来源细胞源性膜性囊泡进行物理特性和生化组分对比，动态光散射分析证实这一标记策略并不会影响体液来源细胞源性膜性囊泡的流体动力学直径和电动电势等物理特征。此外，PCR和蛋白印迹实验证实这一标记策略也不会改变体液来源细胞源性膜性囊泡内部载运的mRNA和蛋白质等特征分子。表明：电穿孔的非偶联式标记策略可以实现体液来源细胞源性膜性囊泡的快速、高效、生物安全性高的量子点标记。

[0036] 5.将步骤2中制备的超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体与CFSE标记的体液来源细胞源性膜性囊泡同时置于激光持续照射下，检测二者荧光信号的变化。结果表明CFSE标记的体液来源细胞源性膜性囊泡在持续照射5min后荧光信号即显著降低，暴露20min后荧光信号基本湮灭，而利用电穿孔非偶联式标记策略实现的量子点标记在持续暴露120min后，膜性囊泡的荧光信号依然未见明显改变。此外，上述制备的量子点标记多功能载体与CFSE标记的体液来源细胞源性膜性囊泡在室温下存储2天后再对比二者的荧光信号，前者未见明显改变，而后者已显著降低。这一结果证实利用电穿孔的非偶联式标记策略实现的量子点标记体液来源细胞源性膜性囊泡具备优异的抵抗光漂白作用，可以满足长时间的持续性荧光观察。

[0037] 6.将步骤2中制备的超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体在室温下储存2天，用7T的磁共振扫描仪检测其磁共振信号，相比于新鲜制备的多功能载体，室温储存2天后的样品，其T1加权信号未见明显改变。

[0038] 7.将步骤2中制备的超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体注射到裸鼠皮下，利用活体成像系统检测其荧光信号，结果发现该荧光信号在裸鼠皮下原位至少可保留96h而未见明显衰减。上述结果证实这一利用电穿孔非偶联式标记策略实现的量子点标记体液来源细胞源性膜性囊泡在体外和体内稳定性较高。

[0039] 8.将步骤2中制备的超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体(100μL，1mg/mL)经尾静脉注射到裸鼠体内，饲养2周。与性别、年龄和体重匹配的未治疗组裸鼠相比，血液学分析证实治疗组裸鼠的肝肾功能以及血常规各项指标未见明显差别，组织学分析证实治疗组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等重要脏器未见明显的病理改变。这些结果证实这一利用电穿孔非偶联式标记策略实现的量子点标记体液来源细胞源性膜性囊泡具有良好的生物相容性。

[0040] 本发明通过向人体液来源的膜性囊泡载入超小粒径发光材料和治疗性的基因片段和化疗药物，首次将人体液来源的膜性囊泡改造成可用于肿瘤早期诊断和可视化靶向治疗的纳米载体。本发明中所用的膜性囊泡直接来源于人的体液，相比于体外细胞培养获取的细胞源性膜性囊泡，这些体液来源的细胞源性膜性囊泡具有诸多天然优势：(1)体液种类丰富，来源众多，并且许多种类的体液来源细胞源性膜性囊泡在多种生理病理刺激情况下含量会显著上升；(2)获取体液的操作多数情况下属于微创，甚至无创；(3)直接从体液中分离微粒，避免了体外培养方法中冗长的操作步骤，以及可能存在的交叉污染，既节省了财力又保证了安全性；(4)将自体体液中分离的细胞源性膜性囊泡经功能化修饰后用于疾病的个体化诊疗，消除了免疫毒性或生物安全性的担忧；(5)循环血、唾液等多种体液量大且可重复获取，可以满足临床用量的需求。此外，与人工合成药物释放载体或基于体外细胞培养来源的膜性囊泡的药物释放载体相比，本发明提供一种基于体液中细胞源性膜性囊泡的多功能载体，该多功能载体在血液中具有天然的稳定性，并可以延长荷载药物的半衰期和作用时间，减轻全身毒副反应；该多功能载体可自由穿透体内生物屏障，作用于常规治疗方法难以起效的深在部位，改善临床疗效；该多功能载体具有很强的肿瘤主动靶向性，可用于肿瘤的早期诊断和可视化靶向治疗，具有较好的肿瘤治疗效果；该多功能载体具备良好的生物相容性，未发现任何生物毒性或免疫原性。本发明为为体液源性膜性囊泡的研究提供了新手段，也为体液源性膜性囊泡的临床应用提供了可行的策略，

[0041] 一种基于体液中细胞源性囊泡，超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体在制备治疗或预防口腔癌的基因治疗药物和化疗药物中的应用以及口腔癌早期诊断中的应用。

[0042] 1.将口腔癌患者体液(外周血或唾液)中分离得到的细胞源性膜性囊泡利用上述方法制备成超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的体液来源细胞源性膜性囊泡。

[0043] 2.将步骤1中制备的多功能载体和CFSE染色标记的体液来源细胞源性膜性囊泡分别与口腔鳞状细胞癌细胞CAL27共培养，孵育2小时后，荧光显微镜观察到相似的摄取效率，细胞增殖和活力实验证实二者均无明显的生长促进或细胞毒性效应。

[0044] 3.将步骤1中制备的多功能载体(100μL，1mg/mL)经尾静脉注射到裸鼠体内，饲养2周。与性别、年龄和体重匹配的未治疗组裸鼠相比，血液学分析证实治疗组裸鼠的肝肾功能以及血常规各项指标未见明显差别，组织学分析证实治疗组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等重要脏器未见明显的病理改变。这些结果证实这一利用电穿孔非偶联式标记策略实现的量子点标记体液来源细胞源性膜性囊泡具有良好的生物相容性。

[0045] 4.将上述制备的多功能载体(100μL，1mg/mL)和游离的Mn-NIR-QDs分别经尾静脉注射到实验组和对照组裸鼠体内，利用活体成像系统分别在30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h和48h检测上述荧光信号在裸鼠体内的组织分布。结果发现，游离的Mn-NIR-QDs逐渐聚集于肝、脾、肾，并在8h达到浓度高峰，随后逐渐降低，而上述制备的多功能载体在循环血中更加稳定，分布更为广泛，以较缓慢的速度逐渐聚集于肝、脾、肾，并在48h达到浓度高峰。将上述裸鼠的器官取出单独分析后发现，在注射后24h，62.54％游离的Mn-NIR-QDs和57.82％上述制备的多功能载体位于肝脏，而在48h后，肝脏中游离的Mn-NIR-QDs降至55.57％，上述制备的多功能载体增加至63.03％。

[0046] 5.将上述制备的多功能载体(100μL，1mg/mL)经尾静脉注射到裸鼠体内，利用7T磁共振扫描仪对裸鼠体内T1加权信号变化进行监测，发现在24h后，肝、脾、肾中有明显的信号增强，而肺中未见明显变化，这与活体成像系统检测到的近红外信号相一致。

[0047] 6.将上述制备的多功能载体(100μL，1mg/mL)和游离的Mn-NIR-QDs分别经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内。活体成像系统发现，上述多功能载体在注射后1h即明显富集于肿瘤部位，并且信号强度随时间逐渐增强，对分离的肿瘤组织进行组织学分析后，同样证实了上述多功能载体在注射后24h和48h在肿瘤组织中的大量富集。平均荧光强度分析发现，肿瘤组织内信号强度在注射后24h与肝脏相似，而在注射后48h肿瘤组织内信号强度明显高于肝脏；荧光强度占比分析发现，在注射后24h只有5.01％游离的Mn-NIR-QDs位于肿瘤组织内，但是上述多功能载体的比例却达到总量的18.74％，并且在注射后48h达到总量的35.14％，而此时肿瘤组织中已经几乎无法检测到游离的Mn-NIR-QDs。磁共振信号检测发现，在注射后2h即可检测到肿瘤组织中T1加权信号的明显增加。上述结果证明这一利用电穿孔非偶联式标记策略实现的量子点标记体液来源细胞源性膜性囊泡具有优异的天然肿瘤靶向性，在肿瘤组织内可快速高效的富集，使肿瘤的早期诊断成为可能。

[0048] 一种基于体液中细胞源性囊泡，超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的，并且载有基因治疗片段(survivin-siRNA)的多功能载体在制备治疗或预防口腔癌的基因治疗药物中的应用。其步骤是：

[0049] 1.收集口腔癌患者的体液样品(外周血或唾液)，将其转移至离心管中，在3～5℃条件下经1800～2200g离心18-22min后，取上清，重复上述条件离心，获取上清，然后在3～5℃条件下继续48000～52000g离心60min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬后冻存于-80℃，获得体液中细胞源性微粒；收集5mL循环血或唾液，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，取上清，然后在3-5℃条件下继续12000～16500g离心20～
40min，取上清，然后在3-5℃条件下继续100000～120000g离心60～70min将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性外泌体；收集5mL循环血或唾液，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，取上清，再次在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，获取上清，然后在3-5℃条件下继续100000～
120000g离心60～70min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性膜性囊泡(包括体液源性微粒和体液源性外泌体)。

[0050] 2.将20μg(50μL)体液来源细胞源性膜性囊泡、50μL超小锰磁性近红外量子点(Mn-FAMNIR-QDs)(1mg/mL)、FAM标记的靶向Survivin分子的抗肿瘤siRNA(siRNA )(500nm)和150μL电穿孔缓冲液加入到电击杯中并混匀。设置电穿孔参数：输出脉冲电压250V，电容250μF，单次脉冲。将电击杯置于电穿孔仪上，按上述参数进行电穿孔实验。待电穿孔结束后，将混合液室温放置30min。最后，将混合液在3～5℃条件下利用蔗糖密度梯度离心方法去除混合液中游离的量子点和siRNA，用无菌PBS重悬沉淀，获取超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记并且载有靶向Survivin分子的抗肿瘤siRNA的体液来源细胞源性膜性囊泡。

[0051] 3.将步骤2中制备的多功能载体进行荧光显微镜观察和流式细胞学检测，证实了Mn-NIR-QDs和siRNA的双重标记效率约72.2％。

[0052] 4.将步骤2中制备的多功能载体与口腔鳞状细胞癌细胞CAL27共培养，孵育24h后，对细胞中Survivin的基因和蛋白表达进行分析，证实了二者的表达水平显著下调。MTT实验和EdU核素参入实验均证实上述制备的多功能载体可明显降低肿瘤细胞的增殖活性。

[0053] 5.将上述制备的多功能载体经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内，结果发现在注射后24h，肿瘤组织中富集的上述多功能载体约达到总量的18.74％，而在注射48h，约达到总量的35.14％，这些结果证实上述制备的多功能载体具有良好的肿瘤靶向性，为其应用于肿瘤治疗奠定了基础。

[0054] 6.将上述制备的多功能载体和游离的靶向Survivin分子的抗肿瘤siRNA分别经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内，结果发现上述多功能载体显著抑制肿瘤生长，而对裸鼠的体重无明显影响，提示其具备优异的抗肿瘤效应且生物毒性较低。进一步对分离的肿瘤组织做组织学分析后发现，上述制备的多功能载体明显抑制肿瘤组织中Survivin的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，而游离的siRNA未见显著的上述效应。

[0055] 一种基于体液中细胞源性囊泡，超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的，并且载有化疗药物的多功能载体在制备治疗或预防口腔癌的化疗药物中的应用，其步骤是：

[0056] 1.收集口腔癌患者的体液样品(外周血或唾液)，将其转移至离心管中，在3～5℃条件下经1800～2200g离心18-22min后，取上清，重复上述条件离心，获取上清，然后在3～5℃条件下继续48000～52000g离心60min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬后冻存于-80℃，获得体液中细胞源性微粒；收集5mL循环血或唾液，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，取上清，然后在3-5℃条件下继续12000～16500g离心20～
40min，取上清，然后在3-5℃条件下继续100000～120000g离心60～70min将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性外泌体；收集5mL循环血或唾液，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，取上清，再次在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，获取上清，然后在3-5℃条件下继续100000～
120000g离心60～70min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性膜性囊泡(包括体液源性微粒和体液源性外泌体)。

[0057] 2.将20μg(50μL)体液来源细胞源性膜性囊泡、50μL超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)(1mg/mL)、化疗药物阿霉素(Doxorubicin，DOX)和150μL电穿孔缓冲液加入到电击杯中并混匀。设置电穿孔参数：输出脉冲电压250V，电容250μF，单次脉冲。将电击杯置于电穿孔仪上，按上述参数进行电穿孔实验。待电穿孔结束后，将混合液室温放置30min。最后，将混合液在3～5℃条件下利用蔗糖密度梯度离心方法去除混合液中游离的量子点和化疗药物DOX，用无菌PBS重悬沉淀，获取超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记并且载有化疗药物DOX的体液来源细胞源性膜性囊泡。

[0058] 3.将步骤2中制备的多功能载体进行荧光显微镜观察和流式细胞学检测，观察Mn-NIR-QDs和DOX的双重标记效率。

[0059] 4.将步骤2中制备的多功能载体与口腔鳞状细胞癌细胞CAL27共培养，孵育24h后，MTT实验和EdU核素参入实验均证实上述制备的多功能载体可明显降低肿瘤细胞的增殖活性。

[0060] 5.将上述制备的多功能载体经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内，结果发现上述多功能载体明显富集于肿瘤组织中并且在48h内富集总量随时间延长而增加。这些结果证实上述制备的多功能载体具有良好的肿瘤靶向性，为其应用于肿瘤治疗奠定了基础。

[0061] 6.将上述制备的多功能载体和游离的DOX分别经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内，结果发现上述多功能载体显著抑制肿瘤生长，而对裸鼠的体重无明显影响，提示其具备优异的抗肿瘤效应且生物毒性较低。进一步对分离的肿瘤组织做组织学分析后发现，上述制备的多功能载体明显抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，而游离的DOX未见显著的上述效应。

[0062] 一种基于体液中细胞源性囊泡，超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的，并且载有基因治疗片段(survivin-siRNA)和化疗药物的多功能载体在制备治疗或预防口腔癌的基因治疗药物和化疗药物中的应用，其步骤是：

[0063] 1.收集口腔癌患者的体液样品(外周血或唾液)，将其转移至离心管中，在3～5℃条件下经1800～2200g离心18-22min后，取上清，重复上述条件离心，获取上清，然后在3～5℃条件下继续48000～52000g离心60min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬后冻存于-80℃，获得体液中细胞源性微粒；收集5mL循环血或唾液，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，取上清，然后在3-5℃条件下继续12000～16500g离心20～
40min，取上清，然后在3-5℃条件下继续100000～120000g离心60～70min将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性外泌体；收集5mL循环血或唾液，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，取上清，再次在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，获取上清，然后在3-5℃条件下继续100000～
120000g离心60～70min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性膜性囊泡(包括体液源性微粒和体液源性外泌体)。

[0064] 2.将20μg(50μL)体液来源细胞源性膜性囊泡、50μL超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)(1mg/mL)、FAM标记的靶向Survivin分子的抗肿瘤siRNA(siRNAFAM)(500nm)、化疗药物阿霉素(Doxorubicin，DOX)和150μL电穿孔缓冲液加入到电击杯中并混匀。设置电穿孔参数：输出脉冲电压250V，电容250μF，单次脉冲。将电击杯置于电穿孔仪上，按上述参数进行电穿孔实验。待电穿孔结束后，将混合液室温放置30min。最后，将混合液在3～5℃条件下利用蔗糖密度梯度离心方法去除混合液中游离的量子点和化疗药物DOX，用无菌PBS重悬沉淀，获取超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记并且载有靶向Survivin分子的抗肿瘤siRNA和化疗药物DOX的体液来源细胞源性膜性囊泡。

[0065] 3.将步骤2中制备的多功能载体进行荧光显微镜观察和流式细胞学检测，观察Mn-NIR-QDs、siRNA和DOX的标记效率。

[0066] 4.将步骤2中制备的多功能载体与口腔鳞状细胞癌细胞CAL27共培养，孵育24h后，MTT实验和EdU核素参入实验均证实上述制备的多功能载体可明显降低肿瘤细胞的增殖活性。

[0067] 5.将上述制备的多功能载体经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内，结果发现上述多功能载体明显富集于肿瘤组织中并且在48h内富集总量随时间延长而增加。这些结果证实上述制备的多功能载体具有良好的肿瘤靶向性，为其应用于肿瘤治疗奠定了基础。

[0068] 6.将上述制备的多功能载体和游离的siRNA或DOX分别经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内，结果发现上述多功能载体显著抑制肿瘤生长，而对裸鼠的体重无明显影响，提示其具备优异的抗肿瘤效应且生物毒性较低。进一步对分离的肿瘤组织做组织学分析后发现，上述制备的多功能载体明显抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，而游离的siRNA或DOX未见显著的上述效应。

[0069] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

[0070] 该多功能载体在血液中具有天然的稳定性，并可以延长荷载药物的半衰期和作用时间，减轻全身毒副反应；此外，该多功能载体还能自由穿透体内生物屏障，作用于常规治疗方法难以起效的深在部位，改善临床疗效；该多功能载体能够快速、大量的聚集在肿瘤部位，具有很强的肿瘤主动靶向性，利用该载体所修饰超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)的荧光或核磁成像特性，可以清晰指示活体内肿瘤的部位及累及范围等信息，辅助临床诊疗；并且聚集在肿瘤部位的多功能载体所携带的基因治疗片段或化疗药物还能够诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的生长，有效地将肿瘤早期诊断和可视化治疗结合在一起。该多功能载体具备良好的生物相容性，未发现任何生物毒性或免疫原性，可根据病变种类方便选择荷载药物类型，适用于多种良、恶性肿瘤的治疗，尤其为颅内、胸腔内和腹腔内等深部恶性肿瘤的早期诊断和可视化化疗提供了新的选择。与现有技术相比，具体优点总结如下：

[0071] 1.该基于体液来源细胞源性膜性囊泡的多功能载体直接分离体液中细胞源性膜性囊泡用于制备多功能载体，与体外大量扩增细胞以生产膜性囊泡的方法相比，节省了人力物力财力，并且自体体液来源细胞源性膜性囊泡用于个体化诊疗避免了潜在的免疫原性和生物安全性问题。

[0072] 2.体液种类丰富，可多次重复微创甚至无创获取，并且体液中膜性囊泡浓度较高，可以快速满足临床用量的需求。

[0073] 3.利用电穿孔实现体液来源细胞源性膜性囊泡的量子点标记，相较于其他标记方法，不需要对“母系细胞”进行处理，具有快速、简单、高效的特点，此外标记的荧光信号具有强度高、耐漂白的优势，可以满足长时间的持续观察。

[0074] 4.Mn-NIR-QDs既具备卓越的荧光特性，又有良好的核磁成像效应，这为这一多功能载体与临床上广泛使用的核磁共振成像检查系统可以实现无缝对接。

[0075] 5.利用体液来源细胞源性膜性囊泡可自由穿透体内生物屏障以及天然肿瘤靶向性，依靠这一多功能载体的荧光信号或磁信号可以实现颅内、胸腔、腹腔等深部肿瘤的早期无创诊断。

[0076] 6.针对不同的病理情况及药物敏感性，可以调整这一多功能载体内载入药物或基因片段的种类及数量，因人而异，因病程发展而调整，真正实现个体化诊疗。

[0077] 7.这一模式适用于几乎所有类型体液源性微粒，具备极大的扩展性。

附图说明

[0078] 图1为一种基于体液源性微粒的多功能载体的制备方法模式图。

[0079] 图2为一种Mn-NIR-QDs标记血液源性微粒的效率图。

[0080] (a)经电穿孔向血液源性微粒内部载入Mn-NIR-QDs，然后将该多功能载体与未处理血液源性微粒(对照)用CFSE染色标记，之后在荧光显微镜下观察荧光信号，发现经电穿孔制备的多功能载体组，CFSE与QD信号高度一致。(b)经电穿孔向血液源性微粒内部载入Mn-NIR-QDs，然后将该多功能载体与未处理血液源性微粒(对照)分别用流式细胞学技术分析荧光信号密度，最终证实电穿孔载入QD的效率高达91.5％。

[0081] 图3为一种基于血液源性微粒的多功能载体制备过程对血液源性微粒理化特性无显著影响。

[0082] 经电穿孔向血液源性微粒内部载入Mn-NIR-QDs后，利用透射电镜观察对照组血液源性微粒(CMPs)和该多功能载体(QD-CMPs)(a)，利用蛋白质免疫印迹分析对照组血液源性微粒(CMPs)和该多功能载体(QD-CMPs)特征性蛋白表达(b)，分析对照组血液源性微粒(CMPs)和该多功能载体(QD-CMPs)水流动力学直径变化(c)，分析对照组血液源性微粒(CMPs)和该多功能载体(QD-CMPs)携带的特征性mRNA含量变化(d)。发现基于血液源性微粒的多功能载体制备过程对血液源性微粒上述理化特性无显著影响。

[0083] 图4为一种基于血液源性微粒的多功能载体的荧光信号稳定性和储存稳定性。

[0084] (a)将该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)与CFSE染色标记的未处理血液源性微粒(CFSE-CMPs)分别用激光持续照射，发现CFSE的荧光信号在6min后即有明显衰减，而该多功能载体的QD信号在持续照射120min后仍未发现显著变化，提示该基于血液源性微粒的多功能载体具备良好的抗光漂白特性。(b，c)将该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)与CFSE染色标记的未处理血液源性微粒(CFSE-CMPs)分别在室温下储存2天，利用流式细胞学技术和核磁共振成像技术对比二者荧光信号以及磁信号的变化，结果表明CFSE染色标记的血液源性微粒(CFSE-CMPs)在储存2天后荧光信号基本湮灭，而基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)荧光信号及磁信号未见明显变化，提示该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)具备良好的储存稳定性。

[0085] 图5为一种基于血液源性微粒的多功能载体可被细胞有效内吞。

[0086] 将该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)与CFSE染色标记的未处理血液源性微粒(CFSE标记的CMPs)分别于口腔癌肿瘤细胞CAL27共培养，在荧光显微镜下观察计数，发现该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)与CFSE染色标记的未处理血液源性微粒(CFSE标记的CMPs)具备相似的内吞效率。

[0087] 图6为一种基于血液源性微粒的多功能载体在活体内的荧光信号稳定性。

[0088] 将该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)和未处理血液源性微粒(对照)分别注射于裸鼠局部皮下，于注射后10min、2h、24h、96h分别在荧光活体成像系统中观察裸鼠皮下及室温储存的该多功能载体的荧光信号，发现二者变化趋势一致，且均无显著的信号衰减。证实该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)具备良好的活体稳定性。

[0089] 图7为一种基于血液源性微粒的多功能载体具备良好的生物安全性。

[0090] 将该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)和未处理血液源性微粒(对照)分别与口腔癌细胞CAL27共培养，检测不同培养时间(0-72h)对细胞增殖能力的影响，以及不同浓度(0-40μg/mL)对细胞活力的影响，结果证实该基于血液源性微粒的多功能载体对肿瘤细胞增殖和活力的影响与未处理血液源性微粒无显著差异。

[0091] 图8为一种基于血液源性微粒的多功能载体具备良好的活体内安全性。

[0092] 将该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)和未处理血液源性微粒(对照)分别经尾静脉注射入裸鼠体内，然后对裸鼠的肝肾功能(a)、血常规(b)和收获的内脏标本切片进行对比分析，结果证实该基于血液源性微粒的多功能载体对裸鼠的生理指标无显著影响，证明该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)具备良好的活体内生物安全性。

[0093] 图9为一种基于血液源性微粒的多功能载体在活体内的荧光信号分布分析。

[0094] 将该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)和未处理的Mn-NIR-QDs(QDs)分别经尾静脉注射入裸鼠体内，然后利用荧光活体成像系统观察注射前、注射后1h、注射后4h、注射后8h、注射后24h、注射后48h裸鼠体内荧光信号的分布(a)，并对注射后24h和48h收获的裸鼠内脏进行荧光信号对比分析(b)，以及各内脏器官荧光信号百分比进行对比分析。

[0095] 图10为一种基于血液源性微粒的多功能载体在活体内的磁信号分布分析。

[0096] 将该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)经尾静脉注射到裸鼠体内，然后利用核磁共振成像系统对注射前以及注射后24h，裸鼠内脏中磁信号的变化进行对比分析。

[0097] 图11为一种基于血液源性微粒的多功能载体在活体内的天然肿瘤靶向性。

[0098] 将该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)和未处理的Mn-NIR-QDs(QDs)分别经尾静脉注射到口腔癌移植瘤裸鼠模型体内，利用活体荧光成像系统分析注射前、注射后1h、注射后4h、注射后8h和注射后24h的裸鼠体内荧光分布(a)，对注射后24h收获的裸鼠内脏和肿瘤进行荧光信号分析(b，c)，以及各内脏和肿瘤荧光信号百分比进行对比分析(d)，并利用核磁共振成像系统对注射前、注射后2h以及注射后24h裸鼠肿瘤部位磁信号的变化进行对比分析。结果表明该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)具备天然的肿瘤靶向性，能主动富集于肿瘤部位，并可通过荧光活体成像系统或核磁共振成像系统显示。

[0099] 图12为一种基于血液源性微粒的多功能载体载入治疗基因片段的效率。

[0100] 利用电穿孔向将该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)内部载入FAM标记的siRNA，然后利用流式细胞学技术分析载入效率，结果证明一步法同期实现QD与siRNA双重载入的效率高达72.2％。

[0101] 图13为一种基于血液源性微粒的多功能载体载入治疗基因片段后良好的体外抗肿瘤效果。

[0102] 利用电穿孔向将该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)内部载入针对survivin的siRNA，然后将未经处理的血液源性微粒(对照)、游离siRNA(siRNA)、该基与血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)和载有治疗基因的多功能载体(siRNA/QD-CMPs)分别与口腔癌肿瘤细胞CAL27进行共培养，然后分析肿瘤细胞中survivin的mRNA和蛋白质表达水平(a)、肿瘤细胞的生长(b)、肿瘤细胞的增殖(c)等。结果表明相较于其他三组，载有治疗基因的多功能载体(siRNA/QD-CMPs)具备良好的抑制survivin表达，从而抑制肿瘤增殖生长的能力。

[0103] 图14为一种基于血液源性微粒的多功能载体载入治疗基因片段后良好的体内抗肿瘤效果。

[0104] 利用电穿孔向将该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)内部载入针对survivin的siRNA，然后将未经处理的血液源性微粒(对照)、游离siRNA(siRNA)、该基于血液源性微粒的多功能载体(QD-CMPs)和载有治疗基因的多功能载体(siRNA/QD-CMPs)分别经尾静脉注射入口腔癌移植瘤裸鼠模型体内，没两天记录裸鼠肿瘤体积(宽*宽*长/2)(b)以及裸鼠体重(c)变化，并对最终收获的肿瘤进行拍照对比分析(a)和组织学检测(survivin表达，细胞增殖指标Ki-67和细胞凋亡指标TUNEL)。结果表明相较于其他三组，载有治疗基因的多功能载体(siRNA/QD-CMPs)能有效抑制肿瘤的增长，而对裸鼠体重无显著影响，组织学分析发现载有治疗基因的多功能载体(siRNA/QD-CMPs)可有效抑制肿瘤细胞中survivin的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，促进细胞的凋亡。证明一种基于血液源性微粒的多功能载体载入治疗基因片段后具备良好的体内抗肿瘤效果。

[0105] 图15为一种Mn-NIR-QDs标记唾液来源微粒的效率图。

[0106] 经电穿孔向唾液来源微粒内部载入Mn-NIR-QDs，然后将该多功能载体与未处理唾液来源微粒(SMPs)分别用流式细胞学技术分析荧光信号密度，最终证实电穿孔载入QD的效率高达88.1％。

[0107] 图16为一种基于唾液来源微粒的多功能载体的活体荧光信号稳定性。

[0108] (a)将该基于唾液来源微粒的多功能载体(QD-SMPs)与未处理唾液来源微粒(SMPs)分别在明场和近红外激发的活体成像系统中观察荧光信号。(b)将该基于唾液来源微粒的多功能载体(QD-SMPs)与未处理唾液来源微粒(SMPs)分别注射到裸鼠舌内，分别在注射后2h、4h和24h观察注射部位荧光信号的变化。结果发现持续观察24h，注射部位该基于唾液来源微粒的多功能载体的荧光信号未见明显变化，提示该基于唾液来源微粒的多功能载体(QD-SMPs)具备良好的荧光信号稳定性。

[0109] 图17为一种基于体液中细胞源性囊泡的结构式。

[0110] 图18为超小锰磁性近红外量子点的结构式。

[0111] 图19为基因治疗片段的结构式。

[0112] 图20为化疗药物的结构式。

具体实施方式

[0113] 实施例1：

[0114] 一种基于体液中细胞源性囊泡，超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体的制备方法，其步骤是：

[0115] 1.用含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管收集外周血样品，将其转移至离心管中，在3或4或5℃条件下用1800或1900或2000或2100或2200g离心18或19或20或21或22min，取上清，再次在3或4或5℃条件下用1800或1900或2000或2100或2200g离心18或19或20或21或22min，获取上清，然后在3或4或5℃条件下继续48000或49000或50000或51000或52000g离心60min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得血液来源微粒。

[0116] 2.将20μg(50μL)血液来源微粒/50μL超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)(1mg/mL)和150μL电穿孔缓冲液加入到电击杯中并混匀。设置电穿孔参数：输出脉冲电压250V，电容250μF，单次脉冲。将电击杯置于电穿孔仪上，按上述参数进行电穿孔。待电穿孔结束后，将混合液室温放置30min。最后，将混合液在3～5℃条件下18000或190000或20000或21000或22000g离心18或19或20或21或22min，弃上清，用150μL PBS重悬沉淀，获取超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的血液源性微粒，该修饰后的血液来源微粒可以实现荷载药物的肿瘤靶向递送，并且具备荧光及核磁双模成像示踪能力。

[0117] 3.将步骤2中制备的超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体进行透射电镜、荧光显微镜和流式细胞术检测，证实这一电穿孔非偶联式标记策略实现了对血液来源微粒接近100％的标记效率。(图2，图3a)

[0118] 4.将步骤2中制备的超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体与步骤1中制备的未标记的血液来源微粒进行物理特性和生化组分对比，动态光散射分析证实这一标记策略并不会影响血液来源微粒的流体动力学直径和电动电势等物理特征。此外，PCR和蛋白印迹实验(Western blot)证实这一标记策略也不会改变血液来源微粒内部载运的mRNA和蛋白质等特征分子。这些结果证明这一电穿孔非偶联式标记策略可以实现血液来源微粒的快速、高效和生物友好性的量子点标记。(图3b-d)

[0119] 5.将步骤2中制备的超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体与CFSE标记的血液来源微粒同时置于激光的持续照射下，检测二者荧光信号的变化。结果表明CFSE标记的血液来源微粒在持续照射5min后荧光信号即显著降低，暴露20min后荧光信号基本湮灭，而利用电穿孔的非偶联式标记策略实现的量子点标记在持续暴露120min后，微粒的荧光信号依然未见明显改变。此外，上述制备的量子点标记多功能载体与CFSE标记的血液来源微粒室温下存储2天后再对比二者的荧光信号，前者未见明显改变，而后者已显著降低。这一结果证实利用这一电穿孔非偶联式标记策略实现的量子点标记血液来源微粒具备优异的抵抗光漂白作用，可以满足长时间的持续性荧光观察。(图4a-b)

[0120] 6.将步骤2中制备的超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体在室温下储存2天，用7T的磁共振扫描仪检测其磁共振信号，相比于新鲜制备的多功能载体，室温储存2天后的样品，其T1加权信号未见明显改变。(图4c)

[0121] 7.将步骤2中制备的超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体注射到裸鼠皮下，利用活体成像系统检测其荧光信号，结果发现该荧光信号在裸鼠皮下原位至少可保留96小时而未见明显衰减。上述结果证实这一利用电穿孔非偶联式标记策略实现的量子点标记血液来源微粒在体外和体内均具备良好的稳定性。(图6)

[0122] 8.将步骤2中制备的超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体(100μL，1mg/mL)经尾静脉注射到裸鼠体内，饲养2周。与性别、年龄和体重匹配的未治疗组裸鼠相比，血液学分析证实治疗组裸鼠的肝肾功能以及血常规各项指标未见明显差别，组织学分析证实治疗组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等重要脏器未见明显的病理改变。这些结果证实这一利用电穿孔非偶联式标记策略实现的量子点标记体液源性微粒具有良好的生物相容性。(图7，图8)

[0123] 实施例2：

[0124] 一种基于体液中细胞源性囊泡，超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体在制备治疗或预防口腔癌的基因治疗药物和化疗药物中的应用以及口腔癌早期诊断中的应用，其步骤如下：

[0125] 1.用含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管收集外周血样品，将其转移至离心管中，在3或4或5℃条件下用1800或1900或2000或2100或2200g离心18或19或20或21或22min，取上清，再次在3或4或5℃条件下用1800或1900或2000或2100或2200g离心18或19或20或21或22min，获取上清，然后在3或4或5℃条件下继续48000或49000或50000或51000或52000g离心60min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得血液来源微粒。

[0126] 2.将20μg(50μL)血液来源微粒，50μL超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)(1mg/mL)和150μL电穿孔缓冲液加入到电击杯中并混匀。设置电穿孔参数：输出脉冲电压250V，电容250μF，单次脉冲。将电击杯置于电穿孔仪上，按上述参数进行电穿孔。待电穿孔结束后，将混合液室温放置30min。最后，将混合液在3～5℃条件下18000g或190000或20000或21000或22000g离心18或19或20或21或22min，弃上清，用150μL PBS重悬沉淀，获取超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的血液来源微粒，该修饰后的血液来源微粒可以实现荷载药物的肿瘤靶向递送，并且具备荧光及核磁双相示踪能力。

[0127] 3.将步骤2中制备的多功能载体和CFSE染色标记的血液来源微粒分别与口腔鳞状细胞癌细胞CAL27共培养，孵育2小时后，荧光显微镜观察到相似的摄取效率，细胞增殖和活力实验证实二者均无明显的生长促进或细胞毒性效应。(图5)

[0128] 4.将步骤2中制备的多功能载体(100μL，1mg/mL)经尾静脉注射入裸鼠体内，饲养两周。与性别、年龄和体重匹配的未治疗组裸鼠相比，血液学分析证实治疗组裸鼠的肝肾功能以及血液成分未见明显差别，组织学分析证实治疗组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾未见明显病理改变。这些结果证实这一利用电穿孔的非偶联式标记策略实现的量子点标记血液来源微粒具有良好的生物相容性。

[0129] 5.将上述制备的多功能载体(100μL，1mg/mL)和游离的Mn-NIR-QDs分别经尾静脉注射到实验组和对照组裸鼠体内，利用活体成像系统分别在30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h和48h检测荧光信号在裸鼠体内的组织分布。结果发现，游离的Mn-NIR-QDs逐渐聚集于肝、脾、肾，并在8h达到浓度高峰，随后逐渐降低，而上述制备的多功能载体在循环血中更加稳定，分布更为广泛，以较缓慢的速度逐渐聚集于肝、脾、肾，并在48h达到浓度高峰。将上述裸鼠的器官取出单独分析发现，在注射后24h，62.54％游离的Mn-NIR-QDs和57.82％上述制备的多功能载体位于肝脏，而在48h后，肝脏中游离的Mn-NIR-QDs降至55.57％，而肝脏中上述制备的多功能载体增加至63.03％。(图9)

[0130] 6.将上述制备的多功能载体(100μL，1mg/mL)经尾静脉注射入裸鼠体内，利用7T磁共振扫描仪对裸鼠体内T1加权信号变化进行监测，发现在24h后，肝、脾、肾中有明显的信号增强，而肺中未见明显变化，这与活体成像系统检测到的近红外信号相一致。(图10)[0131] 7.将上述制备的多功能载体(100μL，1mg/mL)和游离的Mn-NIR-QDs分别经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内。活体成像系统发现，上述多功能载体在注射后1h即明显富集于肿瘤部位，并且信号强度随时间逐渐增强，对分离的肿瘤组织进行组织学分析同样证实了上述多功能载体在注射后24h和48h大量富集于肿瘤组织。平均荧光强度分析发现，肿瘤组织内信号强度在注射后24h与肝脏相似，而在48h，肿瘤组织内信号强度明显高于肝脏；荧光强度占比分析发现，在注射后24h，只有5.01％游离的Mn-NIR-QDs位于肿瘤组织内，但是上述多功能载体的比例却达到总量的18.74％，并且在注射后48h达到总量的35.14％，而此时肿瘤组织中已经几乎无法检测到游离Mn-NIR-QDs。磁共振信号检测发现，在注射后2h即可检测到肿瘤组织中T1加权信号的明显增加。上述结果证明这一利用电穿孔非偶联式标记策略实现的量子点标记血液源性微粒具有优异的天然肿瘤靶向性，在肿瘤组织内可快速高效的富集，使肿瘤的早期诊断成为可能。(图11)

[0132] 实施例3：

[0133] 一种基于体液中细胞源性囊泡，超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的，并且载有基因治疗片段(survivin-siRNA)的多功能载体在制备治疗或预防口腔癌的化疗药物或基因治疗药物中的应用，其步骤是：

[0134] 1.用含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管收集外周血样品，将其转移至离心管中，在3或4或5℃条件下用1800或1900或2000或2100或2200g离心18或19或20或21或22min，取上清，再次在3或4或5℃条件下用1800或1900或2000或2100或2200g离心18或19或20或21或22min，获取上清，然后在3或4或5℃条件下继续48000或49000或50000或51000或52000g离心60min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得血液来源微粒。

[0135] 2.将20μg(50μL)血液来源微粒、50μL超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)(1mg/mL)、FAM标记的针对survivin的抗肿瘤siRNA(siRNAFAM)(500nm)和150μL电穿孔缓冲液加入到电击杯中并混匀。设置电穿孔参数：输出脉冲电压250V，电容250μF，单次脉冲。将电击杯置于电穿孔仪上，按上述参数进行电穿孔。待电穿孔结束后，将混合液室温放置30min。最后，将混合液在3～5℃条件下利用蔗糖密度梯度离心方法去除混合液中游离的量子点和siRNA，用无菌PBS重悬沉淀，获取超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记并且载有靶向Survivin分子的抗肿瘤siRNA的血液源性微粒。该修饰后的血液源性微粒可以实现荷载siRNA的肿瘤靶向递送，并且具备荧光及核磁双相示踪能力。

[0136] 3.将步骤2中制备的多功能载体进行荧光显微镜观察和流式细胞学检测，证实了Mn-NIR-QDs和siRNA的双重标记效率约72.2％。(图12)

[0137] 4.将步骤2中制备的多功能载体与口腔鳞状细胞癌细胞CAL27共培养，孵育24h后，对细胞中Survivin的基因和蛋白表达进行分析，证实了二者的表达水平显著下调。MTT实验和EdU核素参入实验均证实上述制备的多功能载体可明显降低肿瘤细胞的增殖活性。(图13)

[0138] 5.将上述制备的多功能载体和游离的靶向Survivin的抗肿瘤siRNA分别经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内，结果发现上述多功能载体显著抑制肿瘤生长，而对裸鼠的体重无明显影响，提示其具备优异的抗肿瘤效应且生物毒性较低。进一步对分离的肿瘤组织做组织学分析后发现，上述制备的多功能载体明显抑制肿瘤组织中Survivin的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，而游离的siRNA未见显著的上述效应。(图14)

[0139] 实施例4：

[0140] 一种基于体液中细胞源性囊泡，超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的，并且载有化疗药物的多功能载体在制备治疗或预防口腔癌的化疗药物或基因治疗药物中的应用，其步骤是：

[0141] 1.用含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管收集外周血样品，将其转移至离心管中，在3或4或5℃条件下用1800或1900或2000或2100或2200g离心18或19或20或21或22min，取上清，再次在3或4或5℃条件下用1800或1900或2000或2100或2200g离心18或19或20或21或22min，获取上清，然后在3或4或5℃条件下继续48000或49000或50000或51000或52000g离心60min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得血液来源微粒。

[0142] 2.将20μg(50μL)血液来源微粒、50μL超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)(1mg/mL)、化疗药物阿霉素(Doxorubicin，DOX)和150μL电穿孔缓冲液加入到电击杯中并混匀。设置电穿孔参数：输出脉冲电压250V，电容250μF，单次脉冲。将电击杯置于电穿孔仪上，按上述参数进行电穿孔。待电穿孔结束后，将混合液室温放置30min。最后，将混合液在3～5℃条件下利用蔗糖密度梯度离心方法去除混合液中游离的量子点和siRNA，用无菌PBS重悬沉淀，获取超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记且载有化疗药物DOX的血液来源微粒，该修饰后的血液源性微粒可以实现荷载DOX的肿瘤靶向递送，并且具备荧光及核磁双相示踪能力。

[0143] 3.将步骤2中制备的多功能载体进行荧光显微镜观察和流式细胞学检测，观察Mn-NIR-QDs和DOX的双重标记效率。

[0144] 4.将步骤2中制备的多功能载体与口腔鳞状细胞癌细胞CAL27共培养，孵育24h后，MTT实验和EdU核素参入实验均证实上述制备的多功能载体可明显降低肿瘤细胞的增殖活性。

[0145] 5.将上述制备的多功能载体经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内，结果发现注射后，上述多功能载体明显富集于肿瘤组织中并且在48h内富集总量随时间延长而增加。这些结果证实上述制备的多功能载体具有良好的肿瘤靶向性，为其应用于肿瘤治疗奠定了基础。

[0146] 6.将上述制备的多功能载体和游离的DOX分别经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内，结果发现上述多功能载体显著抑制肿瘤生长，而对裸鼠的体重无明显影响，提示其具备优异的抗肿瘤效应且生物毒性较低。进一步对分离的肿瘤组织做组织学分析后发现，上述制备的多功能载体明显抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，而游离的DOX未见显著的上述效应。

[0147] 实施例5：

[0148] 一种基于体液中细胞源性囊泡，超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的，并且载有基因治疗片段(survivin-siRNA)和化疗药物的多功能载体在制备治疗或预防口腔癌的基因治疗药物和化疗药物中的应用，其步骤是：

[0149] 1.收集口腔癌患者的体液样品(外周血或唾液)，将其转移至离心管中，在3～5℃条件下经1800～2200g离心18-22min后，取上清，重复上述条件离心，获取上清，然后在3～5℃条件下继续48000～52000g离心60min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬后冻存于-80℃，获得体液中细胞源性微粒；收集5mL循环血或唾液，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，取上清，然后在3-5℃条件下继续12000～16500g离心20～
40min，取上清，然后在3-5℃条件下继续100000～120000g离心60～70min将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性外泌体；收集5mL循环血或唾液，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，取上清，再次在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，获取上清，然后在3-5℃条件下继续100000～
120000g离心60～70min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性膜性囊泡(包括体液源性微粒和体液源性外泌体)。

[0150] 2.将20μg(50μL)体液来源细胞源性膜性囊泡、50μL超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)(1mg/mL)、FAM标记的靶向Survivin分子的抗肿瘤siRNA(siRNAFAM)(500nm)、化疗药物阿霉素(Doxorubicin，DOX)和150μL电穿孔缓冲液加入到电击杯中并混匀。设置电穿孔参数：输出脉冲电压250V，电容250μF，单次脉冲。将电击杯置于电穿孔仪上，按上述参数进行电穿孔实验。待电穿孔结束后，将混合液室温放置30min。最后，将混合液在3～5℃条件下利用蔗糖密度梯度离心方法去除混合液中游离的量子点和化疗药物DOX，用无菌PBS重悬沉淀，获取超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记并且载有靶向Survivin分子的抗肿瘤siRNA和化疗药物DOX的体液来源细胞源性膜性囊泡。

[0151] 3.将步骤2中制备的多功能载体进行荧光显微镜观察和流式细胞学检测，观察Mn-NIR-QDs、siRNA和DOX的标记效率。

[0152] 4.将步骤2中制备的多功能载体与口腔鳞状细胞癌细胞CAL27共培养，孵育24h后，MTT实验和EdU核素参入实验均证实上述制备的多功能载体可明显降低肿瘤细胞的增殖活性。

[0153] 5.将上述制备的多功能载体经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内，结果发现上述多功能载体明显富集于肿瘤组织中并且在48h内富集总量随时间延长而增加。这些结果证实上述制备的多功能载体具有良好的肿瘤靶向性，为其应用于肿瘤治疗奠定了基础。

[0154] 6.将上述制备的多功能载体和游离的siRNA或DOX分别经尾静脉注射到口腔癌裸鼠移植瘤模型体内，结果发现上述多功能载体显著抑制肿瘤生长，而对裸鼠的体重无明显影响，提示其具备优异的抗肿瘤效应且生物毒性较低。进一步对分离的肿瘤组织做组织学分析后发现，上述制备的多功能载体明显抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，而游离的siRNA或DOX未见显著的上述效应。

[0155] 实施例6：

[0156] 一种基于体液中细胞源性囊泡(唾液来源微粒)，超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的多功能载体在制备治疗或预防口腔癌的化疗药物或基因治疗药物中的应用，其步骤是：

[0157] 1.收集口腔癌患者晨起未进食前的唾液样品，将其转移至离心管中，在3或4或5℃条件下用1800或1900或2000或2100或2200g离心18或19或20或21或22min，取上清，再次在3或4或5℃条件下用1800或1900或2000或2100或2200g离心18或19或20或21或22min，获取上清，然后在3或4或5℃条件下继续48000或49000或50000或51000或52000g离心60min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得唾液来源微粒。

[0158] 2.将20μg(50μL)唾液来源微粒、50μL超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)(1mg/mL)和150μL电穿孔缓冲液加入到电击杯中并混匀。设置电穿孔参数：输出脉冲电压250V，电容250μF，单次脉冲。将电击杯置于电穿孔仪，按上述参数进行电穿孔。待电穿孔结束后，将混合液室温放置30min。最后，将混合液在3～5℃条件下利用蔗糖密度梯度离心去除混合液中游离的量子点，用无菌PBS重悬沉淀，获取超小锰磁性近红外量子点(Mn-NIR-QDs)标记的唾液来源微粒。

[0159] 3.将步骤2中制备的多功能载体进行透射电镜和CFSE染色标记后的荧光显微镜观察，流式细胞术检测发现该多功能载体中Mn-NIR-QDs的载入效率约88.1％。(图15)[0160] 4.将步骤2中制备的多功能载体注射到裸鼠舌内，结果发现在裸鼠舌内可见强烈的荧光信号，并且持续观察24h过程中，上述荧光信号未见明显衰减。这些结果证实上述制备的基于唾液来源的多功能载体具备良好的活体稳定性，并且Mn-NIR-QDs所修饰的荧光成像能力稳定持久。(图16)