一种酶响应型多功能纳米涂层的构建方法

摘要

本发明公开了一种酶响应型纳米涂层的构建方法，首先在多巴胺涂覆的不锈钢表面固定亲和素分子，其次，利用亲和素和生物素之间的特异性识别及结合作用，将生物素化肝素/PEI纳米颗粒固定至材料表面，并进一步用高浓度的亲和素分子与纳米颗粒涂层表面残余的生物素结合，进而引入新的生物素结合位点；然后，继续利用生物素与亲和素之间的相互作用，将生物素化的酶响应多肽组装至纳米颗粒表面，最后，通过EDC/NHS/MES偶联剂将SDF‑1α共价固定于多肽氨基末端，从而构建具有基质金属蛋白酶9响应特性的多功能纳米涂层。本发明在钛表面构建具有抗凝和诱导内皮再生能力的多功能层，显著改善了材料的血液相容性和损伤内皮修复能力。

权利要求

1.一种酶响应型多功能纳米涂层的构建方法，其特征在于包括以下步骤：A） 316L不锈钢表面经抛光和清洗处理后，浸入浓度为2 mg/ml的多巴胺溶液中反应12小时，双蒸水超声清洗后，重复上述步骤2次，获得沉积有3层聚多巴胺涂层的表面，37℃烘干；

B） 将A）步骤中沉积聚多巴胺涂层的样品浸泡于0.1 0.5 mg/ml的亲和素溶液中，在37~℃条件下静置反应8 24小时，然后用双蒸水清洗样品，保存待用；

~

C）将浓度为10 20 mg/ml的生物素化肝素钠溶液与浓度为1 2 mg/ml的聚乙烯亚胺溶~ ~液等体积共混，室温下超声处理5分钟，得纳米颗粒悬液；

将B）步骤中获得的样品浸没于纳米颗粒悬液中，37℃条件下振荡反应8 24小时，然后~用双蒸水漂洗样品，保存待用；

 D）将C）步骤中获得的样品浸没入1 3 mg/ml的亲和素溶液中，37℃条件下反应1 3小~ ~时；合成生物素化的酶响应型多肽，其结构为Biotin-PRQITAG-NH2；

将上述样品浸泡在10 50 μg/ml的多肽溶液中，37℃条件下反应1 3小时后，用双蒸水~ ~漂洗样品，保存待用；

E） 向浓度为100 500 ng/ml的SDF-1α溶液中滴加摩尔比为2:1:1的EDC/NHS/MES交联~剂溶液，混合均匀后立即将D）步骤中获得的样品浸泡其中，37℃条件下反应1 3小时后，用~双蒸水清洗样品，即得。

2.根据权利要求1所述的一种酶响应型多功能纳米涂层的构建方法，其特征在于：所述B）、C）、D）、E）步骤中的生物分子溶液，其溶剂均为磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1所述的一种酶响应型多功能纳米涂层的构建方法，其特征在于：所述B）、C）、D）、E）步骤中，样品均在表面湿润条件下，在4℃的温度进行冷藏保存。

4.根据权利要求1所述的一种酶响应型多功能纳米涂层的构建方法，其特征在于：所述C）步骤中，聚乙烯亚胺的分子量在60 75 kDa的范围内。

~

5.根据权利要求1所述的一种酶响应型多功能纳米涂层的构建方法，其特征在于：所述E）步骤中，MES为0.05mol。

6.根据权利要求1所述的一种酶响应型多功能纳米涂层的构建方法，其特征在于：所述E）步骤中，EDC/NHS/MES交联剂溶液中，VSDF-1/V交联剂=10/1。

说明书

一种酶响应型多功能纳米涂层的构建方法

所属技术领域

[0001] 本发明涉及无机材料表面改性技术的技术领域，特别涉及一种酶响应型多功能纳米涂层的构建方法。

背景技术

[0002] 冠心病等心血管疾病严重威胁着人类的生命健康。目前，临床上主要通过金属血管支架介入治疗来改善冠心病患者的血运情况。然而，传统的金属裸支架和药物洗脱支架由于生物相容性不足，在植入后往往会引起中晚期血栓形成和血管内膜增生，进而导致植入失效，甚至危及患者生命安全。

[0003] 通过对材料表面进行生物化改性，赋予材料良好的抗凝血能力和诱导内皮再生能力是目前常用的提高材料生物相容性的方法。然而，在体内复杂环境下，很多生物涂层难以保持长期的功能，而是在体内动态环境下快速失去其生物学活性。为了实现生物修饰层长期有效的发挥其功能，需要针对其所处的生物学环境进行特定的设计。

[0004] 肝素是一种临床上广泛使用的抗凝药物，也是心血管材料表面改性所常用的物质。但由于肝素分子缺乏和材料表面直接反应的位点，因此本发明首先在材料表面引入亲和素分子，然后对肝素分子进行生物素化修饰，利用生物素和亲和素之间的特异性结合作用，将肝素分子引入材料表面。为了提高表面肝素的负载量，本发明还引入了一种富含氨基的聚阳离子电解质聚乙烯亚胺，利用生物素化的肝素能与聚乙烯亚胺发生静电交互作用形成纳米颗粒的特性，将纳米颗粒固定到材料表面。

[0005] 间质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）是一种对骨髓CXCR4+干细胞及内皮祖细胞（EPCs）具有强烈趋化作用的趋化因子，同时也具有刺激内皮细胞生长，诱导内皮祖细胞向内皮细胞分化的功能。研究表明，SDF-1α能通过诱导内皮祖细胞向血管损伤位点处聚集和分化，加速血管损伤修复和内皮再生。

[0006] PRQITAG多肽是一种对基质金属蛋白酶9（MMP-9）具有特殊响应性的多肽，可在MMP-9存在的条件下发生分解。而MMP-9是血管损伤修复过程中一种重要的功能蛋白，它能快速降解血管基底膜和细胞外基质成分，使其释放多种蛋白质和生长因子，刺激血管细胞的迁移和增殖。因此，MMP-9也可看成是血管损伤修复的信号蛋白。利用这一特点，本发明将具有MMP-9响应特性的PRQITAG多肽作为一种连接分子，将其一端固定在纳米颗粒涂层表面，另一端则连接趋化因子SDF-1α。其目的在于当血管组织受损大量分泌MMP-9时，将诱导材料表面释放SDF-1α分子，加速血管损伤的修复。

[0007] 这种具有酶响应特性的生物功能层不仅能改善材料表面的血液相容性，同时还可根据血管内环境变化，实现生物分子的按需释放，有效提高了生物分子的利用率和作用时间，促进血管损伤修复。而目前尚无将该种酶响应型纳米涂层心血管材料表面改性的相关报道。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供一种酶响应型多功能纳米涂层的构建方法，通过该方法对心血管材料表面进行生物化改性可实现生物因子的按需释放，有效提高材料的生物相容性和促进损伤修复能力；创造性的选择出多功能层的构建方式，并在一定的生物分子浓度比例下，利用各类生物分子间的特异性相互作用，实现功能性生物分子在材料表面的有序组装，进而达到在特定生物环境中，材料表面生物分子按需释放，表面生物功能持续稳定发挥的特性；生物微环境的构建工艺及固定方法均简单易操作，无需昂贵复杂的设备，工艺成本较低，可控制性强，效果显著；不锈钢表面各种生物分子的固定均采用浸泡方式进行，可保证材料各个部分能均匀的固定上生物分子，有利于实现各种结构复杂的心血管植入器械表面的功能化修饰，适用范围广。

[0009] 本发明实现以上目的采用的技术方案是，一种酶响应型多功能纳米涂层的构建方法，其步骤包含：

[0010] A）316L不锈钢表面经抛光和清洗处理后，浸入浓度为2 mg/ml的多巴胺溶液中反应12小时，双蒸水超声清洗后，重复上述步骤2次，获得沉积有3层聚多巴胺涂层的表面，37℃烘干；

[0011] B）将A）步骤中沉积聚多巴胺涂层的样品浸泡于0.1 0.5 mg/ml的亲和素溶液中，~在37℃条件下静置反应8 24小时，然后用双蒸水清洗样品，保存待用；
~

[0012] C）将浓度为10 20 mg/ml的生物素化肝素钠溶液与浓度为1 2 mg/ml的聚乙烯亚~ ~胺溶液等体积共混，室温下超声处理5分钟，得纳米颗粒悬液。将B步骤中获得的样品浸没于纳米颗粒悬液中，37℃条件下振荡反应8 24小时，然后用双蒸水漂洗样品，保存待用；
~

[0013] D）将C）步骤中获得的样品浸没入1 3 mg/ml的亲和素溶液中，37℃条件下反应1 3~ ~小时；合成生物素化的酶响应型多肽，其结构为Biotin-PRQITAG-NH2。将上述样品浸泡在10
50μg/ml的多肽溶液中，37℃条件下反应1 3小时后，用双蒸水漂洗样品，保存待用；
~ ~

[0014] E）向浓度为100 500 ng/ml的SDF-1α溶液中滴加摩尔比为2:1:1的EDC/NHS/MES交~联剂溶液，混合均匀后立即将D）步骤中获得的样品浸泡其中，37℃条件下反应1 3小时后，~
用双蒸水清洗样品，即得。

[0015] 本发明进一步改进方案是，所述B）、C）、D）、E）步骤中的生物分子溶液，其溶剂均为磷酸盐缓冲液。

[0016] 本发明更进一步改进方案是，所述B）、C）、D）、E）步骤中，样品均在表面湿润条件下，在4℃的温度进行冷藏保存。

[0017] 本发明更进一步改进方案是，所述步骤C）中，聚乙烯亚胺的分子量在60 75kDa的~范围内。

[0018] 本发明更进一步改进方案是，所述步骤E）中，MES为0.05mol。

[0019] 本发明更进一步改进方案是，所述步骤E）中，EDC/NHS/MES交联剂溶液中，[0020] VSDF-1/V交联剂=10/1。

[0021] 参见说明书附图1，本发明的反应过程分包含以下步骤，第一步为不锈钢表面接枝亲和素。首先通过在316L不锈钢表面沉积聚多巴胺涂层，利用多巴胺表面的醌基能与亲和素分子中的氨基发生希夫碱反应的特性，将亲和素固定在材料表面；第二步，利用分子间静电交互作用，合成生物素化肝素/聚乙烯亚胺纳米颗粒；第三步，利用纳米颗粒表面生物素分子能与材料表面亲和素分子特异性识别并结合的特性，将纳米颗粒固定至材料表面；第四步，使用高浓度的亲和素分子来结合纳米涂层表面剩余的生物素分子，同时引入亲和素结合位点；第五步，合成生物素化的基质金属蛋白酶9响应型多肽，利用生物素分子与材料表面亲和素结合位点的特异性识别功能，将多肽固定至材料表面；第六步，使用EDC/NHS/MES交联剂活化SDF-1α分子中的羧基，并与材料表面多肽分子末端的氨基发生脱水缩合反应，从而将SDF-1α固定于材料表面。

[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0023] 第一、酶响应型多功能纳米涂层的构建方法，创造性的选择出多功能层的构建方式，并在一定的生物分子浓度比例下，利用各类生物分子间的特异性相互作用，实现功能性生物分子在材料表面的有序组装，进而达到在特定生物环境中，材料表面生物分子按需释放，表面生物功能持续稳定发挥的特性。

[0024] 第二、酶响应型多功能纳米涂层的构建方法，生物微环境的构建工艺及固定方法均简单易操作，无需昂贵复杂的设备，工艺成本较低，可控制性强，效果显著。

[0025] 第三、酶响应型多功能纳米涂层的构建方法，不锈钢表面各种生物分子的固定均采用浸泡方式进行，可保证材料各个部分能均匀的固定上生物分子，有利于实现各种结构复杂的心血管植入器械表面的功能化修饰，适用范围广。

附图说明

[0026] 下面结合附图和实施例对本发明的方法作进一步详细的说明。

[0027] 图1为本发明方法中基质金属蛋白酶9响应型纳米涂层构建的各步骤示意图。（1）316L不锈钢表面多巴胺涂层的沉积和亲和素的组装；（2）生物素化肝素/聚乙烯亚胺纳米颗粒的制备；（3）纳米颗粒在材料表面的固定；（4）纳米颗粒涂层表面组装亲和素分子；（5）生物素化酶响应型多肽在材料表面的组装；（6）SDF-1α在材料表面的固定。

[0028] 图2为模拟体内流场条件下，MMP9对SDF-1释放动力学的影响结果。

[0029] 图3为不同样品表面血小板粘附2小时后的荧光染色结果。

[0030] 图4为趋化小室模型中，MMP9存在条件下，酶响应型纳米涂层诱导内皮祖细胞归巢的结果。多巴胺涂层样品为空白对照。

具体实施方式

[0031] 实施例一

[0032] 参见图1，本发明的第一种具体实施方式是，一种酶响应型纳米涂层的构建方法，其步骤为：

[0033] A）316L不锈钢表面经抛光和清洗处理后，浸入浓度为2 mg/ml的多巴胺溶液中反应12小时，双蒸水超声清洗后，重复上述步骤2次，获得沉积有3层聚多巴胺涂层的表面，37℃烘干；

[0034] B）将A）步骤中沉积聚多巴胺涂层的样品浸泡于0.1 mg/ml的亲和素溶液中，在37℃条件下静置反应8小时，然后用双蒸水清洗样品，保存待用；

[0035] C）将浓度为10 mg/ml的生物素化肝素钠溶液与浓度为1 mg/ml的聚乙烯亚胺溶液等体积共混，室温下超声处理5分钟，得纳米颗粒悬液。将B步骤中获得的样品浸没于纳米颗粒悬液中，37℃条件下振荡反应8小时，然后用双蒸水漂洗样品，保存待用；

[0036] D）将C）步骤中获得的样品浸没入1 mg/ml的亲和素溶液中，37℃条件下反应1小时；合成生物素化的酶响应型多肽，其结构为Biotin-PRQITAG-NH2。将上述样品浸泡在10μg/ml的多肽溶液中，37℃条件下反应1小时后，用双蒸水漂洗样品，保存待用；

[0037] E）向浓度为100 ng/ml的SDF-1α溶液中滴加摩尔比为2:1:1的EDC/NHS/MES交联剂溶液，混合均匀后立即将D）步骤中获得的样品浸泡其中，37℃条件下反应1小时后，用双蒸水清洗样品，即得。

[0038] 本发明更进一步改进方案是，所述步骤C）中，聚乙烯亚胺的分子量在60 75kDa的~范围内。

[0039] 本发明更进一步改进方案是，所述步骤E）中，MES为0.05mol。

[0040] 本发明更进一步改进方案是，所述步骤E）中，EDC/NHS/MES交联剂溶液中，[0041] VSDF-1/V交联剂=10/1。

[0042] 实施例二

[0043] 一种酶响应型纳米涂层的构建方法，其步骤为：

[0044] A）316L不锈钢表面经抛光和清洗处理后，浸入浓度为2 mg/ml的多巴胺溶液中反应12小时，双蒸水超声清洗后，重复上述步骤2次，获得沉积有3层聚多巴胺涂层的表面，37℃烘干；

[0045] B）将A）步骤中沉积聚多巴胺涂层的样品浸泡于0.5 mg/ml的亲和素溶液中，在37℃条件下静置反应8 24小时，然后用双蒸水清洗样品，保存待用；~

[0046] C）将浓度为20 mg/ml的生物素化肝素钠溶液与浓度为2 mg/ml的聚乙烯亚胺溶液等体积共混，室温下超声处理5分钟，得纳米颗粒悬液。将B步骤中获得的样品浸没于纳米颗粒悬液中，37℃条件下振荡反应24小时，然后用双蒸水漂洗样品，保存待用；

[0047] D）将C）步骤中获得的样品浸没入3 mg/ml的亲和素溶液中，37℃条件下反应3小时；合成生物素化的酶响应型多肽，其结构为Biotin-PRQITAG-NH2。将上述样品浸泡在50μg/ml的多肽溶液中，37℃条件下反应3小时后，用双蒸水漂洗样品，保存待用；

[0048] E）向浓度为500 ng/ml的SDF-1α溶液中滴加摩尔比为2:1:1的EDC/NHS/MES交联剂溶液，混合均匀后立即将D）步骤中获得的样品浸泡其中，37℃条件下反应3小时后，用双蒸水清洗样品，即得。

[0049] 本发明更进一步改进方案是，所述步骤C）中，聚乙烯亚胺的分子量在60 75kDa的~范围内。

[0050] 本发明更进一步改进方案是，所述步骤E）中，MES为0.05mol。

[0051] 本发明更进一步改进方案是，所述步骤E）中，EDC/NHS/MES交联剂溶液中，[0052] VSDF-1/V交联剂=10/1。

[0053] 实施例三

[0054] 一种酶响应型纳米涂层的构建方法，其步骤为：

[0055] A）316L不锈钢表面经抛光和清洗处理后，浸入浓度为2 mg/ml的多巴胺溶液中反应12小时，双蒸水超声清洗后，重复上述步骤2次，获得沉积有3层聚多巴胺涂层的表面，37℃烘干；

[0056] B）将A）步骤中沉积聚多巴胺涂层的样品浸泡于0.3 mg/ml的亲和素溶液中，在37℃条件下静置反应12小时，然后用双蒸水清洗样品，保存待用；

[0057] C）将浓度为15 mg/ml的生物素化肝素钠溶液与浓度为1.5 mg/ml的聚乙烯亚胺溶液等体积共混，室温下超声处理5分钟，得纳米颗粒悬液。将B步骤中获得的样品浸没于纳米颗粒悬液中，37℃条件下振荡反应12小时，然后用双蒸水漂洗样品，保存待用；

[0058] D）将C）步骤中获得的样品浸没入2 mg/ml的亲和素溶液中，37℃条件下反应2小时；合成生物素化的酶响应型多肽，其结构为Biotin-PRQITAG-NH2。将上述样品浸泡在30μg/ml的多肽溶液中，37℃条件下反应2小时后，用双蒸水漂洗样品，保存待用；

[0059] E）向浓度为300 ng/ml的SDF-1α溶液中滴加摩尔比为2:1:1的EDC/NHS/MES交联剂溶液，混合均匀后立即将D）步骤中获得的样品浸泡其中，37℃条件下反应2小时后，用双蒸水清洗样品，即得。

[0060] 本发明更进一步改进方案是，所述步骤C）中，聚乙烯亚胺的分子量在60 75kDa的~范围内。

[0061] 本发明更进一步改进方案是，所述步骤E）中，MES为0.05mol。

[0062] 本发明更进一步改进方案是，所述步骤E）中，EDC/NHS/MES交联剂溶液中，[0063] VSDF-1/V交联剂=10/1。

[0064] 实施例1相对于实施例3而言，在生物化学反应过程中，合理的缩短反应时间有利于保持生物分子的生物活性，从而更好的发挥其生物学功能；实施例2相对于实施例3而言，根据生物化学反应的机理，最大程度的提高了表面生物分子的装载密度，有利于表面功能更为长期有效的发挥。由此可知，通过实施例1和实施例2得到的纳米涂层的效果均要优于通过实施例3得到的纳米涂层。因此分析效果最差的通过实施例3得到的纳米涂层能够解决本申请所要解决的技术问题的话，那通过实施例1和实施例2也绝对能够解决本申请所要解决的技术问题。

[0065] 由图2可知，当材料所处环境中不含MMP9时，材料表面SDF-1的释放很快趋于平缓，表现出较好的稳定性，而当环境中含有MMP9时，可诱导表面纳米涂层的多肽降解，从而控制SDF-1的持续释放。因此，所构建的纳米涂层在体内血流环境中，能在血管损伤释放的信号酶MMP9的刺激下释放SDF-1，促进损伤愈合。

[0066] 由图3可知，所构建的纳米涂层能有效降低血小板的粘附和激活，从而避免表面发生凝血或血栓。

[0067] 由图4可知，构建的纳米涂层在无MMP9存在时，也具有一定的诱导内皮祖细胞归巢和聚集的效果，但并不明显；当有MMP9存在时，纳米涂层表现出显著的诱导内皮祖细胞聚集的效果，这有利于血管损伤后的快速愈合。