本发明提供一种异硫氰酸荧光素功能化的能够负载葡萄糖氧化酶的聚多巴胺复合材料的制备方法，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下会产生葡萄糖酸，葡萄糖酸可以猝灭FITC，而其他糖类不影响荧光强度，通过荧光光谱法实现对葡萄糖浓度的检测。本发明解决了现有技术中对葡萄糖检测的操作要求高，检测过程复杂，检测成本高，检测时间长，背景干扰大等问题，本发明的方法成本低、操作简便、能够快速检测样品中葡萄糖含量。
1.一种异硫氰酸荧光素修饰的负载葡萄糖氧化酶的聚多巴胺复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：A、PDA-FITC复合材料的制备：在装有乙醇水溶液的烧杯中加入氨水，调节pH至8.4-
8.6，得混合溶液，然后加入多巴胺盐酸盐和异硫氰酸荧光素FITC，置于30℃水浴中搅拌28-
30h，得悬浮液，于悬浮液中加入HCl稀溶液，调节pH至4.8-5.0，再置于离心机中离心，得下层沉淀，将离心好的下层沉淀分散到蒸馏水中，即为PDA-FITC复合材料水溶液，其中，氨水与乙醇水溶液的体积比为1：(48-52)，多巴胺盐酸盐和异硫氰酸荧光素FITC的质量比为(50-200):(2.5-10)，多巴胺盐酸盐在乙醇水溶液中的固含量为(1.5-7)mg/mL，蒸馏水与乙醇水溶液的体积比为1：2；
B、PDA-FITC-GOx复合材料的制备：向步骤A制备的PDA-FITC复合材料水溶液中加入PBS缓冲液，葡萄糖氧化酶GOx和蒸馏水，恒温振荡反应24h，再加入HCl稀溶液调节pH至4.8-
5.0，将调好pH的悬浮液用离心机离心得下层沉淀，将离心好的下层沉淀再分散到蒸馏水中，加入NaOH稀溶液调节pH至7.3-7.5，即为PDA-FITC-GOx复合材料水溶液；其中，PDA-FITC复合材料水溶液、PBS缓冲液、步骤B中出现的全部蒸馏水的体积比为5:1:14，第一次蒸馏水与第二次蒸馏水的体积比为4:10，葡萄糖氧化酶GOx在PDA-FITC复合材料水溶液中的固含量为(0.5-2)mg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种异硫氰酸荧光素修饰的负载葡萄糖氧化酶的聚多巴胺复合材料的制备方法，其特征在于：所述乙醇水溶液的体积百分比浓度为25％-35％。
3.根据权利要求1所述的一种异硫氰酸荧光素修饰的负载葡萄糖氧化酶的聚多巴胺复合材料的制备方法，其特征在于：所述氨水的质量百分比浓度为28％，HCl稀溶液的浓度为
1mol/L，NaOH稀溶液的浓度为1mol/L。
4.根据权利要求1所述的一种异硫氰酸荧光素修饰的负载葡萄糖氧化酶的聚多巴胺复合材料的制备方法，其特征在于：所述PBS缓冲液的pH为6.3-6.6。
5.根据权利要求1所述的一种异硫氰酸荧光素修饰的负载葡萄糖氧化酶的聚多巴胺复合材料的制备方法，其特征在于：所述恒温为25℃。
6.采用权利要求1-5任意一项所述的制备方法得到的PDA-FITC-GOx复合材料。
7.权利要求6所述的PDA-FITC-GOx复合材料在检测葡萄糖浓度方面的应用。
8.根据权利要求7所述的PDA-FITC-GOx复合材料在检测葡萄糖浓度方面的应用，其特征在于，采用下述方法步骤：取一系列5ml具塞刻度比色管，分别向每支比色管中加入100μL上述制备的PDA-FITC-GOx复合材料水溶液，再分别向每支比色管中依次加入0-80μM不同浓度的葡萄糖溶液，每支比色管中加入蒸馏水稀释至1mL，恒温振荡反应1h后，置于荧光比色皿中用荧光光谱仪在激发波长470nm、发射波长523nm时测定荧光强度；以葡萄糖浓度为横坐标，反应液在523nm波长处的荧光强度值为纵坐标，在直角坐标系中作图，得到葡萄糖浓度与荧光强度之间的线性关系图，根据它们之间的这种线性关系以检测葡萄糖的浓度。
9.根据权利要求7所述的PDA-FITC-GOx复合材料在检测葡萄糖浓度方面的应用，其特征在于，所述步骤具体如下：A、PDA-FITC复合材料的制备：在30mL乙醇水溶液中加入0.6mL氨水调节pH至8.4-8.6，之后加入50～200mg多巴胺盐酸盐和2.5～10mg异硫氰酸荧光素FITC，再置于30℃水浴中搅拌30h后加入HCl稀溶液调节pH至5.0，将调好pH的悬浮液用离心机离心得下层沉淀，将离心好的下层沉淀再分散到60mL蒸馏水中，即得PDA-FITC复合材料水溶液；
B、PDA-FITC-GOx复合材料的制备：向5mL步骤A制备的PDA-FITC复合材料水溶液中加入
1mL pH为6.5的PBS缓冲液，5-40mg的葡萄糖氧化酶GOx和4mL蒸馏水，恒温振荡反应24h，加入HCl稀溶液调节pH至4.8-5.2，将调好pH的溶液用离心机离心得下层沉淀，将离心好的下层沉淀再分散到10mL蒸馏水中，加入NaOH稀溶液调节pH至7.4，即得PDA-FITC-GOx复合材料水溶液；
C、葡萄糖的检测：取11支5ml具塞刻度比色管，分别向每支比色管中加入100μL步骤B制备的PDA-FITC-GOx复合材料水溶液，再分别向每支比色管中依次加入0μL、5μL、10μL、15μL、
20μL、3μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL浓度为1×10-3M的葡萄糖溶液，每支比色管中加入蒸馏水稀释至1mL，恒温振荡反应1h后，置于荧光比色皿中用荧光光谱仪在激发波长470nm、发射波长523nm时测定荧光强度；以葡萄糖浓度为横坐标，反应液在523nm波长处的荧光强度值为纵坐标，在直角坐标系中作图，得到葡萄糖浓度与荧光强度之间的线性关系图，根据它们之间的这种线性关系以检测葡萄糖的浓度。
一种异硫氰酸荧光素修饰的负载葡萄糖氧化酶的聚多巴胺复
合材料的制备及应用
技术领域
[0001] 本发明属于葡萄糖检测技术领域，具体涉及一种异硫氰酸荧光素修饰的负载葡萄糖氧化酶的聚多巴胺复合材料的制备方法及应用。
背景技术
[0002] 临床上和家庭血糖检测仪中普遍采用的是血液直接检测，频繁的血液采集会给患者带来不适。尿糖检查是无创式糖尿病初筛最简单的方法，健康人尿液中几乎没有葡萄糖，只有当血糖浓度高于肾糖阈(8.88～9.99mmol/L)时，尿液中才会出现葡萄糖，且浓度与血糖浓度具有较好的相关性，但目前因筛查试纸受多种因素的影响,不能较准确的反应血糖浓度，因而其参考价值有限。已有研究证实，对于个体而言，人体餐前唾液、汗液等体液中的葡萄糖浓度也与血糖浓度具有良好的相关性，可用于间接反应血糖浓度，若能精确测量其中的葡萄糖含量，将在糖尿病早期筛查、血糖检测等领域具有巨大的应用价值，但由于其葡-2 -1萄糖浓度较低，一般为2×10 ～2.4×10 mmo/L)，尚无法用市售血糖检测仪器准确检测出来。
[0003] 在目前已经公布的葡萄糖含量检测相关专利中，主要为电化学方法(专利号：201310087177.5；专利号201310141232.4；专利号：201310290148.9；专利号
201310354574.4)。电化学检测灵敏度高，但是容易受到血氧以及血液中其他电活性物质的干扰，而且在检测过程中需要消耗一定的能量，电极的制备往往较为复杂。其他检测葡萄糖的方法如共振散射光谱法(专利号：200810073470.5)、近红外光谱法(专利号：
98100787.2)、化学发光法(专利号：200910236714.1；专利号：201210509888.2)、荧光光谱法(专利号：200680029822.6；专利号：201310250093.9)等都需凭借昂贵的专业仪器并且在专业技术人员的操作下才能完成对葡萄糖的检测。而葡萄糖快速测定的相关试剂盒(专利号：201210459910.7)、试纸(专利号：200410033020.5；专利号：201210579953.9)等因其构造复杂，制作过程繁琐，价格昂贵，在实际应用中也受到很大的限制。
[0004] 基于酶催化体系的比色检测法是近年来较热门的检测方法，它利用反应过程中体系颜色及色度的变化实现对目标物的检测，具有检出限低，灵敏度高的优点，但是常需要使用过氧化物酶(HRP)，而过氧化物酶价格较高、易失活、不易保存。因此，又有人提出基于模拟酶检测血清葡萄糖的方法。自中国科学院阎锡蕴课题组发现纳米材料四氧化三铁具有类过氧化物酶催化活性(Nature Nanotechnology，2007，2，577-583)以来，汪尔康等人利用该特性实现了对过氧化氢和葡萄糖的检测(Analytical Chemistry，2008，80，2250-2254)，氧化石墨烯也被发现具有类过氧化物酶活性，并已应用于过氧化氢和葡萄糖的检测(Advanced Materials，2010，20，2255-2262)。在申请的专利中，人们也提出基于模拟酶比色检测葡萄糖的方法(专利号：201110275358.1；专利号：201310244132.4；专利号：
201310260524.X)。然而这些方法成本高、颜色变化较为单一、不易保存携带。
[0005] 本发明提供一种异硫氰酸荧光素修饰的负载葡萄糖氧化酶的聚多巴胺复合材料的制备方法，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下会产生葡萄糖酸，葡萄糖酸可以猝灭FITC，通过荧光光谱法实现对葡萄糖浓度的检测。
发明内容
[0006] 针对以上不足，本发明提供了一种葡萄糖的检测方法，解决了现有技术中对葡萄糖检测的操作要求高，检测过程复杂，检测成本高，检测时间长，背景干扰大等问题，且制备材料的方法简单环保，成本低、操作简便、灵敏度高，能够快速检测样品中葡萄糖含量。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种异硫氰酸荧光素修饰的负载葡萄糖氧化酶的聚多巴胺复合材料的制备方法，包括如下步骤：
[0008] A、PDA-FITC复合材料的制备：在装有乙醇水溶液的烧杯中加入氨水，调节pH至8.4-8.6，得混合溶液，然后加入多巴胺盐酸盐和异硫氰酸荧光素FITC，置于30℃水浴中搅拌28-30h，得悬浮液，于悬浮液中加入HCl稀溶液，调节pH至4.8-5.0，再置于离心机中离心，得下层沉淀，将离心好的下层沉淀分散到蒸馏水中，即为PDA-FITC复合材料水溶液，其中，氨水与乙醇水溶液的体积比为1：(48-52)，多巴胺盐酸盐和异硫氰酸荧光素FITC的质量比为(50-200):(2.5-10)，多巴胺盐酸盐在乙醇水溶液中的固含量为(1.5-7)mg/mL，蒸馏水与乙醇水溶液的体积比为1：2；
[0009] B、PDA-FITC-GOx复合材料的制备：向步骤A制备的PDA-FITC复合材料水溶液中加入PBS缓冲液，葡萄糖氧化酶GOx和蒸馏水，恒温振荡反应24h，再加入HCl稀溶液调节pH至4.8-5.0，将调好pH的悬浮液用离心机离心得下层沉淀，将离心好的下层沉淀再分散到蒸馏水中，加入NaOH稀溶液调节pH至7.3-7.5，即为PDA-FITC-GOx复合材料水溶液；其中，PDA-FITC复合材料水溶液、PBS缓冲液、蒸馏水的体积比为5:1:14，第一次蒸馏水与第二次蒸馏水的体积比为4:10，葡萄糖氧化酶GOx在PDA-FITC复合材料水溶液中的固含量为(0.5-2)mg/mL。
[0010] 优选地，所述多巴胺盐酸盐和异硫氰酸荧光素FITC的质量比为20:1。
[0011] 所述乙醇水溶液的体积百分比浓度为25％-35％。
[0012] 所述氨水的质量百分比浓度为28％，HCl稀溶液的浓度为1mol/L，NaOH稀溶液的浓度为1mol/L。
[0013] 所述PBS缓冲液的pH为6.3-6.6。
[0014] 所述恒温为25℃。
[0015] 所述离心转速为6000-8000r/min，时间为25-30min。
[0016] 采用上述异硫氰酸荧光素修饰的负载葡萄糖氧化酶的聚多巴胺复合材料的制备方法制备的PDA-FITC-GOx复合材料在检测葡萄糖浓度方面的应用，采用下述方法步骤：
[0017] 取一系列5mL具塞刻度比色管，分别向每支比色管中加入100μL上述制备的PDA-FITC-GOx复合材料水溶液，再分别向每支比色管中依次加入0-80μL不同体积的葡萄糖溶液，每支比色管稀释至1mL，恒温振荡反应1h后，置于荧光比色皿中用荧光光谱仪在激发波长470nm、发射波长523nm时测定荧光强度；以葡萄糖浓度为横坐标，反应液在523nm波长处的荧光强度值为纵坐标，在直角坐标系中作图，得到葡萄糖浓度与荧光强度之间的线性关系图，根据它们之间的这种线性关系以检测葡萄糖的浓度。
[0018] 所述线性关系图中的工作曲线为y＝200.25+42.93x，线性相关系数R2为0.98。
[0019] 所述的葡萄糖溶液的终浓度分别为0μM、5μM、10μM、15μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM。
[0020] 所述PDA-FITC-GOx复合材料在检测葡萄糖浓度方面的应用，具体步骤如下：
[0021] A、PDA-FITC复合材料的制备：在30mL乙醇水溶液中加入0.6mL氨水调节pH至8.4-8.6，之后加入50～200mg多巴胺盐酸盐和2.5～10mg异硫氰酸荧光素FITC，再置于30℃水浴中搅拌30h后加入HCl稀溶液调节pH至5.0，将调好pH的悬浮液用离心机离心得下层沉淀，将离心好的下层沉淀再分散到60mL蒸馏水中，即得PDA-FITC复合材料水溶液；
[0022] B、PDA-FITC-GOx复合材料的制备：向5mL步骤A制备的PDA-FITC复合材料水溶液中加入1mL pH为6.5的PBS缓冲液，5-40mg的葡萄糖氧化酶GOx和4mL蒸馏水，恒温振荡反应24h，加入HCl稀溶液调节pH至4.8-5.2，将调好pH的溶液用离心机离心得下层沉淀，将离心好的下层沉淀再分散到10mL蒸馏水中，加入NaOH稀溶液调节pH至7.4，即得PDA-FITC-GOx复合材料水溶液；
[0023] C、葡萄糖的检测：取11支5mL具塞刻度比色管，分别向每支比色管中加入100μL步骤B制备的PDA-FITC-GOx复合材料水溶液，再分别向每支比色管中依次加入0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、3μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL浓度为1×10-3M的葡萄糖溶液，每支比色管稀释至1mL，恒温振荡反应1h后，置于荧光比色皿中用荧光光谱仪在激发波长470nm、发射波长
523nm时测定荧光强度；以葡萄糖浓度为横坐标，反应液在523nm波长处的荧光强度值为纵坐标，在直角坐标系中作图，得到葡萄糖浓度与荧光强度之间的线性关系图，其线性关系图中的工作曲线为y＝200.25+42.93x，线性相关系数R2为0.98，根据它们之间的这种线性关系以检测葡萄糖的浓度。
[0024] 所述检测方法能够排除其他物质的干扰；所述的其他物质为：NaCl、KCl、CaCl2、D-山梨糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖和D-麦芽糖。
[0025] 本发明的有益效果：本发明采用异硫氰酸荧光素FITC修饰的负载葡萄糖氧化酶GOx的聚多巴胺PDA复合材料PDA-FITC-GOx，利用葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下会产生葡萄糖酸，葡萄糖酸可以猝灭FITC，而其他糖类不影响荧光强度，通过荧光光谱法实现对葡萄糖浓度的检测。本发明解决了现有技术中对葡萄糖检测的操作要求高，检测过程复杂，检测成本高，检测时间长，背景干扰大等问题，本发明的方法成本低、操作简便、能够快速检测样品中葡萄糖含量。
附图说明
[0026] 图1为PDA-FITC复合材料的TEM表征图；
[0027] 图2为PDA、FITC和PDA-FITC复合材料的红外光谱图；
[0028] 图3为PDA-FITC-GOx复合材料检测葡萄糖的荧光光谱图；
[0029] 图4为葡萄糖浓度与荧光强度之间的线性关系图；
[0030] 图5为葡萄糖和其它物质在PDA-FITC-GOx检测体系中523nm处的荧光强度柱状图，图中0为加入葡萄糖空白对照，1-8分别为加入了1μL浓度为1mol/L的NaCl、KCl、CaCl2、D-山梨糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-麦芽糖不同的干扰性物质；
[0031] 图6为向葡萄糖的检测体系中加入其它物质的干扰实验图，图中0为空白对照，1-8分别为向检测体系中加入了1μL浓度为1mol/L的NaCl、KCl、CaCl2、D-山梨糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-麦芽糖不同的干扰性物质。
具体实施方式
[0032] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不局限于这些实施例。实施例中，全部原料购自盖德化工网。
[0033] 实施例1
[0034] PDA-FITC-GOx复合材料的制备
[0035] 1、PDA-FITC复合材料的制备：
[0036] 在30mL乙醇水溶液中加入0.6mL氨水调节pH至8.5，之后加入100mg多巴胺盐酸盐和5mg异硫氰酸荧光素FITC，再置于30℃水浴中搅拌30h后加入HCl稀溶液调节pH至5.0，将调好pH的悬浮液用离心机在每分钟6000转速率下离心30min得下层沉淀，将离心好的下层沉淀再分散到60mL蒸馏水中，即得PDA-FITC复合材料水溶液。所得的PDA-FITC复合材料如图1所示，大小均匀，粒径分布在150-200nm，且通过图2的红外光谱可知，异硫氰酸荧光素FITC成功负载到聚多巴胺微球上。
[0037] 2、PDA-FITC-GOx复合材料的制备：向5mL上述制备的PDA-FITC复合材料水溶液中加入1mL pH为6.5的PBS缓冲液，20mg的葡萄糖氧化酶GOx和4mL蒸馏水，25℃恒温振荡反应24h，加入HCl稀溶液调节pH至5.0，将调好pH的悬浮液用离心机离心得下层沉淀，将离心好的下层沉淀再分散到10mL蒸馏水中，加入NaOH稀溶液调节pH至7.4；其PDA-FITC-GOx复合材料采用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺比色法(TMB)标定，测得复合材料中GOx的负载量为1.52μg/mL。
[0038] 实施例2
[0039] PDA-FITC-GOx用于葡萄糖检测，其包含如下步骤：
[0040] 取11支5mL具塞刻度比色管，分别向每支比色管中加入100μL上述制备的PDA-FITC-GOx复合材料的水溶液，再分别向每支比色管中依次加入0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、3μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL浓度为1×10-3M的葡萄糖溶液，每支比色管稀释至1mL，25℃恒温振荡反应1h后，置于荧光比色皿中用荧光光谱仪在激发波长470nm、发射波长523nm时测定荧光强度；如图3所示，从图中可以看出，荧光强度随着加入葡萄糖浓度增加而下降，这说明合成的PDA-FITC-GOx复合材料可以用于葡萄糖的测定。
[0041] 以葡萄糖浓度为横坐标，反应液在523nm波长处的荧光强度值为纵坐标，在直角坐标系中作图，如图4所示，从图中可以看出，葡萄糖浓度与荧光强度之间具有很好的线性关系图，且线性相关系数为0.98，葡萄糖浓度在0-80μM范围内线性良好，其线性关系图中的工作曲线为y＝200.25+42.93x，根据它们之间的这种线性关系以检测葡萄糖的浓度。
[0042] 实施例3
[0043] 干扰性实验
[0044] 取9支5mL具塞刻度比色管，标记为0-8，分别向其中加入100μL上述制备的PDA--3FITC-GOx复合材料的水溶液，然后向标记为0的比色管中加入50μL浓度为1×10 M的葡萄糖溶液，再依次向标记为1-8的比色管中加入1μL浓度为1mol/L的(NaCl、KCl、CaCl2、D-山梨糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-麦芽糖)干扰性物质，每支比色管稀释至1mL，25℃恒温振荡反应1h后，置于荧光比色皿中用荧光光谱仪在激发波长470nm、发射波长523nm时测定荧光强度；以加入的物质为横坐标，体系在523nm处的荧光强度为纵坐标作柱状图，如图5所示，从图中可以看出该体系在523nm处加入不同物质后荧光强度值，除葡萄糖溶液，其他物质加入没有引起荧光强度明显降低，说明该体系对葡萄糖溶液有着更好的选择性。
[0045] 取9支5mL具塞刻度比色管，标记为0-8，分别向其中加入100μL上述制备的PDA-FITC-GOx复合材料的水溶液，然后分别向每支比色管中依次加入50μL浓度为1×10-3M的葡萄糖溶液，再依次向标记为1-8的比色管中加入1μL浓度为1mol/L的(NaCl、KCl、CaCl2、D-山梨糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-麦芽糖)干扰性物质，每支比色管稀释至1mL，25℃恒温振荡反应1h后，置于荧光比色皿中用荧光光谱仪在激发波长470nm、发射波长523nm时测定荧光强度；以加入的物质为横坐标，体系在523nm处的荧光强度为纵坐标作柱状图，如图6所示，从图中可以看出其他干扰物质对进行葡萄糖溶液的检测实验干扰性不大，表明PDA-FITC-GOx体系对葡萄糖检测有较好的抗干扰性。
