一种不含外源性添加剂的富血小板血浆制备方法

摘要

本发明涉及一种不含外源性添加剂的富血小板血浆制备方法。本发明所述的富血小板血浆制备方法包括以下步骤：样品准备：将静脉血全血加入已预冷的离心管中；第一次离心：对静脉血全血进行第一次离心，180g，10分钟；第二次离心：转移血浆层至新的离心管内，配平，进行第二次离心，1550g，10分钟；离心后弃去血浆上清液，保留占静脉血全血体积的1/10的血浆上清液，重悬血小板沉淀，即制备得到所述的富血小板血浆；其中，所有操作均在低温下进行。本发明使用物理的温度控制调节血液的抗凝及血小板激活，避免了抗凝剂及促凝剂的加入，避免因外源性物质加入导致的临床不良反应，保证了富血小板血浆临床使用的安全性。

权利要求

1.一种不含外源性添加剂的富血小板血浆制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A.样品准备：将静脉血全血加入已预冷的离心管中；

B.第一次离心：对静脉血全血进行第一次离心，180g，10分钟；离心后形成自上而下分为三层，上层为血浆层，中层为白膜层，下层为红细胞层；

上层为血浆，体积占管内离心全血体积1/3-2/3，内含大量血小板，中层为较薄的一层白膜层，含大量白细胞及部分血小板，下层为红细胞层，含大量红细胞；

C.第二次离心：转移血浆层至新的离心管内，配平，进行第二次离心，1550g，10分钟；离心后弃去血浆上清液，保留占静脉血全血体积的1/10的血浆上清液，重悬血小板沉淀，即制备得到所述的富血小板血浆；

其中，所述步骤A至C的所有操作均在4℃下进行。

说明书

一种不含外源性添加剂的富血小板血浆制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于血液制品技术领域，涉及一种不含外源性添加剂的富血小板血浆制备方法。

背景技术

[0002] 富含血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)特指含有4-5倍正常人体血小板浓度的自体血浆。血小板是巨核细胞的胞质片段，属于白细胞范畴，在骨髓中形成。它们缺乏细胞核，但是包含细胞器，还有线粒体，微管，以及α、δ、λ微粒这些结构。其中，α颗粒包含有多种生长因子，包括：血小板源性生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转换生长因子(TGF-β)等。PDGF能促进巨噬细胞活化和血管生成，促进成纤维细胞增殖活性和趋化作用，增加胶原蛋白的合成，促进骨细胞的增殖。FGF能促进细胞外基质的增生，增强成纤维细胞的增殖活性，刺激I型胶原合成和诱导骨基质沉淀。TGF-β有可能抑制破骨细胞的形成和骨吸收，从而有利于骨形成。IGF是成纤维细胞趋化剂并刺激胶原蛋白合成。另外它通过骨增殖和成骨分化促进骨形成。VEGF在血管的形成过程中扮演重要的信号蛋白角色。在体外，VEGF已被证实能刺激内皮细胞有丝分裂和细胞迁移，能扩张血管，增加微血管渗透性。EGF通过与表皮生长因子受体结合，引发某些基因的表达，最终促进DNA合成增加和细胞的增殖。由于PRP具有上述诸多的作用，故已被广泛应用于皮肤科、骨科、颌面外科和整形外科等诸多领域。

[0003] 目前，国内外关于PRP的制备方法及已上市的成商品化PRP提取装置众多，用不同的方法制备的PRP，所获取的血小板浓度和活性不一，但首先均需要进行血液抗凝处理。目前常用的获FDA及CFDA批临床提取PRP常用的抗凝剂为ACD-A(主要成分为枸橼酸钠)。此外，当PRP在体外应用或将PRP做止血剂或组织包埋的媒介时，都必须应用激活剂，即体外激活血小板。最常用的体外激活方法是添加10％氯化钙和凝血酶启动凝血过程，可以得到PRP凝胶和释放物，再经过快速离心后就可得到生长因子。

[0004] 虽然现有技术制备的PRP具有一定的临床应用价值，但是其存在的抗凝剂及促凝剂等外源性添加剂仍存在一定程度上的缺陷，如：1)枸橼酸钠会引起血小板聚集，同时在一定程度上会破坏血小板，从而影响血小板计数，无法准确获得具有临床意义上的PRP，高浓度枸橼酸钠可引起枸橼酸钠中毒反应，其与血液中的钙离子结合使血钙降低，从而表现出手足抽搐、出血倾向、血压下降、心率缓慢甚至心跳骤停；2)凝血酶不良反应，在体外凝血酶的浓度可影响细胞的增殖、组织因子及炎症因子的释放，高浓度时具有神经毒性，抑制细胞的增殖，甚至引起脑细胞死亡。

发明内容

[0005] 技术问题

[0006] 本发明的目的在于提供一种不含外源性添加剂的富血小板血浆制备方法，该方法通过单纯调控温度制备出高浓度的富血小板血浆，不需添加外源性抗凝剂或促凝剂，确保富血小板血浆临床使用的安全性及有效性。

[0007] 技术方案

[0008] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

[0009] 本发明所述的一种不含外源性添加剂的富血小板血浆制备方法包括以下步骤：A.样品准备：将静脉血全血加入已预冷的离心管中；B.第一次离心：对静脉血全血进行第一次离心，180g，10分钟；离心后形成自上而下分为三层，上层为血浆层，中层为白膜层，下层为红细胞层；C.第二次离心：转移血浆层至新的离心管内，配平，进行第二次离心，1550g，10分钟；离心后弃去血浆上清液，保留占静脉血全血体积的1/10的血浆上清液，重悬血小板沉淀，即制备得到所述的富血小板血浆；其中，所述步骤A至C的所有操作均在低温下进行。

[0010] 在第一次离心后，静脉血全血分为三层：上层为血浆，体积占管内离心全血体积1/3-2/3，内含大量血小板；中层为较薄的一层白膜层，含大量白细胞及部分血小板；下层为红细胞层，含大量红细胞。

[0011] 优选地，所述步骤A至C的所有操作均在4℃下进行，可取代添加抗凝剂的方法。

[0012] 为保证获得富血小板血浆(PRP)中血小板数量的准确性及稳定性，本发明所有操作均在低温下进行，例如使用Nalgene Labtop Cooler冷却仪器(美国Thermo Scientific公司)，所涉及到的操作仪器及耗材均需提前预冷处理，如离心机、试管及移液枪枪头等。

[0013] 制备PRP的全过程均严格要求无菌，所用的器械均需高温高压或气体消毒。

[0014] 本发明所述方法制备得到的PRP是一种温度调控富血小板血浆，称为temperature controlled platelet-rich plasma(t-PRP)。

[0015] 所有操作均在低温进行，所涉及到的操作仪器及耗材均需提前预冷处理目的是为保证抑制凝血酶活性，达到温度调控不添加抗凝剂而使血液仍保持液态，同时防止凝血酶激活血小板而造成在提取过程中生长因子的丢失。本发明经过创造性探索发现，在4℃低温下进行离心提取是获得t-PRP的最佳条件。

[0016] 第一次离心的目的是为了去除全血中的红细胞及白细胞，弃去下层红细胞层及中层白膜层即可达到这个目的。即第一次离心应尽可能使全血中的红细胞沉降至最下层，并且白细胞尽可能与上层血小板分离开，但同时需保证仅有部分或少量的血小板进入中下两层。本发明经过创造性探索发现，以180g，10分钟离心是第一次离心的最佳条件。

[0017] 第二次离心的目的是为了在尽可能不损伤或激活血小板的前提下，将血小板聚集于底层形成血小板沉淀，然后弃去上层多余的血浆可获得富血小板血浆，即t-PRP。本发明经过创造性探索发现，以1550g，10分钟离心是第二次离心的最佳条件。

[0018] 将上述的t-PRP转移至新的玻璃采血管中，置于37℃静置15-30分钟，就可以激活其中的血小板。在37℃复温的条件下，可取代添加促凝剂的方法。

[0019] 转移至玻璃采血管及37℃复温静置步骤目的是为了恢复原血液中凝血酶活性，使血浆纤维蛋白原转化为纤维蛋白，表现出成胶的改变。同时凝血酶及凝血反应过程能级联放大激活血小板从而使血小板释放其内在的生长因子。

[0020] 优选地，所述所有耗材(除最后激活血小板步骤使用玻璃表面采血管)均使用塑料表面无添加物质的耗材。

[0021] 技术效果

[0022] 与现有PRP提取技术及提取装置相比，本发明所诉的富血小板血浆制备方法具有以下有益效果：

[0023] (1)本发明单纯使用物理的温度控制调节血液的抗凝及血小板激活，避免了抗凝剂及促凝剂的加入，避免因外源性物质加入导致的临床不良反应，保证了富血小板血浆临床使用的安全性。

[0024] (2)现有方法在添加抗凝剂后血小板会出现凝聚情况，容易计数不准。血小板聚集后出现计数不准，在应用情况下无法准确注射所需一定量血小板量的PRP。本发明所述方法不需要添加抗凝剂，因此保证血小板计数的准确性，保证了富血小板血浆临床使用的有效性。

[0025] (3)本发明所述方法制备的t-PRP中，血小板浓度均值达1541±151×109/L，约为全血血小板浓度的6.41±0.32倍。而在本领域使用最为广泛的Landesberg二次离心法制备得到的PRP(后称传统PRP)制备获得的血小板浓度仅为891±239×109/L，为全血血小板浓度的4.21±0.81倍，因此，本发明所述方法制备的t-PRP的血小板数量显著高于传统PRP的血小板数量，两者具有统计学差异(p<0.01)。另一方面，本发明技术方法制备的t-PRP中血红蛋白浓度仅为0.31+0.09g/L,传统PRP中血红蛋白浓度为26.53±15.71g/L，两者具有统计学差异(p<0.001)。而我国威高公司的PRP制备系统制备的PRP中血小板浓度为819.47×9 9
10/L，韩国REV-MED公司的TriCell PRP Kit制备的PRP中血小板浓度为751.12×10/L，由以上数据证实，利用本发明制备的血小板浓度及纯度高，红细胞混杂少，优于目前Landesberg二次离心制备方法及国内外上市设备套装。

[0026] (4)由于白细胞和血小板的沉降系数较为接近，白细胞及血小板分布区域重合度高，即传统PRP方法的白膜层(本发明中认为可能是枸橼酸钠抗凝剂引发的血小板聚集所导致血小板密度增大)。为保证对血小板的有效回收，则必须同时回收大量白细胞。而目前研究表明，PRP中的白细胞会释放大量炎症因子，如IL‐1、IL‐8及TNF‐α等，而这些炎症因子可以引发局部的免疫反应，移植组织修复，从而提高副反应发生率，降低PRP的临床疗效。本发明技术方法制备的t-PRP中白细胞均值为0.98+0.12×109/L，在保证血小板回收率和富集度的同时，且大大提高白细胞清除率。

[0027] (5)本发明所述的PRP制备方法无需采用特别的仪器设备，制备成本低，用于临床治疗费用少，易于推广及应用。国内外上市的PRP设备，如我国威高公司的PRP制备系统的套装价格为3000元，韩国REV-MED公司的TriCell PRP套装价格为2000-3000元，美国的GenesisCS设备系统价格为1550美元。

附图说明

[0028] 图1是本发明所述的一种不含外源性添加剂的富血小板血浆制备方法的简要流程图。

[0029] 图2是传统方法与本发明所述方法提取富血小板血浆的结果对比图。

[0030] 图3是传统方法与本发明方法提取富血小板血浆血小板计数对比图。

具体实施方式

[0031] 下面结合附图和具体实施例进一步说明本方法。实施中所使用的耗材、设备等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的材料。

[0032] 制备的PRP最终要求临床级别可人体使用，以下全过程均严格要求无菌，所用的器械均需高温高压或气体消毒。

[0033] PRP制备实验对照例(常规二次离心法)

[0034] 主要仪器设备及耗材：Eppendorf Centrifuge 5810R离心机，Sysmex Xe-2100hematology analyzer全自动血细胞分析仪，Corning 15ml塑料离心管，BDK3EDTA抗凝管，7号采血针，60ml注射器，ACD-A抗凝剂，凝血酶。

[0035] 血液纳入标准：1)静脉血血细胞分析结果三系在正常范围内：PLT 100-300×109/L，HGB女性135-150g/L、男性140-155g/L，WBC 4-10×1012/L之间；2)自愿参加并签署知情同意书。排除标准：1)年龄>50岁；2)血糖、血脂异常；3)液系统疾病；4)传染性疾病；5)免疫系统性疾病；6)肝肾功能异常；7)进入研究前1个月全身性应用过糖皮质激素、疫抑制剂、非甾体类抗炎药、抗过敏药及避孕药者，8)月经期及妊娠期妇女。

[0036] (1)样品准备：采用60ml注射器，抽取3ml ACD-A抗凝剂，并更换7号采血针抽取人30ml新鲜静脉血(1:10)，轻柔震荡充分混匀，将采集的静脉血分别加入15ml塑料离心管中，每管共11ml抗凝血。

[0037] (2)第一次离心：将步骤装有全血的离心管经行第一次离心，，180g，10分钟。离心后形成自上而下分为3层的离心液，上层为血浆，体积占管内离心全血体积1/3-2/3，内含大量血小板，中层为较薄的一层白膜层，含大量白细胞及血小板，下层为红细胞层，含大量红细胞。

[0038] (3)第二次离心：吸取上述的血浆层，并置于新的15ml塑料离心管内。配平，进行第二次离心，1550g，10分钟。离心后形成血小板沉淀及血浆上清液。弃去多余的血浆上清液，保留1ml的血浆上清液重悬血小板沉淀，吹打混匀，所剩余的血浆上清液占抽取静脉血全血体积的1/10，即制备得到传统PRP。

[0039] (4)血小板数量检测，分别从步骤(1)(2)(3)中抽取全血、第一次离心后血浆及PRP各自加入K3EDTA抗凝管中，上下摇匀，室温震荡15分钟后通过全自动血细胞分析仪行血常规检测。

[0040] (5)激活血小板：吸取5U凝血酶(10ul/Unit)加入上述步骤(3)获得的PRP中，凝血酶激活纤维蛋白酶原及血小板，数分钟后即可观察PRP成凝胶状，静置15分钟凝胶开始收缩，可见有清亮的淡黄色血清析出，30分钟收缩过程停止达到稳定状态，析出的血清含大量生长因子，为富生长因子血浆(即激活的PRP)，浅黄色凝胶状物质为PRP凝胶。

[0041] t-PRP制备实施例(采用本发明提取技术)

[0042] 主要仪器设备及耗材：Eppendorf Centrifuge 5810R离心机，Sysmex Xe-2100hematology analyzer全自动血细胞分析仪，Corning 15ml塑料离心管，BD无添加玻璃采血管，BD K3EDTA抗凝管，7号采血针，60ml注射器。

[0043] 血液纳入标准：1)静脉血血细胞分析结果三系在正常范围内：PLT 100-300×109/L，HGB女性135-150g/L、男性140-155g/L，WBC 4-10×1012/L之间；2)自愿参加并签署知情同意书。排除标准：1)年龄>50岁；2)血糖、血脂异常；3)液系统疾病；4)传染性疾病；5)免疫系统性疾病；6)肝肾功能异常；7)进入研究前1个月全身性应用过糖皮质激素、疫抑制剂、非甾体类抗炎药、抗过敏药及避孕药者，8)月经期及妊娠期妇女。

[0044] (1)样品准备：采用60ml注射器，7号采血针抽取人30ml新鲜静脉血，将采集的静脉血分别加入已预冷的15ml塑料离心管中，每管10ml静脉血。

[0045] (2)第一次离心：将步骤装有全血的离心管经行第一次离心，离心机提前预冷并调节温度至4℃，离心180g，10分钟。离心后形成自上而下分为2层的离心液，上层为血浆，体积占管内离心全血体积1/3-2/3，内含大量血小板，中层为较薄的一层白膜层，含大量白细胞及少量血小板，下层为红细胞层，含大量红细胞。

[0046] (3)第二次离心：从离心机内将管取出置于冰盒中，使用提前预冷的移液枪头吸取上述的血浆层，并置于新的预冷的15ml塑料离心管内。配平，进行第二次离心，离心机提前预冷并调节温度至4℃，离心1550g，10分钟。离心后形成血小板沉淀及血浆上清液。弃去多余的血浆上清液，保留1ml的血浆上清液重悬血小板沉淀，所剩余的血浆上清液占抽取静脉血全血体积的1/10，即制备得到温度调控富血小板血浆(t-PRP)。

[0047] (4)血小板数量检测，分别从步骤(1)至(3)中抽取全血、第一次离心后血浆及t-PRP各自加入K3EDTA抗凝管中，上下摇匀，室温震荡15分钟后通过全自动血细胞分析仪行血常规检测。

[0048] (5)激活血小板：将上述的t-PRP转移至玻璃表面无添加采血管中，置于37℃静置15-30分钟，t-PRP凝固成胶后逐渐缓慢析出富含大量生长因子的血清，即激活的t-PRP(actived t-PRP)，成胶后的凝胶即为t-PRP胶(t-PRP gel)。

[0049] 结果如图2所示，t-PRP制备及激活过程与传统PRP对比，结果显示无论是在全血、血浆及富血小板血浆的获得，两者大体上观察无明显差别(箭头指示为t-PRP组)。

[0050] 结果如图3所示，将通过温度控制获得的t-PRP行血细胞分析仪检测，与传统PRP相比较，t-PRP中血小板的总量及浓度均高于传统PRP。

[0051] 在前面“发明内容”中提到的数据，需在这里补充：

[0052] 血小板、血红蛋白、白细胞数量均通过全自动血细胞分析仪(Sysmex Xe-2100)经行检测：

[0053] 1)t-PRP中血小板浓度为1541±151×109/L，约为全血血小板浓度的6.41±0.32倍；血红蛋白浓度为0.31+0.09g/L；白细胞数量为0.98+0.12×109/L。

[0054] 2)传统PRP中血小板浓度为891±239×109/L，为全血血小板浓度的4.21±0.81倍；血红蛋白浓度为26.53±15.71g/L；白细胞数量为21.03+0.12×109/L。

[0055] 综上，本发明在现有的PRP制备方法基础上，通过使用物理温度调控方式取代了传统的外源性抗凝及促凝物质的添获得的t-PRP，不仅降低了潜在的副反应结果，提高临床使用的安全性，同时所制备的t-PRP的血小板浓缩效果均优于传统的提取方法，红细胞及白细胞数量大幅度降低，因而具有较好的临床推广及应用价值。