一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺

摘要

本发明提供一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺，包括菌种准备、菌株活化、一级种子培养、二级种子培养、发酵培养和诱导表达以及放罐步骤。所述的菌种为含肝脏解毒酶基因的重组毕赤酵母菌。所述的发酵培养和诱导表达包括四个阶段，分别为菌体富集阶段、甘油补料发酵阶段、碳源饥饿阶段和高密度高溶氧诱导补料阶段。本发明通过重组毕赤酵母菌发酵生产的肝脏解毒酶的酶活达到50000‑56000 U/g，发酵时间为132‑144h。

权利要求

1.一种重组毕赤酵母菌生产黄曲霉毒素解毒酶的发酵生产工艺，其特征在于：包括菌种准备、菌株活化、一级种子培养、二级种子培养、发酵培养和诱导表达以及放罐步骤；

所述重组毕赤酵母菌的保藏号为CCTCC M2017278；

所述的一级种子培养：挑取活化重组毕赤酵母菌，接种于培养基中，培养至培养液OD600=0.6～0.8后收集菌体；将菌体再次发酵，发酵温度为25℃±0.5℃，罐压是0.06MPa；

培养至培养液OD600=1.5～1.8；

所述的二级种子培养：接种比例为1%，温度控制在24～26℃，发酵液PH为6.5～7.0，溶氧含量控制为25%～35%；

所述的发酵培养和诱导表达包括四个阶段，分别为菌体富集阶段、甘油补料发酵阶段、碳源饥饿阶段和高密度高溶氧诱导补料阶段；

所述的发酵培养和诱导表达步骤：采用的发酵培养基的有效成分含量为：酵母膏10～

30g/L、蛋白胨6.7～20g/L、生物素3.3～10ug/L、甘油23.3～70mL/L、K2HPO4 5～15g/L、麦芽汁0～8 mL/L；

所述的菌体富集阶段：通过反馈流加氨水的方式控制PH 6.5～7.0，空气通气比为

0.6vvm，转速为120～160 r/min；发酵温度为25℃±0.5℃；罐压是0.05～0.07MPa，DO值为

25～35%，培养12～14 h，本阶段菌体湿重达250g/L以上；

所述的甘油补料发酵阶段：控制空气通气量调为1.4～1.6vvm，控制发酵温度25℃±

0.5℃，罐压0.05～0.07MPa，DO值为25～35%，向发酵罐中流加30%甘油，甘油流加速度为17～20 mL·(h·L)-1，甘油补料时间控制22～26 h，菌体OD600达到1.8～2.0；

所述的碳源饥饿阶段：控制发酵罐内温度30℃±0.5℃，空气通气量为0.8～1.2vvm，罐压为0.05～0.07MPa，进行饥饿培养1～1.5h；

所述的高密度高溶氧诱导补料阶段：流加甲醇和 50%山梨醇溶液1:1混合液；发酵温度控制为24～29℃，控制pH为5.5～7.1，空气通气量为0.8～1.2vvm，罐压为0.05～0.07MPa，DO值为25～35%。

2.根据权利要求1所述的一种重组毕赤酵母菌生产黄曲霉毒素解毒酶的发酵生产工艺，其特征在于：所述的发酵培养和诱导表达步骤：采用的发酵培养基的有效成分含量为：酵母膏20g/L、蛋白胨15g/L、生物素5ug/L、K2HPO4 15g/L、麦芽汁8 mL/L、甘油40 g/L。

说明书

一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺

技术领域

[0001] 本发明涉及一种重组毕赤酵母菌的发酵生产工艺，具体涉及一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺，属于生物工程技术领域。

背景技术

[0002] 发酵工程，是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。

[0003] 由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是发酵工程工艺放大问题。从发酵液中分离和纯化产品的技术：包括固液分离技术（离心分离，过滤分离，沉淀分离等工艺），细胞破壁技术（超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂和溶壁酶等），蛋白质纯化技术（沉淀法、色谱分离法和超滤法等），最后还有产品的包装处理技术（真空干燥和冰冻干事燥等）。这些都是发酵工程领域重点研究的方面。

[0004] 重组基因工程菌的工业发酵生产更是发酵工程中的重点和难点。工程菌种虽然具有转基因的能力，但怎样实现其有效表达和工业生产，仍然是生产过程中的重要技术环节。

[0005] 采用普通的毕赤酵母发酵工艺进行扩大发酵重组毕赤酵母菌，表达肝脏解毒酶的效率非常低，无法从中提取出有效的肝脏解毒酶，获得的肝脏解毒酶酶活非常低；因此，怎样提高转基因毕赤酵母通过发酵生产得到的肝脏解毒酶的酶活是本领域研究的重要课题。

发明内容

[0006] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺，显著提高肝脏解毒酶的酶活。

[0007] 为解决现有的技术问题，本发明采用的技术方案是：

[0008] 一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺，包括菌种准备、菌株活化、一级种子培养、二级种子培养、发酵培养和诱导表达以及放罐步骤。

[0009] 所述的菌种为含肝脏解毒酶基因的重组毕赤酵母菌。

[0010] 所述的发酵培养和诱导表达包括四个阶段，分别为菌体富集阶段、甘油补料发酵阶段、碳源饥饿阶段和高密度高溶氧诱导补料阶段。

[0011] 所述的菌体富集阶段；通过反馈流加氨水的方式控制PH 6.5～7.0，空气通气比为0.6vvm，转速为120～160 r/min；发酵温度为25℃±0.5；罐压是0.05～0.07MPa，DO值为25%～35%，培养12～14 h，本阶段菌体湿重可达250g/L以上。

[0012] 所述的甘油补料发酵阶段；向发酵罐中流加30%甘油，甘油流加速度为17～20 mL·(h·L)-1，控制空气通气量调为1.4～1.6vvm，控制发酵温度25℃±0.5，罐压0.05～0.07MPa，DO值为25%～35%，甘油补料时间控制22～26 h，菌体OD600达到1.8～2.0。

[0013] 所述的碳源饥饿阶段；控制发酵罐内温度30℃±0.5，空气通气量为0.8～1.2vvm，罐压为0.05～0.07MPa，进行饥饿培养1～1.5h。

[0014] 所述的高密度高溶氧诱导补料阶段：流加甲醇和 50%山梨醇溶液1:1混合液；发酵温度控制为24～29℃，控制pH为5.5～7.1，空气通气量为0.8～1.2vvm，罐压为0.05～0.07MPa，DO值为25%～35%。

[0015] 所述的发酵培养和诱导表达步骤：采用的发酵培养基的有效成分含量为：酵母膏10～30g/L、蛋白胨6.7～20g/L、生物素3.3～10ug/L、甘油23.3～70mL/L、K2HPO4 5～15g/L、麦芽汁0～8 mL/L。

[0016] 所述的发酵培养和诱导表达步骤：采用的发酵培养基的有效成分含量为：酵母膏20g/L、蛋白胨15g/L、生物素5ug/L、K2HPO4 15g/L、麦芽汁8 mL/L、甘油40 g/L。

[0017] 所述的一级种子培养：挑取活化重组毕赤酵母菌，接种于培养基中，培养至培养液OD600=0.6～0.8后收集菌体；将菌体再次发酵，发酵温度为25℃±0.5；罐压是0.06MPa；培养至培养液OD600=1.5～1.8；

[0018] 所述的二级种子培养：接种比例为1%，温度控制在24～26℃，发酵液PH为6.5～7.0，溶氧含量控制为25%～35%。

[0019] 由于采用了上述技术方案，本发明达到的技术效果是：

[0020] 本发明通过重组毕赤酵母菌发酵生产的肝脏解毒酶的酶活达到50000-56000 U/g，发酵时间为132-144h。

具体实施方式

[0021] 实施例1一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺

[0022] 步骤1、菌种准备

[0023] 采用的菌种为含肝脏解毒酶基因的重组毕赤酵母菌，属于转基因工程菌，该重组毕赤酵母菌的保藏号为CCTCC M2017278；保藏日期为2017年5月22日，保藏单位为CCTCC-中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，分类命名为毕赤酵母 X33。

[0024] 步骤2、菌株活化

[0025] 所述的活化：菌株经三次划线培养。

[0026] 第一次划线培养：取重组毕赤酵母菌冻干粉0.8～1.2g，溶于1mL YPD液体无菌培养基中，取菌液在YPD平板培养基上划线，全程无菌操作；划线后的培养基置于25℃恒温培养箱中培养48h；

[0027] 第二次划线培养：从一次划线培养的平板上挑取单菌落，再次在空白的YPD平板培养基上划线培养，全程无菌操作；

[0028] 划线后的培养基置于25℃恒温培养箱中培养48h；

[0029] 第三次划线培养：从第二次划线培养的平板上挑取单菌落，再次在空白的YPD平板培养基上划线培养，全程无菌操作；

[0030] 划线后的培养基置于25℃恒温培养箱中培养48h。

[0031] 所述YPD培养基，其有效成分包括：酵母膏、蛋白胨和葡萄糖，酵母膏：蛋白胨：葡萄糖的质量比为1：2：2。

[0032] 所述YPD液体培养基的制备包括以下步骤：

[0033] （1）取10g酵母膏和20g蛋白胨溶于900mL纯化水中，121℃灭菌20min；

[0034] （2）取葡萄糖20g溶于100mL纯化水中，115℃灭菌15min；

[0035] （3）将步骤（1）和步骤（2）获得的溶液混合得到YPD液体培养基。

[0036] 所述YPD平板培养基的制备方法：与YPD液体培养基的制备方法相同，只在步骤（1）的溶液中加入2g琼脂；并将步骤（3）获得的混合溶液倒平板。

[0037] 步骤3、一级种子培养

[0038] 挑取第三次划线培养得到的重组毕赤酵母菌单菌落，接种在10mL无菌YPD液体培养基中，在250rpm,25℃条件的恒温震荡培养箱中培养至培养液OD600=0.6～0.8；

[0039] 将上述培养液在3000rpm离心5min，收集菌体；

[0040] 将收集的菌体重悬于含25L无菌YPD液体培养基的50L种子罐中，通气比为0.6vvm，转速为260 r/min；发酵温度为25℃±0.5；罐压是0.06MPa；培养至培养液OD600=1.5～1.8，菌体湿重达到240±10g/L，得到一级种子培养液。

[0041] 步骤4、二级种子培养

[0042] 以体积5T的发酵罐作为二级种子罐，装入二级种子培养基2.5T；温度控制为25℃，用氨水来调节PH并控制在6.5-7.0，溶氧含量控制为25%～35%；

[0043] 向二级种子培养基中接种一级种子培养液25L；即接种比例为1%（体积百分数）。接种后，培养6～8h，培养至OD600为2.3左右时将二级种子培养液转入发酵罐。

[0044] 所述二级种子培养基：有效成分及含量为：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、甘油80mL/L。

[0045] 步骤5、发酵培养和诱导表达

[0046] 采用容量为30T的发酵罐，装入发酵培养基的量为15T，按15%（体积百分数）的接种比例接种二级种子培养液。

[0047] 所述发酵培养基：有效成分的含量为：酵母膏30g/L、蛋白胨20g/L、生物素10ug/L、甘油70mL/L、K2HPO4 15g/L。

[0048] 接种完成后，进行发酵培养和诱导表达，包括四个阶段；

[0049] 第一阶段菌体富集阶段：通过反馈流加氨水的方式控制PH 6.5-7.0，空气通气比为0.6vvm，转速为150 r/min；发酵温度为25℃±0.5；罐压是0.06MPa，DO值为25%～35%，培养12 h，本阶段菌体湿重可达250g/L以上。

[0050] 每隔4 h记录发酵参数，当DO值迅速上升至100%时，菌体富集阶段结束。

[0051] 第二阶段为甘油补料发酵阶段：使菌体量进一步富集，向发酵罐中流加30%甘油（所述百分数为体积百分数），甘油流加速度为18 mL·(h·L)-1，控制空气通气量调为1.5vvm，转速为150 r/min，控制发酵温度25℃±0.5，罐压0.06MPa，DO值为25%～35%，甘油补料时间控制24 h，菌体OD600达到1.8～2.0，菌体湿重可达到350g/L以上。

[0052] 第三阶段碳源饥饿阶段：甘油补料阶段结束后，控制发酵罐内温度30℃±0.5，转速180 r/min，空气通气量为1 vvm，罐压为0.06MPa，进行饥饿培养1h。

[0053] 第四阶段高密度高溶氧诱导补料阶段：饥饿培养结束后，流加甲醇和 50%山梨醇溶液1:1（体积比)混合液；

[0054] 发酵温度控制为25℃，控制pH为6.5-7.0，搅拌转速200 r/min，空气通气量为1 vvm，罐压为0.06MPa，DO值为25%～35%。

[0055] 初始甲醇和山梨醇混合液流加速度均为15 mL·(h·L)-1，流加时间维持4 h；

[0056] 然后流加速度控制在35 mL·(h·L)-1，时间维持2 h；

[0057] 然后每隔2 h检测甲醇含量，控制流加速度，维持甲醇含量在2%-3%，纯氧通气量为0.5vvm，控制DO值为50%；第四阶段的发酵时间共80h。

[0058] 步骤6、放罐

[0059] 发酵培养结束后，放罐，得到肝脏解毒酶发酵液。

[0060] 实施例2 一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺

[0061] 按照实施例1的方法进行发酵生产，只改变步骤5发酵培养和诱导表达步骤中发酵培养基的浓度，进行实施例2；

[0062] 实施例2采用的发酵培养基浓度为实施例1浓度的2/3；即发酵培养基的有效成分的含量为：酵母膏20g/L、蛋白胨13.3g/L、生物素6.7ug/L、甘油46.7mL/L、K2HPO4 10g/L。

[0063] 实施例3 一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺

[0064] 按照实施例1的方法进行发酵生产，只改变步骤5发酵培养和诱导表达步骤中发酵培养基的浓度，进行实施例3；

[0065] 实施例3采用的发酵培养基浓度为实施例1浓度的1/3；即发酵培养基的有效成分的含量为：酵母膏10g/L、蛋白胨6.7g/L、生物素3.3ug/L、甘油23.3mL/L、K2HPO4 5g/L。

[0066] 经试验，检测实施例1-3生产的肝脏解毒酶的酶活，具体结果见表1；

[0067] 表1

[0068]

[0069] 可见，实施例2为优选实施例。

[0070] 实施例4 一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺

[0071] 按照实施例1的方法进行发酵生产，改变步骤5发酵培养和诱导表达步骤中第四阶段（高密度高溶氧诱导补料阶段）的发酵温度和pH进行实施例4-7；

[0072] 实施例4-7采用的发酵温度和pH见表2；

[0073] 表2

[0074]

[0075] 实施例4-7的发酵生产结果见表3；

[0076] 表3

[0077]

[0078] 由表3可见，实施例5为优选实施例，即步骤5发酵培养和诱导表达步骤中第四阶段（高密度高溶氧诱导补料阶段）的发酵温度优选为28℃，pH优选为6.0±0.1。

[0079] 实施例8 一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺

[0080] 按照实施例1的方法进行发酵生产，改变步骤5发酵培养和诱导表达步骤中第四阶段（高密度高溶氧诱导补料阶段）为：

[0081] 饥饿培养结束后，流加含有柠檬酸铵的流加甲醇和 50%山梨醇溶液1:1（V/V)混合液，柠檬酸铵的含量为10mmol/L；

[0082] 发酵温度控制为25℃，控制pH为6.5-7.0，搅拌转速200 r/min，空气通气量为1 vvm，罐压为0.06MPa，DO值为25%～35%。

[0083] 初始甲醇和山梨醇混合液流加速度分别为15 mL·(h·L)-1，流加时间维持4 h；

[0084] 然后流加速度控制在35 mL·(h·L)-1，时间维持2 h；

[0085] 然后每隔2 h检测甲醇含量，控制流加速度，维持甲醇含量在2%-3%，纯氧通气量为0.5vvm，控制DO值为50%；第四阶段的发酵时间共80h。

[0086] 本实施例生产的肝脏解毒酶的酶活为56000 U/g，发酵时间为132h。

[0087] 实施例9一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺

[0088] 按照实施例1的方法进行发酵生产，改变步骤5发酵培养和诱导表达步骤中采用的发酵培养基为：酵母膏20g/L、蛋白胨15g/L、生物素5ug/L、K2HPO4 15g/L，、麦芽汁8 mL/L、甘油40 g/L。

[0089] 本实施例生产的肝脏解毒酶的酶活为55800 U/g，发酵时间为132h。

[0090] 实施例9的方法虽然跟实施例8的酶活、发酵时间差距不大，但成本降低了10-12%。

[0091] 检测肝脏解毒酶酶活的方法为：

[0092] 1、实验准备

[0093] （1）试剂：肝脏解毒酶，AFB1标准品（1mg），99.5%甲醇，纯水。

[0094] （2）设备：酶标仪，移液枪（5mL、1mL、200μL、10μL），4mL离心管，恒温水浴锅。

[0095] （3）试剂配制：

[0096] 0.02mg/mL AFB1（20ppm）：1mgAFB1充分溶解于50mL纯化水中；

[0097] 200ng/mL AFB1（200ppb）：取1mL 20ppmAFB1溶解于99mL纯化水中；

[0098] 0.04g/mL酶液：准确称量4g酶粉充分溶解于100mL纯化水中，然后5000rpm离心10 min取上清；

[0099] pH5磷酸缓冲液：准确称取8.34 g 磷酸二氢钾，1.34 g磷酸氢二钾溶解于1000mL纯化水中；

[0100] 硫酸镁溶液：准确称取0.5g硫酸镁充分溶解于500mL纯化水中。

[0101] 酶活定义：1g肝脏解毒酶每分钟降解1pptAFB1为一个酶活单位。

[0102] 实验步骤

[0103] （1）反应体系

[0104]

[0105] （2）反应过程：

[0106] 回温：将反应体系表中除底物AFB1之外的各物质添加到4mL离心管中，同AFB1（200ppb）一起于30℃下水浴5min；

[0107] 酶反应：向2、3、4号实验组的离心管中分别加入500μL预热后的AFB1，1号空白组中先不加AFB1。然后将各实验组置于30℃水浴反应30min；

[0108] 终止反应：向各实验组添加2mL100%甲醇终止反应，同时向1号空白组添加500μLAFB1底物，然后8000rpm离心5min，取上清为终止反应液；

[0109] 稀释：取1mL终止反应液溶解于17mL样品稀释液中。（目的：样品稀释至试剂盒检测范围之内，即小于2ppb）。

[0110] ⑤使用酶标仪测量各实验组的吸光值。

[0111] 对黄曲酶毒素B1标准品的检测结果如下表所示：

[0112]

[0113] 根据标准品的检测结果得到标准曲线。

[0114] 采用酶标仪测量待检样品的吸光值，按照标准曲线，计算得到待检样品的酶活。

[0115] 除非特殊说明和本领域常用单位，本发明所述比例，均为质量比例，所述百分比，均为质量百分比。

[0116] 本发明所述的肝脏解毒酶，也可称为黄曲霉毒素解毒酶。

[0117] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。