球松素在防治骨质疏松中的应用

摘要

本发明提供了球松素在制备防治骨质疏松的药物中的应用。球松素具有促进成骨细胞前体细胞增殖活性、提高碱性磷酸酶活性和I型胶原蛋白含量、促进成骨细胞矿化，以及促进成骨细胞前体细胞骨钙素基因表达的作用，对成骨细胞前体细胞的增殖和分化具有良好的促进作用,并对糖皮质激素抑制的成骨细胞前体细胞的增殖和分化具有保护作用。通过上述作用方式从而发挥治疗骨质疏松的作用,以球松素为基础通过与药用辅料复配为防治骨质疏松的药物,对于骨质疏松的防治具有重要意义。

权利要求

1.球松素在制备防治骨质疏松的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的球松素在制备防治骨质疏松的药物中的应用,其特征在于:所述药物为促进成骨细胞增殖和分化的防治骨质疏松的药物。

3.如权利要求1所述的球松素在制备防治骨质疏松的药物中的应用,其特征在于:所述药物为具有提高成骨细胞增殖活性及碱性磷酸酶(ALP)活性、提高I型胶原蛋白(Colla gen I) 含量、促进成骨细胞矿化及骨钙素(osteocalcin)基因表达的防治骨质疏松的药物。

4.如权利要求1所述的球松素在制备防治骨质疏松的药物中的应用,其特征在于:球松素对糖皮质激素抑制的成骨细胞前体细胞的增殖和分化具有保护作用。

说明书

球松素在防治骨质疏松中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，涉及球松素在治疗骨质疏松中的应用

背景技术

[0002] 骨质疏松(osteoporosis，OP)是以成骨不足、骨量减少、骨微结构破坏为特征，致使骨的脆性增加和易于发生骨折的一种全身代谢性骨病，严重威胁老年人和更年期综合症的人群，尤其是绝经后妇女的身心健康。

[0003] 现代医学将骨质疏松分为原发性和继发性两大类，前者主要包括绝经后骨质疏松(PMO)和老年性骨质疏松，后者主要是由于药物治疗或一些疾病引起的并发症，糖皮质激素性骨质疏松(GIOP)是其中最常见的一种。随着临床上糖皮质激素的广泛应用,其所致骨质疏松的发病率呈上升趋势。

[0004] 目前临床上使用的治疗OP的药物主要包含三类，第一类为抑制骨吸收药物，如双膦酸盐类，降钙素类，选择性雌激素受体调节剂和雌激素等。第二类为促进骨形成药物，主要包括氟化物、雄激素、甲状旁腺激素和细胞调控因子等。第三类主要为促进骨矿化药物，如钙剂和活性维生素D，是防治骨质疏松症的基础用药。目前临床上治疗骨质疏松的药物疗效都不甚理想，容易产生药物依赖、或有一定副作用或引发其它疾病，有必要开发新型疗效好、副作用小、安全性高的治疗骨质疏松症的药物。近年来，发掘对骨质疏松具有预防和治疗作用的天然产物，受到广泛关注。

[0005] 球松素(pinostrobin,PI)，5-hydroxy-7-methoxy-flavanone，是一种双氢黄酮类化合物，又名乔松酮或基黄烷酮，其化学名是5’-羟基-7-甲氧基-2-苯基色满-4-酮，英文名称：pinostrobin，CAS号：480-37-5，分子式为C16H14O4，分子量为270.28，球松素的化学结构式见附图1。球松素外观呈白色晶体，熔点100℃，不溶于水，可溶于甲醇等有机溶剂。球松素的植物来源有木豆(Cajanμs cajan L.Millsp.)、乔松(Pinμs strobμs L.)、山核桃(Carya cathayensis Sarg)、山橿(Lindera reflexa Hemsl)、镰形棘豆(Oxytropis falcata bμnge)等。球松素具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗溃疡、抗菌、抗阿尔茨海默病、抗疟、止痛、抗癌等多种生物活性(Neeraj K.Patel,Gaurav Jaiswal,Kamlesh K.Bhutani.A review on biological sources,chemistry  and  pharmacological activities of pinostrobin.Natural Product Research,2016,30(18):2017–2027)。目前国内外尚未见文献公开其在制备预防或治疗抗骨质疏松药物中的应用。

发明内容

[0006] 本发明解决的问题在于提供球松素(PI)防治骨质疏松的应用，PI可应用于防治骨质疏松的药物的制备

[0007] 本发明是通过以下技术方案来实现:

[0008] 1球松素在防治骨质疏松中的应用

[0009] 2球松素在防治骨质疏松药物的制备中的应用。

[0010] 3球松素在对成骨细胞前体细胞增殖具有促进作用的药物制备中的应用。

[0011] 4球松素在对成骨细胞前体细胞分化和矿化具有促进作用的药物制备中的应用。

[0012] 5如权利要求4所述的应用,其特征在于,球松素在对提高成骨细胞前体细胞MC3T3-E1碱性磷酸酶(ALP)活性、I型胶原蛋白(Collagen I,Col I)含量，以及对细胞矿化作用具有促进作用的药物制备中的应用。

[0013] 6如权利要求4所述的应用,其特征在于球松素在对成骨细胞前体细胞MC3T3-E1骨钙素(osteocalcin，OCN)基因表达具有促进作用的药物制备中的应用。

[0014] 7球松素在对糖皮质激素抑制的成骨细胞前体细胞MC3T3-E1增殖和分化具有保护作用的药物制备中的应用。

[0015] 本发明的优点:

[0016] 明确了球松素具有促进成骨细胞前体细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化的作用,以及球松素对糖皮质激素抑制MC3T3-E1细胞增殖和分化作用的保护作用。球松素具有防治骨质疏松症药物的应用前景，以球松素为基础通过与药用辅料复配为防治骨质疏松的药物,对治疗该疾病提供了新思路，对骨质疏松病症的治疗具有重要意义。

附图说明

[0017] 图1为球松素的结构。

[0018] 图2为球松素对成骨细胞增殖作用的影响。

[0019] 图3为为球松素对成骨细胞分化作用的影响。

[0020] 图4为球松素对成骨细胞I型胶原蛋白含量的影响。

[0021] 图5为球松素对成骨细胞矿化作用影响。

[0022] 图6为球松素对成骨细胞钙化结节数影响。

[0023] 图7为球松素对成骨细胞OCN基因表达的影响。

[0024] 图8为地塞米松对成骨细胞增殖作用抑制浓度筛选。

[0025] 图9为球松素对地塞米松抑制MC3T3-E1细胞增殖作用的保护作用。

[0026] 图10为球松素对地塞米松抑制MC3T3-E1细胞分化作用的保护作用。

具体实施方式

[0027] 具体的，所述药物为促进成骨细胞分化的治疗骨质疏松的药物。通过细胞增殖率检测(MTT法)和碱性磷酸酶(ALP)活性检测，检查早期不同时间点内，不同浓度的球松素对MC3T3-El细胞增殖率和早期分化的影响。在证实球松素对MC3T3-El细胞早期分化的作用后，进一步通过Von-Kossa染色法证实球松素对成骨细胞的矿化作用，在一个实施方案中，从早期和晚期全面验证了球松素对成骨细胞前体细胞的促分化作用。

[0028] 1.球松素对MC3T3-E1增殖作用的研究

[0029] 小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-El细胞是从胚胎小鼠颅骨中分离的前成骨细胞，表现出高水平的成骨细胞分化能力。本实施例选取小鼠颅顶骨前成骨细胞系MC3T3-El，该细胞株来源于武汉大学细胞保藏中心，细胞药效研究取第2-5代细胞。

[0030] 取生长良好、处于对数生长期的MC3T3-E1细胞以2×105个/mL的密度接种于96孔板，加入含10％胎牛血清、l％的双抗的α-MEM细胞培养夜，置于37℃、5％CO2和饱合湿度的培养箱中培养24h后，弃掉培养液，分别加入含阳性对照17β-雌二醇(Estradiol，E2)(1×10-5μg/mL)和不同浓度球松素(5、10、20、40和80μg/mL)的培养液200μL，对照组为含0.05％DMSO的细胞培养液，同时设置空白对照组(未接种细胞，仅加入200μL的培养液)用于调零，各组均设个5个复孔。分别继续培养6h、12h和24h，取出培养板，每孔加入5mg/mL的MTT溶液
20μL,继续培养4h后终止孵育，吸出96孔内培养液,每孔加入200μL的DMSO振荡混匀15min,使结晶完全溶解，酶标仪上检测各孔570nm波长的吸光度(OD)。计算细胞增殖率：

[0031] 细胞增殖率/(％)＝(OD试验组-OD对照组)/OD对照组×100％

[0032] 结果如图2所示,5-80μg/mL球松素处理成骨细胞后6h、12h、24h后均能显著促进细胞增殖(p<0.05或p<0.01)，并且对细胞增值率的促进作用呈现剂量依赖和时间依赖效应。80μg/mL球松素作用细胞24h时对细胞增殖活性的促进作用最显著。阳性对照雌二醇(1×
10-5μg/mL)处理细胞后24h、48h、和72h也显著促进细胞的增殖(p<0.01)，而球松素(20-80μg/mL)处理细胞24h、48h和72h后，对细胞的增殖效果强于雌二醇。

[0033] 2球松素对MC3T3-E1细胞分化作用的影响

[0034] 细胞以2×105个/mL的密度铺于12孔细胞培养板中，24h贴壁生长后，弃掉培养液，分别加入不同浓度的球松素(5、10、20、40、80μg/mL)，E2(1×10-5μg/mL)，空白对照(0.05％DMSO的细胞培养液)，各组均设5个复孔，处理2d、4d和6d后，去除培养液，用预冷的PBS洗涤3次，每孔加入100μL细胞裂解液，裂解后于4℃、12000rpm、离心5min，收集清液，-20℃冻存，按BCA试剂盒(碧云天生物技术研究所)说明书测总蛋白浓度，碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)说明书步骤测ALP含量，最后计算相对ALP活性。

[0035] ALP是成骨细胞的标志性酶，是成骨细胞早期分化的指标，是骨形成的重要标志。如图3所示，不同浓度球松素(10、20、40μg/ml)分别处理成骨细胞2d、4d和6d后，处理组细胞ALP活性均显著高于对照组(p＜0.01)。E2处理后不同时间内细胞的ALP活性也高于对照组，因此，本实验结果表明球松素能够促进成骨细胞分化。

[0036] 3球松素对成骨细胞MC3T3-E1Ⅰ型胶原蛋白含量(COlⅠ)含量的影响

[0037] 细胞以2×105个/mL的密度接种于12孔板24h后，在10×倒置显微镜下进行观察细胞形态，细胞均匀铺满板底，每孔加入浓度为10、20、40μg/mL的球松素，同时设空白对照组与阳性对照组。收集加药后1d、3d、5d处理的成骨细胞，200μL生理盐水吹打细胞，使成骨细胞悬浮，超声波粉碎细胞，超声5s,间隙10s,重复3次，充分裂解细胞，3000rpm、离心5min；小心吸取上清液，转移至新的离心管中，-20℃冷冻保存备用。按胶原蛋白酶联免疫检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)说明操作，酶联免疫法测细胞COlⅠ含量，结果以ng/106细胞表示。

[0038] ColⅠ是成骨细胞向基质成熟方向分化的标志。在细胞外基质成熟期，COlⅠ继续合成并相互交联、成熟，构成钙盐沉着以及细胞附着的支架。由图4可知，与对照组相比，10-40μg/mL球松素处理后1d、3d和5d，成骨细胞一型胶原蛋白含量均显著提高，且存在剂量和时间效应。雌二醇处理也显著提高了胶原蛋白含量。40μg/mL球松素处理细胞5d后，细胞中胶原蛋白含量最高。

[0039] 4球松素对成骨细胞MC3T3-E1的矿化作用影响

[0040] 取对数生长期的MC3T3-E1细胞，待细胞密度长到细胞培养瓶底部约80％时，用0.25％胰蛋白酶消化，用5％α-MEM细胞维持液吹散细胞；以每孔约2×105个/mL的细胞密度接种于6孔细胞培养板中；在37℃恒温、5％CO2及饱和湿度条件下分别培养24h。细胞贴壁
24h后，设置空白对照组，E2阳性对照组，浓度为10-40μg/mL球松素组，同时换以含50μg/mL维生素C及10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的5％α-MEM含药维持液。在37℃恒温、5％CO2及饱和湿度条件下分别培养，2d换液1次，分别培养14、21、28d，每组设置3个重复。培养到所需天数后，细胞先用预冷的生理盐水洗两遍,加入适量的4％多聚甲醛4℃固定半小时；弃去多聚甲醛溶液后用冷生理盐水洗两遍，加入新鲜配制的5％硝酸银溶液后，置于紫外灯下照射1h；细胞用生理盐水洗2遍,加入5％Na2S2O3固定5min,生理盐水洗两遍，1％中性红染色5min；最后用生理盐水洗两遍后镜下观察并照相记录矿化结节形成情况。

[0041] 由图5可知，图5B、图5C呈现出比图5A更多的褐黑色沉淀，表明球松素(10μg/mL)和雌二醇处理的成骨细胞细胞基质矿化程度均比与对照组高。

[0042] 由图6可知，球松素(10-40μg/mL)与雌二醇处理后不同时间，成骨细胞MC 3T3-E1矿化结节数与空白对照组相比均有所增加。矿化结节数随球松素处理浓度的增加而增加，随处理时间的延长而增加，球松素处理对MC 3T3-E1细胞矿化结节数呈现浓度依赖和时间依赖效应，其中10μg/mL球松素处理后21d、28d，成骨细胞钙化结节数与对照相比差异显(p<0.05)，20μg/mL球松素处理后21d、28d以及40μg/mL球松素处理后14d、21d及28d，成骨细胞MC 3T3-E1钙化结节数与对照组相比均达极显著水平(p<0.01)。

[0043] 5、球松素对成骨细胞OCN表达的影响

[0044] 取生长良好、处于对数生长期的MC3T3-E1细胞以2×105个/mL接种于6孔板，加入含10％胎牛血清、l％的双抗的α-MEM细胞培养夜，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，弃掉培养液，分别加入含不同浓度球松素(10、20、40μg/mL)，E2(1×10-5μg/mL)的含药培养基，空白对照(0.05％DMSO的细胞培养液)，各组均设个复孔，培养4d后，Trizol法提取细胞总RNA，按RT-PCR试剂盒说明书(美国Promega公司)。

[0045] 根据GeneBank中登记的OCN基因(L24431.1)序列设计一对特异引物，可以扩增编码OC基因的159bP序列，引物设计如下:OCN(F:5'-TGGCTTCTCTCCCTACTCCA-3'；R:5'-GCAGCTGCAAAATCTCCTC-3'),根据GeneBank中登记的GAPDH基因(NM_008084.2)序列设计一对特异引物，扩增编码GAPDH基因的174bP序列，引物设计如下:GAPDH(F:5'-TCACCATCTTCCAGGAGCGA-3'；R:5'-CACAATGCCGAAGTGGTGGT-3')。OC基因的相对表达水平是以GAPDH基因作为内参，PCR反应条件为：95℃3min预变性，95℃30secs变性，58℃40secs退火，72℃延伸，共35个循环，通过2-△△Ct方法计算得到。

[0046] (1)反应体系：

[0047]

[0048] 将配制混合物充分混匀后平均分配至96孔PCR板中。创建反应管设置文件后,设置PCR热循环文件。然后启动程序：

[0049] (2)骨钙素基因OCN荧光定量PCR反应程序：

[0050]

[0051] 如图所示7，球松素浓度为10-40μg/mL处理成骨细胞MC 3T3-E1时，OCN基因的表达随着球松素浓度的升高而成上升趋势。10μg/mL球松素对成骨细胞OCN基因表达的促进作用不明显，而球松素(20μg/mL、40μg/mL)对OCN基因的表达具有显著促进作用(p<0.01)，球松素浓度为20μg/mL时，OCN基因的相对表达量为对照组的6.7倍；球松素浓度为40μg/mL时，OCN基因的相对表达量达到最大值，为空白对照组的8.3倍。

[0052] 6、球松素对地塞米松抑制MC3T3-E1细胞增殖作用的保护作用

[0053] (1)地塞米松(dexamethasone，DEX)抑制MC3T3-E1细胞增殖浓度的筛选：用含10％FBS的α-MEM培养液,调节MC3T3-E1细胞密度为2×105个/mL，接种于96孔板,每孔200μL，24h后细胞贴壁，更换培养液，随机分组处理，分别加入含不同浓度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5M)的地塞米松培养液200μL，对照组为含等浓度DMSO(0.5％)的细胞维持液，每组设6个平行孔，培养24h后，MTT法测定各组成骨细胞的增殖率，筛选出地塞米松对MC3T3-E1细胞增殖具有抑制作用的浓度。

[0054] 由图8可知，10-9～10-5M的地塞米松与成骨细胞MC3T3-E1作用24h后，与对照组相比，细胞的增殖率呈先增加后降低趋势。当地塞米松对成骨细胞作用24h，药物浓度为10-9M、-8 -710 M时，成骨细胞的增殖率分别为6.61±0.81％、8.47±1.42％，当地塞米松浓度为10 M、
10-6M、10-5M时，其对细胞的增殖呈现抑制作用，且地塞米松在10-6M时对成骨细胞的抑制效果较好，因而选择该浓度用于后续实验研究。

[0055] (2)球松素对地塞米松抑制成骨细胞增殖的保护作用

[0056] 将MC3T3-E1细胞以2×105个/mL接种于96孔板，以含10％FBS的α-MEM培养液在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养24h后，在10×倒置显微镜下进行观察细胞形态，细胞均匀铺满板底，设置对照组(5％FBS的α-MEM培养液培养)、激素组(以含10-6M地塞米松及5％FBS的α-MEM培养)、球松素组(分别为含10、20、40μg/mL球松素+10-6M地塞米松及5％FBS的α-MEM培养)，培养24h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，继续培养4h后终止孵育；吸出96孔内培养液,每孔加入200μL的DMSO振荡混匀15min,使结晶完全溶解；选择570nm为检测波长，在全自动酶标仪上测定各孔吸光值(OD值)，记录结果。

[0057] 由图9可知，不同处理对成骨细胞的增殖活性影响也不相同。与对照组相比，激素组与球松素组成骨细胞的增殖活性均低于对照组，表明激素(10-6M地塞米松)对成骨细胞的增殖具有抑制作用，而球松素组成骨细胞的增殖活性高于激素组，表明球松素对受激素抑制的成骨细胞的增殖作用具有改善作用。

[0058] (3)球松素对地塞米松抑制MC3T3-E1细胞分化作用的保护作用

[0059] 将MC3T3-E1细胞以2×105个/mL接种于96孔板，以含10％FBS的α-MEM培养液在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养24h后，弃除培养液，进行试验分组，设置对照组(5％FBS的α-MEM培养液培养)、激素组(以含10-6M地塞米松及5％FBS的α-MEM培养)、球松素组(分别以含10、20、40μg/mL球松素+10-6M地塞米松及5％FBS的α-MEM培养)，各实验组分别培养4d后，按前述方法测定细胞ALP活性。

[0060] 由图10可知，成骨细胞经不同处理后ALP活性各不不同。与对照组相比，激素组与球松素组成骨细胞ALP活性均低于与对照组，表明激素(10-6M地塞米松)对成骨细胞的分化具有抑制作用。而球松素组ALP活性高于激素组，表明球松素对受激素抑制的成骨细胞的分化作用具有保护作用。