棘孢木霉TD3104及其在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用

摘要

本发明提供了棘孢木霉TD3104及其在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用。所述棘孢木霉菌TD3104的保藏编号是CGMCC 13161。本发明提供了所述棘孢木霉菌在防治烟草、苹果植物病原菌中的应用。本发明提供的拮抗菌能有效抑制烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、立枯丝核菌、烟草根腐病病原菌镰刀菌、烟草赤星病和苹果腐烂病、苹果轮纹病的病原菌生长，可以有效防治相关病害，并且可以减少化学农药的用量及其土壤中的累积，有利于我国经济作物的质量和产量的提高，经济效益和社会效益十分显著。

权利要求

1.棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）TD3104在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用，其特征在于：所述植物为烟草和苹果；所述病原菌包括：烟草黑胫病菌（Phytophthora nicotiana）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、烟草根腐病病原菌镰刀菌（Fusarium oxysporum）、烟草赤星病菌（Alternaria alternata (Fr) Keissler）、苹果腐烂病菌（Valsa mali）和苹果轮纹病菌（Macrophoma kawatsukai）；所述棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）TD3104保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是：CGMCC No. 13161。

2.根据权利要求1所述的棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）TD3104在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用，其特征在于：所述菌剂中棘孢木霉菌TD3104有效活菌为 1×108～1×109 cfu/克。

说明书

棘孢木霉TD3104及其在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物和生物防治领域，尤其涉及棘孢木霉TD3104及其在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用。

背景技术

[0002] 烟草、苹果均是我国重要的经济作物，其产量及质量关系着种植户的切身利益。高品质烟草对产区的土壤及环境条件有一定的要求，因此烟草连作的现象普遍发生。连作后病害加重、产量下降。近年来苹果枝干病害发生严重，苹果腐烂病和苹果轮纹病联合侵染，逐年加重。目前，控制烟草、苹果病害的一般方法是使用化学农药；然而，长期使用化学农药会导致病原菌产生抗药性而降低化学药剂的防病效果，同时会造成农药残留超标和环境污染。因此，生产中急需一种有效、安全、环保的控制烟草病害新技术；生物防治是利用生防菌与植物病原微生物之间的拮抗作用，抑制引起作物病害的病原菌的生长，是控制植物病害的一种新途径。

发明内容

[0003] 针对现有技术中化学农药防治造成环境污染、烟草连作病害发生严重和苹果枝干病害逐年严重等问题，本发明的目的是提供了一株棘孢木霉TD3104及其在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用。本发明所述棘孢木霉菌TD3104自土壤中分离获得。使用本发明所述生防菌防治烟草、苹果病害，可以减少化学农药的用量及其在土壤中的累积，防止环境污染，有利于提高作物的质量和产量，经济效益和社会效益十分显著。

[0004] 为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

[0005] 本发明提供了一株棘孢木霉菌TD3104，其分类命名为棘孢木霉菌Trichodema asperellum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是：CGMCC 13161。

[0006] 进一步的：所述棘孢木霉菌TD3104的菌落白色，质地絮状，有同心轮纹结构，分生孢子梗对生，主分支呈树状；瓶梗短，呈旋涡状排列、安瓿形，基本变细，中间膨大，底部瓶梗较顶部长，分生孢子白色，球形或卵形。

[0007] 进一步的：所述棘孢木霉菌TD3104的ITS序列如SEQ ID No:1所示。

[0008] 本发明还提供了所述的棘孢木霉菌TD3104在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用。

[0009] 进一步的：所述植物为烟草和苹果。

[0010] 进一步的：所述病原菌包括：烟草黑胫病菌、立枯丝核菌、烟草青枯病菌、烟草根腐病病原菌镰刀菌、烟草赤星病菌、苹果腐烂病菌和苹果轮纹病菌。

[0011] 进一步的：所述棘孢木霉菌对病原菌的拮抗机制是重寄生作用、竞争作用和抗生作用。

[0012] 进一步的：所述菌剂中棘孢木霉菌TD3104有效活菌为1×108～1×109cfu/克。

[0013] 进一步的：所述棘孢木霉菌TD3104对烟草病原菌的抑制率在52.1％-100％。

[0014] 进一步的：所述棘孢木霉菌TD3104对苹果病原菌的抑制率在60.7％-100％。

[0015] 与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明提供的拮抗菌棘孢木霉菌TD3104是发明人自土壤分离的优良生防菌株，对烟草多种病原及苹果主要枝干病害均有较好的抑制作用，抗病性广谱，抗病性表现为营养竞争、寄生、代谢产物拮抗等多种方式。能有效抑制烟草黑胫病菌、立枯丝核菌、烟草青枯病菌、烟草根腐病病原菌镰刀菌、烟草赤星病、苹果腐烂病和苹果轮纹病等病原菌的生长，使用以拮抗菌为有效成分的复合菌剂可以有效防治烟草病害，并且可以减少化学农药的用量和其在土壤、果树中的累积，对于防止环境及果品污染极为重要，同时，也有利于提高我国烟草、苹果等作物的质量和产量，经济效益和社会效益十分显著。

附图说明

[0016] 图1表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对烟草黑胫病的抑制作用(左图为培养3天，右图为培养15天)。

[0017] 图2表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对立枯丝核菌的抑制作用(左图为培养3天，右图为培养15天)。

[0018] 图3表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对烟草根腐镰刀菌的抑制作用(左图为培养5天，右图为培养15天)。

[0019] 图4表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对烟草赤星病菌的抑制作用(左图为培养5天，右图为培养15天)。

[0020] 图5表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对苹果腐烂病的抑制作用(左图为培养3天，右图为培养10天)。

[0021] 图6表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对苹果轮纹病的抑制作用(左图为培养5天，右图为培养10天)。

[0022] 图7表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对烟草青枯病的抑制作用(培养2天)。

[0023] 图8表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对苹果枝干病害病原菌菌丝的作用(A:正常苹果腐烂病病原菌菌丝，B：拮抗菌处理的苹果腐烂病病原菌菌丝，C：正常苹果轮纹病病病原菌菌丝，D：拮抗菌处理的苹果轮纹病病原菌菌丝)。

[0024] 图9表明本发明中棘孢木霉菌TD3104对烟草黑胫病的抑制作用(A:对照烟苗基部病症；B：对照烟苗病茎纵刨面)。

[0025] 图10表明不同含量棘孢木霉菌TD3104发酵液对苹果腐烂病菌的抑菌率。

具体实施方式

[0026] 下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

[0027] 实施例1：拮抗菌的分离

[0028] 采用土壤稀释分离法对玉米根围土壤进行分离，本发明所述棘孢木霉菌TD3104即是从此土壤中分离得到，通过将分离物单孢纯化，分别与常见烟草病原菌在PDA平板上两点对峙接种，进行平板拮抗试验，最终筛选得到。

[0029] 实施例2、拮抗菌的鉴定

[0030] 1、拮抗菌的形态学鉴定

[0031] 实验所用培养基如下：

[0032] (1)马铃薯—葡萄糖琼脂(PDA)：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000mL，煮沸10min，纱布过滤，滤液加20g琼脂、20g葡萄糖，再加热使其熔化，最后定容到1000mL，121℃灭菌20min。

[0033] (2)LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，蒸馏水1000mL，pH 7.4，121℃灭菌20min。

[0034] (3)LB固体培养基：在LB培养基中加入20g/L的琼脂。

[0035] (4)燕麦培养基：燕麦片30克，琼胶20克，水1000mL，121℃灭菌20min。

[0036] (5)马铃薯—葡萄糖(PD)：PDA去掉琼脂。

[0037] 将筛选到的菌株接种到PDA平板上，置于28℃恒温恒湿培养箱中倒置培养，观察菌株生长情况。菌落形态为：菌落白色，质地絮状，有同心轮纹结构，生长快速，培养48h后菌落直径达70mm左右，并产生大量白色孢子；分生孢子簇呈半球状，排列为同心轮纹，分生孢子梗上的瓶梗呈现对称分布，顶端具有2个或多个瓶梗，主轴顶端下面生出的初次分枝呈对生，与主轴的夹角近90度，主分支呈树状；瓶梗直，呈旋涡状排列、安瓿形，中间膨大，底部瓶梗较顶部长，分生孢子白色，球形或卵球形。

[0038] 本发明经试验证明棘孢木霉菌TD3104能够产生几丁质酶、纤维素酶和木聚糖酶。

[0039] 2、拮抗菌的ITS序列鉴定

[0040] 本实例根据拮抗菌的ITS序列来对其进行分子鉴定。采用CTAB法提取菌株的基因组DNA。以菌株的基因组DNA为模板，ITS1:(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)为引物扩增菌株的ITS序列。扩增产物用胶回收试剂盒回收纯化后，连接转化，选取阳性克隆送往北京诺赛基因公司进行测序。通过与GenBank中已有的ITS序列进行Blast相似性比较确定菌株的种类。结合菌株的形态学特征和ITS比对结果，最终将菌株确定为棘孢木霉菌Trichodema asperellum。

[0041] ITS序列如下(SEQ ID No:1)：

[0042] TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。

[0043] 将筛选到的棘孢木霉菌TD3104菌株进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2016年10月17日；棘孢木霉Trichodema asperellum的保藏编号为：CGMCC No.13161。

[0044] 实施例3、棘孢木霉菌TD3104的抑菌谱

[0045] 1、对病原真菌的拮抗性

[0046] 将棘孢木霉菌TD3104分别与烟草黑胫病菌、立枯丝核菌、烟草根腐镰刀病菌、烟草赤星病、苹果腐烂病和苹果轮纹病等病原真菌采用两点对峙的方法接种到PDA平板上，同时以不接棘孢木霉菌TD3104各病原菌的PDA平板为对照。置于28℃恒温恒湿培养箱中培养，接种3天后观察病原菌落生长情况，当病原与拮抗菌接触时，测量病原菌落半径，计算抑菌率。

[0047] 抑菌率(％)＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100。

[0048] 表1棘孢木霉菌TD3104对几种真菌病原菌的拮抗性

[0049]

[0050] 当培养第4天时，拮抗菌TD3104与病原菌之间有明显的拮抗带，并且拮抗菌的气生菌丝已与病原菌接触，抑菌率在85.7～52.1之间。其中对烟草根腐镰刀菌的抑菌率最高为86.4％，其次为对烟草黑胫病的抑菌率为85.7％(见表1)；继续培养拮抗菌逐步蔓延到病原菌菌落上，最后全部覆盖病原菌菌落，病原菌菌丝逐步消解，抑菌率达100％(见附图1-6)。
说明拮抗菌对6种真菌病害具有很强的抑制性。

[0051] 2、对病原细菌的拮抗性

[0052] 将烟草青枯病菌接种于LB培养基中，过夜培养，使OD600≥1.0。按1:10加入到LB固体培养基中，制成含菌平板，将拮抗菌的菌饼放置在平板中央，对照不接种拮抗菌。

[0053] 结果表明拮抗菌TD3104对烟草青枯病具有明显的拮抗性，D/d(透明圈之间/菌落直径)为1.4(见附图7)。

[0054] 当棘孢木霉菌与各病原菌相交后，挑取交界处病原菌菌丝在光学显微镜下观察两种菌丝的相互作用。参见附图8。棘孢木霉菌缠绕在病原菌的菌丝上或平行波浪式生长；使病菌菌丝变形、断裂，原生质浓缩、溢出；使菌丝细胞中空变形。

[0055] 因此，棘孢木霉菌TD3104对上述7种病原菌的拮抗机制主要是重寄生作用、竞争作用和抗生作用。

[0056] 实施例4、拮抗菌发酵液对病原菌的作用

[0057] 在PDA斜面上接种棘孢木霉菌，28℃条件下培养5天，制备孢子悬浮液。用移液枪取1mL孢子悬浮液接入装有50mL PD液体培养基三角瓶中，28℃振荡培养4天做为种子。取种子液5mL接入装有100mL PD液体培养基的三角瓶中，28℃条件下振荡培养7天。发酵液用8层纱布过滤，滤液10000r/min离心15分钟，取上清液。一部分用0.22um的细菌过滤器过滤除菌，获得无菌发酵液。另一部分发酵液121℃灭菌30min。

[0058] 将2种无菌发酵液按1:10加入PDA中，制成含毒平板，在平板中心接种病原菌，对照为不含发酵液的PDA，每处理3次重复。28℃培养3天后观察并记录菌落的长势，直至对照菌落长满平板，测量菌落直径，计算抑菌率。

[0059] 抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100。

[0060] 表2不同处理拮抗菌发酵液对病原菌的抑制作用(抑菌率％)

[0061]

[0062] 表2研究结果表明，两种处理方法处理的生防菌TD3104发酵液对烟草黑胫病、烟草根腐镰刀菌和立枯丝核菌等病原均有较强的抑制作用，说明拮抗菌TD3104产生的代谢产物是耐高温的物质。

[0063] 实施例5、不同含量拮抗菌发酵液对病原菌的拮抗性

[0064] 将高压灭菌处理的无菌发酵液按表3分别添加到熔化后30mLPDA固体培养基中，制成3个含毒平板。将直径为6mm的苹果腐烂病菌饼菌置于上述平板的中央，28℃的恒温培养，当对照的菌落长满平皿时，计算抑菌率。结果见图10，随着培养基中发酵液的含量的增加，抑菌率随之提高；当含量为2.6％时抑菌率达88.43％，此后抑菌率不再随浓度的增加而显著的提高，曲线趋于平缓增加。

[0065] 表3不同处理培养基中的发酵液含量

[0066]

[0067] 采用同样的方法测定不同处理的生防菌发酵液及其不同含量对病原菌的抑制作用，结果表明(如图10和表2所示)高温和过滤两种处理方法生防菌发酵液均对烟草黑胫病、烟草根腐镰刀菌和立枯丝核菌等病原均有较强的抑制作用，并且随着发酵液用量的增加，对病原菌的抑制作用增强，说明拮抗菌TD3104产生的代谢产物具有耐高温高压特性。

[0068] 实施例6、菌株制剂的制备

[0069] 在PDA斜面上接种棘孢木霉菌，28℃条件下培养5天，制备孢子悬浮液。用移液枪取1mL孢子悬浮液接入装有50mL PD液体培养基三角瓶中，28℃振荡培养4天做为种子。

[0070] 将1000g麸皮加入900mL PD液体培养基中，装入培养袋中高温灭菌1h。按5％接种后，28℃固体发酵7天，血球计数板检测孢子数量，结果为孢子数量为1.28×108个孢子/g；9
稀释涂布检测结果为1.69×10cfu/g。

[0071] 实施例7、生防菌的防病性

[0072] 在90cm燕麦片培养基平板上接种黑胫病病原，28℃条件下培养15天，将菌体连同培养基一起捣碎，备用。

[0073] 将十字期烟苗移栽到花盆中(盆土经过高温灭菌)，5天后进行试验。处理1：在烟苗周围接种黑胫病病原15g，同时接种拮抗菌15克；处理2：对照只接种病原15g；处理3：另设不接种任何菌株的对照，正常管理。培养35天后，测量各种生物性状，病调查发病率。

[0074] 结果表明：接种病原的对照发病率为100％(表4)，其根基部有明显的病变，剖开茎部，可以明显看到维管束坏死，重新分离可以得到烟草黑胫病病原菌；未接种病原和同时接种病原接+拮抗菌的处理发病率均为0，植物茎部颜色正常，剖开茎部维管束正常(见图9)。说明拮抗菌具有良好的防病效果。

[0075] 表4各处理的发病情况

[0076]

[0077] 接种培养35天，各处理烟苗地上部性状表现为叶片数各处理相同，株高、叶绿素、茎粗均为只接种病原菌的处理最小，叶长*叶宽为接种病原并同时接种拮抗菌的处理最大(表5)。

[0078] 表5各处理烟苗地上部性状

[0079]

[0080] 接种培养35天，各处理烟苗根部性状表现为：接种病原并同时接种拮抗菌时根长最大，植株鲜重和根重为只接种病原菌的处理最小，同时接种拮抗菌的处理与未接菌的处理相差不大(表6)。

[0081] 表6各处理的根部性状

[0082]

[0083] 这说明当病害发生时，一定量的拮抗菌TD3104可以有效抑制病原菌的生长，减轻病原菌对烟草生长的危害。

[0084] 综上所述，本发明提供的拮抗菌，对多种病原菌有很强的抑制作用，并通过寄生和竞争作用抑制病原菌丝的生长，同时其代谢产物也能有效的抑制病原菌的生长，可用于防治烟草、果树病害。

[0085] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。