本发明涉及一种虾蟹类富水性组织的石蜡切片制作方法；常规的石蜡组织切片方法指标对于组织形态难固定、质地柔软、富水性的虾蟹类组织器官缺乏组织区分度，易造成组织破碎、重叠、折曲，严重影响组织的显微观察效果，难以获得理想清晰的组织结构。本发明通过对样品的负压、固定和包埋处理进而定型组织、延展组织避免褶皱重叠和因富水性组织的弹性而存在误差。本发明操作简便、可行性强、周期短，对于组织形态难固定、质地柔软、富水性的虾蟹类组织器官具有很好的组织区分度，可以实现完整的组织形态的石蜡切片观察，能满足研究人员对切片组织观察的全部要求。
1.一种虾蟹类组织的石蜡切片方法，其特征在于步骤如下：
1）将样品组织放于组织固定液中，立即负压固定，负压至样品组织块膨胀饱满、不再产生气泡；再立即加入到盛有相同浓度的组织固定液的适宜体积的离心管中，离心管中组织固定液的量与样品组织体积之比为20：1；避免组织块贴于容器壁上，室温恒温固定4-6h；所述负压的压力值为-1.25kpa；负压容器总容积：容器中组织固定液总体积:样品组织体积=
所述组织固定液为溶质质量分数2.5%的多聚甲醛溶液；多聚甲醛溶液具体制备方法为：取多聚甲醛50g，1×PBS缓冲溶液900ml，加水至1000ml，混合后60℃下水浴24h，若还有未溶解的多聚甲醛，滴加1-2滴1当量（1mol/L）的NaOH溶液，调节PH为6.8-7.2，4℃下保存；
0.01M所述1×PBS缓冲溶液的组份为：Na2HPO4 8mM，NaCl 136mM，KH2PO4 2mM，KCl
所述1当量的NaOH溶液为：称取NaOH固体粉末10g，用250mL的容量瓶配置成250mL 、
2） 将步骤1）固定后的样品组织放入包埋盒中，用流动清水不间断流动冲洗包埋盒
3）对冲洗完毕的样品组织在常温下，依次用梯度浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、
90%、100%的乙醇溶液脱水处理；浓度为30%的乙醇溶液脱水处理时间分别为4h-5h；浓度为
40%、50%、60%、70%的乙醇溶液脱水处理时间分别为40min-1h，浓度为80%、90%、100%的乙醇脱水处理时间分别为15min-35min；当乙醇溶液浓度≤70%时，所述乙醇溶液与样品组织的体积比为50:1；当乙醇溶液浓度浓度≥70%时，所述乙醇溶液与样品组织的体积比为35:1；
脱水处理完成后将装有样品组织的包埋盒从无水乙醇溶液中取出；
b）25℃，40％浓度的乙醇中持续处理40min；
c）25℃，50%浓度的乙醇中持续处理40min；
d）25℃，60%浓度的乙醇中持续处理40min；
e）25℃，70％浓度的乙醇中持续处理40min；
f）25℃，80％浓度的乙醇中持续处理40min；
g）25℃，90％浓度的乙醇中持续处理40min；
h）25℃，95％浓度的乙醇中持续处理40min；
i）25℃，100％浓度的乙醇中持续处理(Ⅰ)15min；
j）25℃，100％浓度的乙醇中持续处理(Ⅱ)15min；
4） 将步骤3）中取出的包埋盒放入透明剂中进行透明处理；
所述透明剂为溶质质量分数为50%的二甲苯Ⅰ溶液、溶质质量分数为95%的二甲苯Ⅱ溶液；
a）甩净残余包埋盒无水乙醇溶液，以悬空重力作用30s后无乙醇溶液液滴滴下为标准；
b）将包埋盒先放入二甲苯Ⅰ溶液中40min后再放入二甲苯Ⅱ溶液中30min；
5）把透明好的样品组织放入蜡槽，60℃下渗蜡1h；渗蜡完成后运用金属包埋器进行包埋，待完全冷却凝固后将包埋器去掉；
6）扭紧固定好切片机机头，稳固刀架结构，调整切片厚度为5μm；首先进行切片的预实验修整，直至切出完整的最大组织切面后，再进行正式切制；将切片平整铺开，轻拖使其单层铺于展片机的恒温水体表层；自然晾干12h，100℃烤箱中烘烤2h；
所述预实验修整分三步进行：一是切平面，每一刀切出的切片都是5μm均匀厚度的单片组织切片，避免出现厚度不均；二是切大小，每一刀切出的切片的横截面形状和面积相似；
三是切微观组织，通过将切片不断在显微镜下进行观察，保证切出的切片微观组织既要满足横切、纵切的要求，同时清晰可见；
7）将烘干后的切片用二甲苯溶液进行脱蜡处理，脱蜡完成后用100%、95%、90%、80%、
70%、60%的浓度梯度乙醇溶液和伊红-苏木精染液进行染色处理；最后，用中性树胶将染色完成的切片进行封片处理，并用恒温箱将封好的切片作干燥处理；
所述脱蜡步骤为：取已经干燥的切片，放于盛有溶质质量分数为95%的二甲苯Ⅱ溶液中脱蜡10min；
g）25℃，蒸馏水持续处理5min，4℃冷却3min；
h）25℃，苏木紫染液持续处理10min，4℃冷却3min；
i）25℃，蒸馏水轻沾1-2次，4℃冷却1-2min；
j）25℃，分色液持续处理5s，4℃冷却10s；11）25℃，去离子水轻沾1-2次，4℃冷却3min；
所述分色液组分为：溶质质量分数70％的酒精100ml和盐酸 1ml；
k）25℃，伊红染液持续处理1min，4℃冷却10s；
o）25℃，溶质质量分数为50%的二甲苯Ⅰ溶液持续处理10min；
p）25℃，溶质质量分数为50%的二甲苯Ⅱ溶液持续处理10min。
一种虾蟹类富水性组织的石蜡切片制作方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种虾蟹类富水性组织的石蜡切片制作方法，属于显微组织切片技术领域。背景技术：
[0002] 虾蟹类组织石蜡切片技术是研究动物组织形态和病理学变化的一种重要技术。由于虾蟹类是水生动物，其各种组织器官的含水量较高，尤其是经常作为病理学研究依据的鳃组织和肝胰腺(中肠腺)组织。近年来，对虾蟹类以上两种组织开展研究过程中取材量大、试剂用量较多，出于经济考虑，传统技术仍作为广泛使用技术。技术一般包括取材及固定、流水冲洗、组织脱水、组织透明、渗蜡包埋、切片展片、脱蜡和HE染色、光镜显微观察等步骤。而常规的方法指标对于组织形态难固定、质地柔软、富水性的虾蟹类组织器官缺乏组织区分度，易造成组织破碎、重叠、折曲，严重影响组织的显微观察效果，难以获得理想清晰的组织结构。本发明旨在弥补现有方法在处理虾蟹类等富水性动物及其组织的技术不足，以获得理想的组织器官石蜡切片图像。
发明内容：
[0003] 为了解决上述问题，本发明提供了一种虾蟹类富水性组织的石蜡切片制作方法。
[0004] 一种虾蟹类组织的石蜡切片制作方法，步骤如下：
[0005] 1、将样品组织放于组织固定液中，立即负压固定，负压至样品组织块膨胀饱满、不再产生气泡；再立即加入到盛有相同浓度的组织固定液的适宜体积的离心管中，离心管中组织固定液的量与样品组织体积之比为20：1；避免组织块贴于容器壁上，室温(20—25℃)恒温固定4-6h；所述负压的压力值为-1.25kpa；负压容器总容积(V1)：容器中组织固定液总体积(V2):样品组织体积(V3)＝6:3:1；
[0006] 所述组织固定液为溶质质量分数2.5％的多聚甲醛溶液；多聚甲醛溶液具体制备方法为：取多聚甲醛50g，1×PBS缓冲溶液900ml，加水至1000ml，混合后60℃下水浴24h，若还有未溶解的多聚甲醛，滴加1-2滴1当量(1mol/L)的NaOH溶液，调节PH为6.8-7.2，4℃下保存；
[0007] 所述1×PBS缓冲溶液(0.01M)的组份为：Na2HPO4 8mM，NaCl 136mM，KH2PO4 2mM，KCl 2.6mM，PH＝7.2-7.4；
[0008] 所述1当量(1mol/L)的NaOH溶液为：称取NaOH固体粉末10g，用250mL的容量瓶配置成250mL、1mol/L的NaOH溶液。
[0009] 2、将步骤1)固定后的样品组织放入包埋盒中，用流动清水不间断流动冲洗包埋盒24h；洗除样品组织中残留的固定液；冲洗完毕后用擦镜纸包好。
[0010] 3、对冲洗完毕的样品组织在常温(25℃左右)下，依次用梯度浓度为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的乙醇溶液脱水处理；浓度为30％的乙醇溶液脱水处理时间分别为4h-5h；浓度为40％、50％、60％、70％的乙醇溶液脱水处理时间分别为40min-
1h，浓度为80％、90％、100％的乙醇脱水处理时间分别为15min-35min；当乙醇溶液浓度≤
70％时，所述乙醇溶液与样品组织的体积比为50:1；当乙醇溶液浓度≥70％时，所述乙醇溶液与样品组织的体积比为35:1；脱水处理完成后将装有样品组织的包埋盒从无水乙醇溶液中取出。
[0011] 4、将步骤3)中取出的包埋盒放入透明剂中进行透明处理。
[0012] 5、把透明好的样品组织放入蜡槽，60℃下渗蜡1h。渗蜡完成后运用金属包埋器进行包埋，待完全冷却凝固后将包埋器去掉，进行下一步试验，或4℃下保存。
[0013] 6、扭紧固定好切片机机头，稳固刀架结构，调整切片厚度为5μm。首先进行切片的预实验修整，直至切出完整的最大组织切面后，再进行正式切制。尽量将切片平整铺开，轻拖使其单层铺于展片机的恒温水体表层。自然晾干12h，100℃烤箱中烘烤2h。
[0014] 所述预实验修整分三步进行：一是切平面，保证每一刀切出的切片都是5μm均匀厚度的单片组织切片，避免出现厚度不均；二是切大小，保证每一刀切出的切片的横截面形状和面积相似；三是切微观组织，通过将切片不断在显微镜下进行观察，保证切出的切片微观组织既要满足横切、纵切的要求，同时清晰可见。
[0015] 7、将烘干后的切片用二甲苯II溶液进行脱蜡处理，脱蜡完成后用100％、95％、90％、80％、70％、60％的浓度梯度乙醇溶液和伊红-苏木精染液进行染色处理；最后，用中性树胶将染色完成的切片进行封片处理，并用恒温箱将封好的切片作干燥处理。
[0016] 优选的，所述步骤3)中组织脱水步骤为：
[0017] 1)25℃，30％浓度的乙醇中持续处理4h；
[0018] 2)25℃，40％浓度的乙醇中持续处理40min；
[0019] 3)25℃，50％浓度的乙醇中持续处理40min；
[0020] 4)25℃，60％浓度的乙醇中持续处理40min；
[0021] 5)25℃，70％浓度的乙醇中持续处理40min；
[0022] 6)25℃，80％浓度的乙醇中持续处理40min；
[0023] 7)25℃，90％浓度的乙醇中持续处理40min；
[0024] 8)25℃，95％浓度的乙醇中持续处理40min；
[0025] 9)25℃，100％浓度的乙醇中持续处理15min；
[0026] 10)25℃，100％浓度的乙醇中持续处理15min。
[0027] 所述步骤4)中透明剂为溶质质量分数为50％的二甲苯Ⅰ溶液、溶质质量分数为95％的二甲苯Ⅱ溶液。所述二甲苯Ⅰ溶液组分为100％乙醇与100％二甲苯以体积比1:1混合；所述二甲苯Ⅱ溶液组分为100％乙醇与100％二甲苯以体积比1:19混合。
[0028] 所述步骤4)中组织透明处理步骤为：
[0029] 1)甩净残余包埋盒无水乙醇溶液，以悬空重力作用30s后无乙醇溶液液滴滴下为标准；
[0030] 2)将包埋盒先放入二甲苯Ⅰ溶液中40min后再放入二甲苯Ⅱ溶液中30min。
[0031] 所述步骤7)中脱蜡步骤为：取已经干燥的切片，放于盛有溶质质量分数为95％的二甲苯Ⅱ溶液中脱蜡10min。
[0032] 所述步骤7)中染色处理的步骤为：
[0033] 1)25℃，100％乙醇溶液持续处理10min；
[0034] 2)25℃，95％乙醇溶液持续处理10min；
[0035] 3)25℃，90％乙醇溶液持续处理10min；
[0036] 4)25℃，80％乙醇溶液持续处理10min；
[0037] 5)25℃，70％乙醇溶液持续处理10min；
[0038] 6)25℃，60％乙醇溶液持续处理10min；
[0039] 7)25℃，蒸馏水持续处理5min，4℃冷却3min；
[0040] 8)25℃，苏木精染液持续处理10min，4℃冷却3min；
[0041] 9)25℃，蒸馏水轻沾1-2次，4℃冷却1-2min；
[0042] 10)25℃，分色液持续处理5s，4℃冷却10s；11)25℃，去离子水轻沾1-2次，4℃冷却3min；所述分色液组分为：溶质质量分数70％的酒精和0.5％的盐酸以体积比100:1混合；
[0043] 12)25℃，伊红染液持续处理1min，4℃冷却10s；
[0044] 13)25℃，90％乙醇溶液持续处理2min；
[0045] 14)25℃，95％乙醇溶液持续处理2min；
[0046] 15)25℃，100％乙醇溶液持续处理10min；
[0047] 16)25℃，溶质质量分数为50％的二甲苯Ⅰ溶液持续处理10min；
[0048] 17)25℃，溶质质量分数为95％的二甲苯Ⅱ溶液持续处理10min。
[0049] 本发明有益效果：
[0050] 目前，常规的石蜡组织切片方法指标对于组织形态难固定、质地柔软、富水性的虾蟹类组织器官缺乏组织区分度，易造成组织破碎、重叠、折曲，严重影响组织的显微观察效果，难以获得理想清晰的组织结构。本发明中对样品的负压、固定和包埋处理是为了定型组织、延展组织避免褶皱重叠，避免出现因富水性组织的弹性而存在误差。本发明操作简便、可行性强、周期短，对于组织形态难固定、质地柔软、富水性的虾蟹类组织器官具有很好的组织区分度，可以实现完整的组织形态的石蜡切片观察。以日本沼虾的鳃组织和肝胰腺(中肠腺)组织为例，运用本发明进行石蜡切片的光镜显微观察，可以清晰地看到：(1)鳃组织，纵切面鳃叶排列整齐、结构紧密；横切面鳃腺呈现辐射状的菊花结构，肾原细胞排列具有规律性，为锥形。(2)肝胰腺(中肠腺)组织，肝小管纵切面排列整齐，横切面呈星状，结构清晰完整；纵切面延展性好，组织充实饱满，符合正常生理形态，组织铺展清晰、无重叠。运用本发明对虾蟹类富水性组织进行组织切片，可以满足研究人员对切片组织观察的全部要求。附图说明：
[0051] 图1为本发明实施例1中日本沼虾鳃组织的横切面切片和纵切面切片；
[0052] 图2为本发明实施例1中日本沼虾肝胰腺(中肠腺)组织的横切面切片和纵切面切片；
[0053] 图3为图1的彩色示意图；
[0054] 图4为图2的彩色示意图；
[0055] 图1和图2所用方法一致，只是样品组织各异。图1和图2说明运用该方法进行石蜡切片的光镜显微观察，可以清晰地看到：(1)鳃组织，纵切面鳃叶排列整齐、结构紧密；横切面鳃腺呈现辐射状的菊花结构，肾原细胞排列具有规律性，为锥形。(2)肝胰腺(中肠腺)组织，肝小管纵切面排列整齐，横切面呈星状，结构清晰完整；纵切面延展性好，组织充实饱满，符合正常生理形态，组织铺展清晰、无重叠。具体实施方式：
[0056] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0057] 实施例1
[0058] 本实施例中主要进行了虾蟹类富水性组织的石蜡切片方法，选取了日本沼虾的鳃组织和肝胰腺(中肠腺)组织，以鳃组织为例具体实施，肝胰腺组织处理同鳃组织，包括以下步骤：
[0059] 1.取材及固定
[0060] 在通风橱中配制2.5％多聚甲醛溶液：运用多聚甲醛50g，1×PBS缓冲溶液(Na2HPO4 8mM，NaCl 136mM，KH2PO4 2mM，KCl 2.6mM，PH＝7.2-7.4)900ml，加水至1000ml，混合后60℃下水浴24h，若有多聚甲醛还有未溶解的滴加1-2滴1当量的NaOH溶液(10g粉末溶于250ml水中形成的混合溶液)，调节PH为6.8-7.2，4℃下保存。
[0061] 首先轻轻地把日本沼虾的头胸甲去掉，将第4、5枝鳃取下放入洁净的10ml带胶塞透明玻璃小瓶子中，加入适量的2.5％多聚甲醛溶液，盖紧胶塞，使得负压容器总容积(V1)：容器中固定液总体积(V2):固定组织体积(V3)＝6:3:1，封好盖子，利用5ml一次性注射器抽气形成-1.25kpa的负压，持续处理2-3min，直至样品组织表面无气泡产生。然后将鳃组织连同多聚甲醛一起倒入15ml的离心管中并加2.5％多聚甲醛至刻度10ml，盖好盖子，写上标签，竖放在试管架。固定的时间为4-6h，一般不超过24h。
[0062] 将样品组织放于组织固定液中，立即负压固定，固定时间t≥5min，再立即加入到盛有相同浓度的组织固定液的适宜体积的离心管中，室温(20—25℃)恒温固定4-6h；
[0063] 2.流水冲洗
[0064] 用流动清水洗除鳃叶组织样品块中残留的固定液。组织用擦镜纸包好放在塑料包埋盒中，标注好样品组织名称和编号，放入2000ml容量的烧杯中用流动的蒸馏水冲洗24h。
[0065] 3.组织脱水
[0066] 对冲洗完毕的鳃叶组织样品要进行梯度脱水处理，脱水过程中所使用的乙醇浓度要逐级梯度递进，缓慢、有序为宜；乙醇溶液与组织块的体积比为50:1(≤70％)和35:1(＞70％)；常温(25℃左右)下，组织脱水步骤为：
[0067] 1)25℃，30％浓度的乙醇中持续处理4h；
[0068] 2)25℃，40％浓度的乙醇中持续处理40min；
[0069] 3)25℃，50％浓度的乙醇中持续处理40min；
[0070] 4)25℃，60％浓度的乙醇中持续处理40min；
[0071] 5)25℃，70％浓度的乙醇中持续处理40min；
[0072] 6)25℃，80％浓度的乙醇中持续处理40min；
[0073] 7)25℃，90％浓度的乙醇中持续处理40min；
[0074] 8)25℃，95％浓度的乙醇中持续处理40min；
[0075] 9)25℃，100％浓度的乙醇中持续处理(Ⅰ)15min；
[0076] 10)25℃，100％浓度的乙醇中持续处理(Ⅱ)15min。
[0077] 4.组织透明
[0078] 将装有鳃叶组织块的包埋盒从无水乙醇中拿出后运用二甲苯Ⅰ溶液(溶质质量分数为50％)、二甲苯Ⅱ溶液(溶质质量分数95％)依次进行透明处理，二甲苯溶液与鳃叶组织块的体积比为30:1(Ⅰ溶液)和15:1(Ⅱ溶液)。组织透明步骤为：
[0079] 1)用力甩动手臂，甩净残余乙醇溶液，以悬空重力作用30s后无乙醇溶液液滴滴下为标准；
[0080] 2)二甲苯Ⅰ溶液中40min；
[0081] 3)二甲苯Ⅱ溶液中30min。
[0082] 5.渗蜡包埋
[0083] 将石蜡倒进漏斗进行过滤，然后把透明好的组织依次放入蜡槽，60℃下渗蜡1h，塑料包埋盒按顺序排好，以免组织与标签不符。渗蜡完成后进行包埋，放好金属包埋器，点燃酒精灯，将过滤好的石蜡倒入蜡壶中然后充满金属包埋器，尖嘴镊子在酒精灯上烧一下，迅速将渗完蜡的组织放入金属包埋器中，摆放好位置后把该组织标有相对应标签的塑料包埋盒轻轻放入金属包埋盒中慢慢挤压放平，直至蜡从塑料包埋盒的孔中挤出，将塑料包埋盒底部包埋住，待完全冷却凝固后将包埋器去掉，进行下一步试验，或4℃下保存。
[0084] 6.切片展片
[0085] 扭紧固定好切片机机头，稳固刀架结构，调整切片厚度为5μm。首先进行切片的预实验修整，直至切出完整的最大组织切面后，再进行正式切制。用镊子将切好的蜡片一端谨慎提起，尽量将切片平整铺开，轻拖使其单层铺于展片机的恒温水体表层。自然晾干12h，100℃烤箱中烘烤2h。
[0086] 7.脱蜡和HE染色
[0087] 取已经干燥的切片，放于盛有二甲苯Ⅱ溶液(95％)的染缸内脱蜡10min。HE染色的步骤为：
[0088] 1)25℃，100％乙醇溶液持续处理10min；
[0089] 2)25℃，95％乙醇溶液持续处理10min；
[0090] 3)25℃，90％乙醇溶液持续处理10min；
[0091] 4)25℃，80％乙醇溶液持续处理10min；
[0092] 5)25℃，70％乙醇溶液持续处理10min；
[0093] 6)25℃，60％乙醇溶液持续处理10min；
[0094] 7)25℃，蒸馏水持续处理5min，4℃冷却3min；
[0095] 8)25℃，苏木精染液持续处理10min，4℃冷却3min；
[0096] 9)25℃，蒸馏水轻沾1-2次，4℃冷却1-2min；
[0097] 10)25℃，分色液(70％酒精100ml，0.5％盐酸1ml)持续处理5s，4℃冷却10s；
[0098] 11)25℃，去离子水轻沾1-2次，4℃冷却3min；
[0099] 12)25℃，伊红染液持续处理1min，4℃冷却10s；
[0100] 13)25℃，90％乙醇溶液持续处理2min；
[0101] 14)25℃，95％乙醇溶液持续处理2min；
[0102] 15)25℃，100％乙醇溶液持续处理10min；
[0103] 16)25℃，二甲苯Ⅰ(50％)溶液持续处理10min；
[0104] 17)25℃，二甲苯Ⅱ(95％)溶液持续处理10min。
[0105] 然后，用中性树胶将染色完成的切片进行封片处理；最后用35℃恒温箱将封好的切片作干燥处理。
[0106] 8.显微观察
[0107] 在Leica DM-2500正置荧光显微镜的40倍、100倍、200倍、400倍下，观察组织切片。
[0108] 观察结果显示：运用本发明方法处理后的石蜡切片，通过光镜显微观察，可以清晰地看到：(1)鳃组织，纵切面鳃叶排列整齐、结构紧密；横切面鳃腺呈现辐射状的菊花结构，肾原细胞排列具有规律性，为锥形。(2)肝胰腺(中肠腺)组织，肝小管纵切面排列整齐，横切面呈星状，结构清晰完整；纵切面延展性好，组织充实饱满，符合正常生理形态，组织铺展清晰、无重叠。
[0109] 本发明操作简便、可行性强、周期短，对于组织形态难固定、质地柔软、富水性的虾蟹类组织器官具有很好的组织区分度，可以实现完整的组织形态的石蜡切片观察。以日本沼虾的鳃组织和肝胰腺(中肠腺)组织为例，运用本发明进行石蜡切片的光镜显微观察，可以清晰地看到：(1)鳃组织，纵切面鳃叶排列整齐、结构紧密；横切面鳃腺呈现辐射状的菊花结构，肾原细胞排列具有规律性，为锥形。(2)肝胰腺(中肠腺)组织，肝小管纵切面排列整齐，横切面呈星状，结构清晰完整；纵切面延展性好，组织充实饱满，符合正常生理形态，组织铺展清晰、无重叠。
