一种产生三基因片段DNA融合方法及应用

摘要

本发明公开了一种产生三片段DNA融合方法，其包括以下步骤：(1)获得包含A基因片段和C基因片段的质粒；(2)以步骤(1)中的质粒为模板，反向PCR扩增获得A基因片段和C基因片段分别位于产物两端的基因片段；(3)以含D基因片段的基因为模板，PCR扩增获得A’DC’基因片段；(4)将步骤(2)中得到的基因片段与步骤(3)中A’DC’基因片段进行体外同源重组；(5)将步骤(4)中的重组产物转化宿主细胞，获得含ADC基因片段的质粒；(6)以步骤(5)中的质粒为模板，PCR扩增获得ADC基因片段。本发明方法简单快速，非特异性扩增基因片段少，成本低，可广泛用于不同基因片段的融合、启动子和融合基因构建、带长同源臂的靶基因构建等。

权利要求

1.一种产生三片段DNA融合方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)通过PCR扩增获得包含A基因片段和C基因片段的基因片段，将扩增获得的基因片段与载体质粒连接，获得包含A基因片段和C基因片段的质粒；

(2)以步骤(1)中获得的质粒为模板，进行反向PCR扩增，获得A基因片段和C基因片段分别位于扩增产物两端的DNA片段；

(3)以含D基因片段的DNA为模板，通过PCR扩增获得A’DC’基因片段，其中A’基因片段与A基因片段有18～20bp的碱基序列相同，C’基因片段与C基因片段有18～20bp的碱基序列相同；

(4)将步骤(2)中扩增得到的DNA片段与步骤(3)中A’DC’基因片段进行体外同源重组，获得重组产物；

(5)将步骤(4)中的重组产物转化宿主细胞，获得含ADC基因片段的质粒；

(6)以步骤(5)中含ADC基因片段的质粒为模板，通过PCR扩增获得ADC基因片段。

2.根据权利要求1所述的产生三片段DNA融合方法，其特征在于，步骤(1)中所述获得包含A基因片段和C基因片段的质粒的方法为：当如附图1中所示的ABC基因片段为天然存在的一段DNA片段时，通过PCR扩增获得ABC基因片段，然后连接载体质粒和转化宿主细胞，获得含ABC基因片段的质粒；当A基因片段和C基因片段不是天然存在于一段基因序列时，通过交叠PCR方法获得AC基因片段，然后连接载体质粒和转化宿主细胞，获得含AC基因片段的质粒。

3.根据权利要求2所述的产生三片段DNA融合方法，其特征在于，所述载体质粒为pMD19-T，所述步骤(1)及步骤(5)中的宿主细胞均为大肠杆菌DH5α。

4.根据权利要求2所述的产生三片段DNA融合方法，其特征在于，所述载体质粒与ABC基因片段或AC基因片段的摩尔比为1：(2～4)。

5.根据权利要求1所述的产生三片段DNA融合方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR扩增的上游引物5’端序列与步骤(1)中A基因片段3’端有18～20bp的碱基序列相同，下游引物的5’端序列与步骤(1)中C基因片段5’端有18～20bp的碱基序列反向互补。

6.根据权利要求1～5任一项所述的产生三片段DNA融合方法在不同基因片段的融合、启动子和融合基因构建、带长同源臂的靶基因构建中的应用。

说明书

一种产生三基因片段DNA融合方法及应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学及微生物学技术领域，具体涉及一种产生三基因片段DNA融合方法及应用。

背景技术

[0002] 在分子生物学研究和微生物遗传操作中，常常需要进行DNA基因片段的融合，形成人工融合基因。交叠PCR(Overlap PCR)是应用最为广泛的产生双基因片段人工融合基因的方法。当用于双DNA基因片段融合时，交叠PCR方便、快速，不需要酶切和连接的步骤，因此也不需要人为引入外源无关的DNA基因片段，可以实现双基因片段无缝隙的嵌合。然而，目前并无交叠PCR用于三基因片段DNA融合的报道，在我们的研究工作中发现，采用交叠PCR进行三个基因片段融合时，交叠PCR表现出明显的局限性。以三基因片段A、D、C融合为例，当采用二步交叠策略时，需要进行二次交叠PCR，第一次交叠PCR产生二基因片段(AD)的融合，第二次交叠PCR产生三基因片段(ADC)融合。此方法虽可产生目的基因片段，但操作过程繁琐，且由于二轮交叠的扩增积累，会出现明显的非特异性扩增；当采用一步交叠时，需要将三基因片段混合在一起，虽然省了一次交叠步骤，但扩增的结果产生大量非特异性条段，无法使用，或者无目的条带产生。由于这些缺点，基于交叠PCR的三基因片段DNA融合往往具有困难，很难获得成功。

[0003] 基因合成技术的进步，为产生三基因片段DNA融合提供了另一种选择方案，可以直接将目的融合DNA全部合成并装配在常见质粒上(如：pUC59)，然而这种方案步骤多，往往需要一个月左右完成，并且三基因片段融合的DNA普遍较长，合成价格不菲，不适合大量使用。因此，需要探索发展新的三基因片段DNA融合的方法，解决上述问题。

发明内容

[0004] 基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种产生三片段DNA融合方法，其可应用于用于不同基因片段的融合、启动子+融合基因构建、带长同源臂的靶基因构建，成本非常低，特异性高，可以快速获取目的融合基因片段。

[0005] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种产生三片段DNA融合方法，包含以下步骤：

[0006] (1)获得包含A基因片段和C基因片段的质粒；

[0007] (2)以步骤(1)中的质粒为模板，进行反向PCR扩增，获得A基因片段和C片段分别位于扩增产物两端的基因片段；

[0008] (3)以含D基因片段的基因为模板，通过PCR扩增获得A’DC’基因片段，其中A’基因片段与A基因片段有18～20bp的碱基序列相同，C’基因片段与C基因片段有18～20bp的碱基序列相同；

[0009] (4)将步骤(2)中扩增得到的基因片段与步骤(3)中A’DC’基因片段进行体外同源重组，获得重组产物；；

[0010] (5)将步骤(4)中的重组产物转化宿主细胞，获得含ADC基因片段的质粒；

[0011] (6)以步骤(5)中含ADC基因片段的质粒为模板，通过PCR扩增获得ADC基因片段。

[0012] 优选地，步骤(1)中所述获得包含A基因片段和C基因片段的质粒的方法为：当ABC基因片段为天然存在的一段DNA片段时，通过PCR扩增获得ABC基因片段，然后连接载体质粒和转化宿主细胞，获得含ABC基因片段的质粒；

[0013] 当AC基因片段在天然状态下不存在时，通过交叠PCR方法获得AC基因片段，然后连接载体质粒和转化宿主细胞，获得含AC基因片段的质粒。

[0014] 优选地，所述载体质粒为pMD19-T，所述宿主细胞为大肠杆菌DH5α(E.coli DH5α)。

[0015] 优选地，所述载体质粒与ABC基因片段或AC基因片段的摩尔比为1：(2～4)。

[0016] 优选地，步骤(3)中所述PCR扩增的上游引物5’端序列与步骤(1)中的A基因片段3’端有18～20bp的碱基序列相同，下游引物的5’端序列与步骤(1)中的C基因片段5’端有18～20bp的碱基序列反向互补。

[0017] 本发明提供的产生三片段DNA融合的方法，可以将目标A基因片段、D基因片段和C基因片段成功融合；

[0018] 根据实际融合需要，可将天然存在的一段基因序列划分为A基因片段、B基因片段和C基因片段，此时步骤(1)中以天然存在的基因序列为模板，通过PCR扩增获得ABC基因片段，然后连接载体质粒和转化宿主细胞，获得含ABC基因片段的质粒；步骤(2)以含ABC基因片段的质粒为模板，通过反向PCR扩增获得A基因片段和C基因片段分别位于扩增产物两端的基因片段；

[0019] 当目标A基因片段和C基因片段不是天然存在于一段基因序列时，步骤(1)中以A基因片段和C基因片段为模板通过交叠PCR方法获得AC基因片段，然后连接载体质粒和转化宿主细胞，获得含AC基因片段的质粒；步骤(2)以含AC基因片段的质粒为模板，通过反向PCR扩增获得A基因片段和C基因片段分别位于扩增产物两端的基因片段；

[0020] 步骤(3)中所述的D基因片段为天然存在的一个基因片段；所述的A’DC’基因片段在天然状态下不存在，其是由所述D基因片段通过PCR扩增获得的基因片段，其中A’基因片段与步骤(1)中的A基因片段有18～20bp的碱基序列相同，C’基因片段与步骤(1)中的C基因片段有18～20bp的碱基序列相同；

[0021] 步骤(5)或步骤(6)中所述ADC基因片段在天然状态下不存在，其是由A基因片段、D基因片段和C基因片段成功融合获得的融合基因片段。

[0022] 优选地，步骤(1)中所述A基因片段和C基因片段为将杀香鱼假单胞菌pcrV基因分成A、B、C三段所得，步骤(3)中所述的D基因片段为荧光假单胞菌luxI基因；

[0023] 或步骤(1)中所述A基因片段和C基因片段为将副球菌pka基因分成A、B、C三段所得，步骤(3)中所述的D基因片段为迟缓爱德华菌evp基因；

[0024] 或步骤(1)中所述A基因片段和C基因片段为将动物凡纳滨对虾凝集素基因lecV的cDNA分成A、B、C三段所得，步骤(3)中所述的D基因片段为细菌的卡那霉素抗性基因kan；

[0025] 或步骤(1)中所述A基因片段和C基因片段为将动物凡纳滨对虾凝集素基因补体基因vanC的cDNA分成A、B、C三段所得，步骤(3)中所述的D基因片段为细菌的氯霉素抗性基因cat。

[0026] 优选地，步骤(1)中的PCR扩增引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；或SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；或SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20。

[0027] 优选地，步骤(2)中的反向PCR扩增引物为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；或SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16；或SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22。

[0028] 优选地，步骤(3)中的PCR扩增引物为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；或SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；或SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；或SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24。

[0029] 本发明提供的三片段DNA融合方法可用于不同基因片段的融合、启动子和融合基因构建以及带长同源臂的靶基因构建。

[0030] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：

[0031] (1)不需要设置复杂的PCR扩增程序和探索最佳的扩增参数条件，操作简单，可以快速获取目的融合基因片段；

[0032] (2)产生非特异性扩增的机率非常低；

[0033] (3)通过克隆筛选，获得的扩增基因片段均来自于单一的模板，从而保证了特异性；

[0034] (4)成本非常低。

附图说明

[0035] 图1是本发明产生三片段DNA融合方法原理图；

[0036] 图2是本发明实施例1～4中ABC片段扩增结果电泳图。其中，M：分子量Marker DL2000；1：A1B1C1(1832bp)；2：A2B2C2(1681bp)；3：A3B3C3(746bp)；4：A4B4C4(1198bp)；

[0037] 图3是本发明实施例1～4中pMD19-ABC质粒构建PCR扩增鉴定结果电泳图。其中，M：分子量Marker DL2000；1：pMD19-A1B1C1(1956bp)；2：pMD19-A2B2C2(1805bp)；3：pMD19-A3B3C3(770bp)；4：pMD19-A4C4(941bp)；

[0038] 图4是本发明实施例1～4中pMD19-ABC质粒反向PCR扩增结果电泳图。其，中M：分子量Marker DL5000；1：A1-pMD19-C1(3917bp)；2：A2-pMD19-C2(3491bp)；3：A3-pMD19-C3(3380bp)；4：A4-pMD19-C4(3633bp)；

[0039] 图5是本发明实施例1～4中包含同源臂的D片段扩增结果电泳图。其中，M：分子量Marker DL2000；1：A1’D1C1’(678bp)；2：A2’D2C2’(634bp)；3：A3’D3C3’(1192bp)；4：A4’D4C4’(1083bp)；

[0040] 图6是本发明实施例1～4中pMD19-ADC质粒构建PCR扩增鉴定结果电泳图。其中，M：分子量Marker DL2000；1：pMD19-A1D1C1(1777bp)；2：pMD19-A2D2C2(1315bp)；3：pMD19-A3D3C3(1760bp)；4：pMD19-A4D4C4(1778bp)；

[0041] 图7是本发明实施5～6中一步或二步交叠PCR用于三片段DNA融合的扩增产物电泳图。其中，M：分子量Marker DL2000；1：OVO-pcrV；2：OVT-pcrV；3：OVO-pka；4：OVT-pka；5：OVO-lecV；6，OVT-lecV；7：OVO-vanC；8：OVT-vanC。图中可见大量非特异性扩增条带。

具体实施方式

[0042] 为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

[0043] 本发明产生三片段DNA融合方法的原理见图1。

[0044] 实施例1

[0045] 本发明的产生三片段DNA融合方法的一种实施例，将杀香鱼假单胞菌pcrV基因(分成A1、B1、C1三段)内部B1基因片段替换为荧光假单胞菌luxI基因基因片段D1，形成A1D1C1融合基因片段。A1、D1、C1三基因片段DNA融合的步骤如下：

[0046] (1)以杀香鱼假单胞菌基因组DNA为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2(pcrV-F1/pcrV-R1)为引物，采用TaKaRa公司的普通Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增程序：94℃变性4min；94℃变性20s，52℃退火30s，72℃延伸120s，将此3个步骤进行30次循环；72℃延伸7min。通过PCR扩增获得A1B1C1基因片段(图2)，长度为1832bp；

[0047] 采用KnoGen公司的PCR产物纯化试剂盒对扩增得到的A1B1C1基因片段进行纯化。将A1B1C1纯化基因片段与TaKaRa公司的pMD19-T载体质粒以2：1摩尔比例混合，采用TaKaRa公司的T4DNA ligase对混合物进行连接，获得连接产物；

[0048] 取上述连接产物4μL转化E.coli DH5α感受态细胞，然后将转化产物涂布于含氨苄青霉素及IPTG的LB培养基平板上，37℃培养过夜，挑取平板上的白色克隆，以SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26(RV/M4)为引物，进行菌落PCR扩增，对平板阳性克隆鉴定。PCR扩增程序：94℃变性4min；94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸120s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸7min。阳性克隆的PCR扩增产物的长度为1956bp(图3)；

[0049] 将上述步骤获得的正确阳性克隆扩大培养，并采用KnoGen公司的质粒提取试剂盒提取质粒，获得含A1B1C1基因片段的质粒pMD19-A1B1C1；

[0050] (2)以pMD19-A1B1C1为模板，以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4(pcrV-F2/pcrV-R2)为引物，采用高保真酶进行反向PCR扩增。PCR扩增程序：98℃变性2min；98℃变性15s，52℃退火20s，72℃延伸90s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸5min。通过PCR扩增得到A1-pMD19-C1(图4)，长度为3917bp。采用KnoGen公司的PCR扩增产物纯化试剂盒对扩增获得的A1-pMD19-C1片段进行纯化。

[0051] (3)以荧光假单胞菌基因组为模板，以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6(pcrV-F3/pcrV-R3)为引物，采用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。扩增程序：98℃变性2min；98℃变性10s，52℃退火10s，72℃延伸30s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸5min。通过扩增获得A1’D1C1’基因片段(图5)，长度为678bp。采用KnoGen公司的PCR产物纯化试剂盒对A1’D1C1’基因片段进行纯化。

[0052] (4)将步骤(3)中纯化得到的A1’D1C1’基因片段与步骤(2)中的A1-pMD19-C1以2：1摩尔比例混合，采用Vazyme公司的一步克隆试剂盒对混合物进行同源重组，获得重组产物。

[0053] (5)取步骤(4)中的重组产物4μL，转化E.coli DH5α感受态细胞，然后将连接产物涂布于含氨苄青霉素及IPTG的LB培养基平板上，37℃培养过夜，挑取平板白色克隆，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2(pcrV-F1/pcrV-R1)为引物，进行菌落PCR扩增，对平板阳性克隆鉴定。PCR扩增程序：94℃变性4min；94℃变性20s，52℃退火30s，72℃延伸120s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸7min。阳性克隆的PCR扩增产物的长度为1777bp(图6)；

[0054] 将上述步骤获得的正确阳性克隆扩大培养，并采用KnoGen公司的质粒提取试剂盒提取质粒，获得含A1D1C1基因片段的质粒pMD19-A1D1C1。

[0055] (6)以步骤(5)中的pMD19-A1D1C1为模板，再次以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2(pcrV-F1/pcrV-R1)为引物，采用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增程序：98℃变性2min；98℃变性15s，52℃退火10s，72℃延伸60s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸
5min。通过PCR扩增获得三基因片段融合的A1D1C1基因片段。

[0056] 将通过上述方法扩增获得的A1D1C1基因片段递交测序，测序结果证明A1、D1、C1三基因片段融合完全正确。

[0057] 实施例2

[0058] 本发明的产生三片段DNA融合方法的一种实施例，将副球菌pka基因(分成A2、B2、C2三段)内部B2基因片段替换为迟缓爱德华菌evp基因基因片段D2，形成A2D2C2融合基因片段。A2、D2、C2三基因片段融合的步骤如下：

[0059] (1)以副球菌基因组为模板，以SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8(pka-F1/pka-R1)为引物，采用TaKaRa公司的普通Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增程序：94℃变性4min；94℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸80s，将此3个步骤进行30个循环；最后72℃延伸7min。通过PCR扩增获得A2B2C2基因片段(图2)，长度为1681bp；

[0060] 采用KnoGen公司的PCR产物纯化试剂盒对扩增得到的A2B2C2基因片段进行纯化。将A2B2C2纯化基因片段与TaKaRa公司的pMD19-T载体质粒以4：1摩尔比例混合，采用TaKaRa公司的T4DNA ligase对混合物进行连接，获得连接产物；

[0061] 取上述连接产物10μL化学转化E.coli DH5α感受态细胞，然后将转化产物涂布于含氨苄青霉素及IPTG的LB培养基平板上，37℃培养过夜，挑取平板白色克隆，以SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26(RV/M4)为引物，进行菌落PCR扩增，对平板阳性克隆鉴定。PCR扩增程序：
94℃变性4min；94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸120s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸7min。阳性克隆的PCR扩增产物的长度为1805bp(图3)；

[0062] 将上述步骤获得的正确阳性克隆，扩大培养，并采用KnoGen公司的质粒提取试剂盒提取质粒，获得含A2B2C2基因片段的质粒pMD19-A2B2C2；

[0063] (2)以pMD19-A2B2C2为模板，以SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10(pka-F2/pka-R2)为引物，采用高保真酶反向PCR扩增。PCR扩增程序：98℃变性2min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸70s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸5min。通过反向PCR扩增得到A2-pMD19-C2(图4)，长度为3491bp。采用KnoGen公司的PCR扩增产物纯化试剂盒对扩增获得的A2-pMD19-C2片段进行纯化。

[0064] (3)以迟缓爱德华菌基因组为模板，以SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12(pka-F3/pka-R3)为引物，采用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增程序：98℃变性2min；98℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸30s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸5min。通过PCR扩增获得A2’D2C2’基因片段(图5)，长度为634bp。采用KnoGen公司的PCR产物纯化试剂盒对A2’D2C2’基因片段进行纯化。

[0065] (4)将步骤(3)中纯化得到的A2’D2C2’基因片段与步骤(2)中的A2-pMD19-C2以4：1摩尔比例混合，采用Vazyme公司的一步克隆试剂盒对混合物进行同源重组，获得重组产物。

[0066] (5)取步骤(4)中的重组产物10μL，转化E.coli DH5α感受态细胞，然后将连接产物涂布于含氨苄青霉素及IPTG的LB培养基平板上，37℃培养过夜，挑取平板白色克隆，以SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8(pka-F1/pka-R1)为引物，进行菌落PCR扩增，对平板阳性克隆鉴定。PCR扩增程序：94℃变性4min；94℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸80s，将此3个步骤进行
30个循环；72℃延伸7min。阳性克隆的PCR扩增产物的长度为1315bp(图6)；

[0067] 将上述步骤获得的正确阳性克隆扩大培养，并采用KnoGen公司的质粒提取试剂盒提取质粒，获得含A2D2C2基因片段的pMD19-A2D2C2。

[0068] (6)以步骤(5)中的pMD19-A2D2C2为模板，再次以SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8(pka-F1/pka-R1)为引物，采用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增程序：98℃变性2min；98℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸30s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸5min。通过PCR扩增获得三基因片段融合的A2D2C2基因片段。

[0069] 将通过上述方法扩增获得的A2D2C2基因片段递交测序，测序结果证明A2、D2、C2三基因片段融合完全正确。

[0070] 实施例3

[0071] 本发明的产生三片段DNA融合方法的一种实施例，为证实本发明方法具有广泛的使用性，可以将遗传背景差异巨大的DNA基因片段融合，将动物-凡纳滨对虾凝集素基因lecV(cDNA，分成A3、B3、C3三段)内部B3基因片段替换为细菌的卡那霉素抗性基因kan的基因片段D3，形成A3D3C3融合基因片段。A3、D3、C3三基因片段融合的步骤如下：

[0072] (1)以凡纳滨对虾RNA反转录获得的cDNA为模板，以SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14(lecV-F1/lecV-R1)为引物，采用TaKaRa公司的普通Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增程序：94℃变性4min；94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸40s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸7min。通过PCR获得A3B3C3基因片段(图2)，长度为746bp；

[0073] 采用KnoGen公司的PCR产物纯化试剂盒对扩增得到的A3B3C3基因片段进行纯化。将A3B3C3纯化基因片段与TaKaRa公司的pMD19-T载体质粒以3：1摩尔比例混合，采用TaKaRa公司的T4DNA ligase对混合物进行连接，获得连接产物；

[0074] 取上述连接产物5μL化学转化E.coli DH5α感受态细胞，然后将连接产物涂布于含氨苄青霉素及IPTG的LB培养基平板上，37℃培养过夜，挑取平板白色克隆，以SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26(RV/M4)为引物，进行菌落PCR扩增，对平板阳性克隆鉴定。PCR扩增程序：94℃变性4min；94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸120s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸7min。阳性克隆的PCR扩增产物的长度为770bp(图3)；

[0075] 将上述步骤获得的正确阳性克隆扩大培养，并采用KnoGen公司的质粒提取试剂盒提取质粒，获得含A3B3C3基因片段的质粒pMD19-A3B3C3；

[0076] (2)以pMD19-A3B3C3为模板，以SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16(lecV-F2/lecV-R2)为引物，采用高保真酶进行反向PCR扩增。PCR扩增程序：98℃变性2min；98℃变性12s，56℃退火15s，72℃延伸80s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸5min。通过PCR扩增得到A3-pMD19-C3(图4)，扩增产物长度为3380bp。采用KnoGen公司的PCR扩增产物纯化试剂盒对扩增获得的A3-pMD19-C3片段进行纯化。

[0077] (3)以质粒pKD13为模板，以SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18(lecV-F3/lecV-R3)为引物，采用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增程序：98℃变性2min；98℃变性12s，56℃退火15s，72℃延伸50s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸5min。通过PCR扩增获得A3’D3C3’基因片段(图5)，长度为1192bp。采用KnoGen公司的PCR产物纯化试剂盒对A3’D3C3’基因片段进行纯化。

[0078] (4)将步骤(3)中纯化得到的A3’D3C3’基因片段与步骤(2)中的A3-pMD19-C3以3：1摩尔比例混合，采用Vazyme公司的一步克隆试剂盒对混合物进行同源重组，获得重组产物。

[0079] (5)取步骤(4)中的重组产物6μL，转化E.coli DH5α感受态细胞，然后将转化产物涂布于含氨苄青霉素及IPTG的LB培养基平板上，37℃培养过夜，挑取平板白色克隆，以SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14(lecV-F1/lecV-R1)为引物，进行菌落PCR扩增，对平板阳性克隆鉴定。PCR扩增程序：94℃变性4min；94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸60s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸7min。阳性克隆的PCR扩增产物的长度为1760bp(图6)；

[0080] 将上述步骤获得的正确阳性克隆扩大培养，并采用KnoGen公司的质粒提取试剂盒提取质粒，获得含A3D3C3基因片段的质粒pMD19-A3D3C3。

[0081] (6)以步骤(5)中的质粒pMD19-A3D3C3为模板，再次以SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14(lecV-F1/lecV-R1)为引物，采用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增程序：98℃变性
2min；98℃变性12s，56℃退火15s，72℃延伸50s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸
5min。通过PCR扩增获得三基因片段融合的A3D3C3基因片段。

[0082] 将通过上述方法扩增获得的A3D3C3基因片段递交测序，测序结果证明A3、D3、C3三基因片段融合完全正确。

[0083] 实施例4

[0084] 本发明的产生三片段DNA融合方法的一种实施例，为证实本发明方法广泛使用性，可以将遗传背景差异巨大的DNA基因片段融合，将动物-凡纳滨对虾凝集素基因补体基因vanC(cDNA，分成A4、B4、C4三段)内部B4基因片段替换为细菌的氯霉素抗性基因cat的基因片段D4，形成A4D4C4融合基因片段。A4、D4、C4三基因片段融合的步骤如下：

[0085] (1)以凡纳滨对虾RNA反转录获得的cDNA为模板，分别以SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20(vanC-F1/vanC-R1)为引物，采用TaKaRa公司的普通Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增程序：94℃变性4min；94℃变性20s，54℃退火30s，72℃延伸60s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸7min。通过PCR扩增获得A4B4C4基因片段(图2)，长度1198bp；

[0086] 采用PCR产物纯化试剂盒纯化上述片段，并以纯化的片段作为模板，采用TaKaRa公司的高保真DNA聚合酶，以SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：51(vanC-F1/vanC-AR1)为引物扩增A4基因片段；以SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：20(vanC-CF1/vanC-R1)为引物扩增C4基因片段，分别。分别采用PCR产物纯化试剂盒纯化A4和C4基因片段。以A4和C4基因片段为模板，以SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20(vanC-F1/vanC-R1)为引物，采用TaKaRa公司高保真酶DNA聚合酶进行交叠PCR扩增，获得人工整融合的A4C4基因片段。交叠PCR扩增程序：98℃变性2min；98℃变性10s，65℃退火15s，72℃延伸90s，将此3个步骤进行5个循环；98℃变性10s，54℃退火15s，72℃延伸90s，将此3个步骤进行25个循环；72℃延伸5min；

[0087] 采用KnoGen公司的PCR产物纯化试剂盒对扩增得到的A4C4基因片段进行纯化。将纯化的A4C4基因片段与TaKaRa公司的pMD19-T载体质粒以2.5：1摩尔比例混合，采用TaKaRa公司的T4DNA ligase对混合物进行连接，获得连接产物；

[0088] 取上述连接产物8μL化学转化E.coli DH5α感受态细胞，然后将连接产物涂布于含氨苄青霉素及IPTG的LB培养基平板上，37℃培养过夜，挑取平板白色克隆，以SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26(RV/M4)为引物，进行菌落PCR扩增，对平板阳性克隆鉴定。PCR扩增程序：94℃变性4min；94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸120s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸7min。阳性克隆的PCR扩增产物的长度为941bp(图3)；

[0089] 将上述步骤获得的正确阳性克隆扩大培养，并采用KnoGen公司的质粒提取试剂盒提取质粒，获得含A4C4基因片段的质粒pMD19-A4C4；

[0090] (2)以pMD19-A4C4为模板，以SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22(vanC-F2/vanC-R2)为引物，采用高保真酶进行反向PCR扩增。PCR扩增程序：98℃变性2min；98℃变性12s，54℃退火15s，72℃延伸90s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸5min。通过PCR扩增得到A4-pMD19-C4片段(图4)，长度为3633bp。采用KnoGen公司的PCR扩增产物纯化试剂盒对扩增获得的A4-pMD19-C4片段进行纯化。

[0091] (3)以质粒pBAD18cm为模板，以SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24(vanC-F3/vanC-R3)为引物，采用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增程序：98℃变性2min；98℃变性12s，54℃退火15s，72℃延伸40s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸5min。通过PCR扩增获得A4’D4C4’基因片段(图5)，长度为1083bp。采用KnoGen公司的PCR产物纯化试剂盒对A4’D4C4’基因片段进行纯化。

[0092] (4)将步骤(3)中纯化得到的A4’D4C4’基因片段与步骤(2)中的A4-pMD19-C4以2.5：1摩尔比例混合，采用Vazyme公司的一步克隆试剂盒对混合物进行同源重组，获得重组产物。

[0093] (5)取步骤(4)中的重组产物8μL，转化E.coli DH5α感受态细胞，然后将转化产物涂布于含氨苄青霉素及IPTG的LB培养基平板上，37℃培养过夜，挑取平板白色克隆，以SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20(vanC-F1/vanC-R1)为引物，进行菌落PCR扩增，对平板阳性克隆鉴定。PCR扩增程序：94℃变性4min；94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸100s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸7min。阳性克隆PCR扩增产物的长度为1778bp(图6)；

[0094] 将上述步骤获得的正确阳性克隆扩大培养，采用质粒提取试剂盒，并采用KnoGen公司的质粒提取试剂盒提取质粒，获得含A4D4C4基因片段的质粒pMD19-A4D4C4。

[0095] (6)以步骤(5)中的质粒pMD19-A4D4C4为模板，再次以SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20(vanC-F1/vanC-R1)为引物，采用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增程序：98℃变性
2min；98℃变性12s，54℃退火15s，72℃延伸40s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸
5min。通过PCR扩增获得三基因片段融合的A4D4C4基因片段。

[0096] 通过上述方法扩增获得的A4D4C4基因片段递交测序，测序结果证明A4、D4、C4三基因片段融合完全正确。

[0097] 实施例5本发明三片段DNA融合方法与一步交叠PCR法效果比较

[0098] (一)实验设计

[0099] 为比较本发明方法与传统交叠PCR方法用于三片段基因融合时的效果，分别针对实施例1～4设置对照组1～4，其中对照组1～4采用一步交叠PCR法进行A、D、C三基因片段的融合，具体设计如表1所示：

[0100] 表1融合方法

[0101]

[0102]

[0103] (二)实验方法

[0104] (1)对照组1融合基因片段扩增：以杀香鱼假单胞菌基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28(pcrV-AF/pcrV-AR)扩增A1基因片段，采用SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30(pcrV-CF/pcrV-CR)扩增C1基因片段；以荧光假单胞菌基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32(pcrV-DF/pcrV-DR)扩增D1基因片段；

[0105] 对照组2融合基因片段扩增：以副球菌基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34(pka-AF/pka-AR)扩增A2基因片段，采用SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36(pcrV-CF/pcrV-CR)扩增C2基因片段；以迟缓爱德华氏菌基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38(pcrV-DF/pcrV-DR)扩增D2基因片段；

[0106] 对照组3融合基因片段扩增：以凡纳滨对虾RNA反转录获得的cDNA为模板，采用SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40(lecV-AF/lecV-AR)扩增A3基因片段，采用SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42(pcrV-CF/pcrV-CR)扩增C3基因片段；以pKD13质粒DNA为模板，采用SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44(lecV-DF/lecV-DR)扩增D3基因片段；

[0107] 对照组4融合基因片段扩增：以凡纳滨对虾RNA反转录获得的cDNA为模板，采用SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46(vanC-AF/vanC-AR)扩增A4基因片段，采用SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48(vanC-CF/vanC-CR)扩增C4基因片段；以pBAD18cm质粒DNA为模板，采用SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50(vanC-DF/vanC-DR)扩增D4基因片段；

[0108] 获得对照组1～4融合基因片段的PCR扩增方法均为：采用高保真DNA聚合酶进行扩增，PCR扩增程序：98℃变性2min；98℃变性10s，56℃退火15s，72℃延伸20s，将此3个步骤进行30个循环；72℃延伸5min。

[0109] (2)采用KnoGen公司的PCR扩增产物纯化试剂盒分别将对照组1～4中的DNA基因片段进行纯化，并用Fisher公司的Nano Drop检测各基因片段DNA的浓度。

[0110] (3)将步骤(2)纯化得到的对照组1～4中的各相应基因片段按摩尔数比例为1：1：1混合，获得A1/D1/C1、A2/D2/C2、A3/D3/C3和A4/D4/C4混合物。

[0111] (4)分别取1uL步骤(3)中的A1/D1/C1、A2/D2/C2、A3/D3/C3和A4/D4/C4混合物进行一步法交叠PCR扩增。对照组1～4中PCR扩增引物对分别为SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：32(pcrV-AF/pcrV-CR)、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：38(pka-AF/pka-CR)、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：44(lecV-AF/lecV-CR)和SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：50(vanC-AF/vanC-CR)。对照组1～4均采用高保真DNA聚合酶进行扩增，PCR扩增程序：98℃变性2min；98℃变性10s，60℃退火
15s，72℃延伸30s，将此3个步骤进行5个循环，每个循环退火温度降低1℃；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，将此3个步骤进行25个循环；72℃延伸5min。扩增产物分别命名为：OVO-pcrV、OVO-pka、OVO-lecV、OVO–vanC。

[0112] (5)采用琼脂糖凝胶电泳对步骤(4)中的扩增产物进行检测。

[0113] (三)实验结果

[0114] 对照组1～4扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图7所示。由结果可知，对照组1～4中三个基因片段的一步交叠PCR产生了大量非特异扩增基因片段，只有OVO-pka组出现了较弱的目的三基因片段融合的条带，其余均未出现明显的三基因片段融合的条带，均未达到进一步实验的要求，因此采用一步交叠PCR产生三基因片段融合具有非常低的成功率。
而发明提供的方法操作简便，均可获得相应的目的三基因片段融合产物，且特异性非常高，得到的三基因片段融合产物可满足后续实验的要求。

[0115] 实施例6本发明三片段DNA融合方法与二步交叠PCR法效果比较

[0116] (一)实验设计

[0117] 为比较本发明方法与传统交叠PCR方法用于三片段基因融合时的效果，分别针对实施例1～4设置对照组5～8，其中对照组5～8采用二步交叠PCR法进行A、D、C三基因片段的融合，具体设计如表2所示：

[0118] 表2融合方法

[0119]对照组 融合基因片段 融合产物 融合方法
对照组5 实施例1中的A1、D1、C1 A1D1C1 二步交叠PCR法
对照组6 实施例2中的A2、D2、C2 A2D2C2 二步交叠PCR法
对照组7 实施例3中的A3、D3、C3 A3D3C3 二步交叠PCR法
对照组8 实施例4中的A4、D4、C4 A4D4C4 二步交叠PCR法

[0120] (二)实验方法

[0121] (1)对照组5融合基因片段扩增：以杀香鱼假单胞菌基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28(pcrV-AF/pcrV-AR)扩增A1基因片段，采用SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30(pcrV-CF/pcrV-CR)扩增C1基因片段；以荧光假单胞菌基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32(pcrV-DF/pcrV-DR)扩增D1基因片段；

[0122] 对照组6融合基因片段扩增：以副球菌基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34(pka-AF/pka-AR)扩增A2基因片段，采用SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36(pcrV-CF/pcrV-CR)扩增C2基因片段；以迟缓爱德华氏菌基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38(pcrV-DF/pcrV-DR)扩增D2基因片段；

[0123] 对照组7融合基因片段扩增：以凡纳滨对虾RNA反转录获得的cDNA为模板，采用SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40(lecV-AF/lecV-AR)扩增A3基因片段，采用SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42(pcrV-CF/pcrV-CR)扩增C3基因片段；以pKD13质粒DNA为模板，采用SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44(lecV-DF/lecV-DR)扩增D3基因片段；

[0124] 对照组8融合基因片段扩增：以凡纳滨对虾RNA反转录获得的cDNA为模板，采用SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46(vanC-AF/vanC-AR)扩增A4基因片段，采用SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48(vanC-CF/vanC-CR)扩增C4基因片段；以pKD13质粒DNA为模板，采用SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50(vanC-DF/vanC-DR)扩增D4基因片段；

[0125] 获得对照组5～8中融合基因片段的PCR扩增方法均为：采用高保真DNA聚合酶进行扩增，PCR扩增程序：PCR扩增程序：98℃变性2min；98℃变性10s，56℃退火15s，72℃延伸30s，将此三个步骤进行30个循环；72℃延伸5min。

[0126] (2)采用KnoGen公司的PCR扩增产物纯化试剂盒分别将对照组5～8中的DNA基因片段进行纯化，并用Fisher公司的Nano Drop检测各基因片段DNA的浓度。

[0127] (3)将步骤(2)纯化得到的对照组5～8中的各相应A、D基因片段按摩尔数比例为1：1混合，获得A1/D1、A2/D2、A3/D3和A4/D4混合物。

[0128] (4)分别取1uL步骤(3)中的A1/D1、A2/D2、A3/D3和A4/D4混合物进行第一次交叠PCR扩增。对照组5～8中PCR扩增引物对分别为pcrV-AF/pcrV-DR、pka-AF/pka-DR、lecV-AF/lecV-DR、vanC-AF/vanC-DR。对照组5～8均采用高保真DNA聚合酶进行扩增，PCR扩增程序：98℃变性2min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s，将此3个步骤进行5个循环，每个循环退火温度降低1℃；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，将此3个步骤进行25个循环；72℃延伸5min。对照组5～8通过第一次交叠PCR扩增得到A1D1、A2D2、A3D3和A4D4。

[0129] (5)采用KnoGen公司的PCR扩增产物纯化试剂盒分别对对照组5～8中第一次交叠PCR产物进行纯化，得到A1D1、A2D2、A3D3和A4D4的纯化基因片段，并用Fisher公司的Nano Drop检测各基因片段DNA的浓度。

[0130] (6)分别将A1D1与C1、A2D2与C2、A3D3与C3和A4D4与C4按摩尔数比例为1：1混合，获得A1D1/C1、A2D2/C2、A3D3/C3和A4D4/C4混合物。

[0131] (7)分别取1uL步骤(6)中的A1D1/C1、A2D2/C2、A3D3/C3和A4D4/C4混合物进行第二次交叠PCR扩增。对照组5～8的PCR扩增引物对分别为SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：32(pcrV-AF/pcrV-CR)、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：38(pka-AF/pka-CR)、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：44(lecV-AF/lecV-CR)、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：50(vanC-AF/vanC-CR)。对照组5～8均采用高保真DNA聚合酶进行扩增，PCR扩增程序：98℃变性2min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s，将此3个步骤进行5个循环，每个循环退火温度降低1℃；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，将此3个步骤进行25个循环；72℃延伸5min。扩增产物分别命名为：OVT-pcrV、OVT-pka、OVT-lecV、OVT–vanC。

[0132] (8)采用琼脂糖凝胶电泳对步骤(7)中的扩增产物进行检测。

[0133] (三)实验结果

[0134] 对照组5～8扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图7所示。由结果可知，三个基因片段的二步交叠PCR虽然能产生需要的三基因片段融合基因片段，但也产生了大量非特异扩增基因片段，并且目的基因片段的产量在各个扩增产物中均不是最大的。这为后续的实验带来麻烦，增加了大量纯化的工作量，因此二步交叠PCR也不适合三基因片段融合的产生。而发明提供的方法操作简便，且特异性非常高，得到的三基因片段融合产物可直接进行后续的实验。

[0135] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。