本发明公开了一种同时检测尿液中毒死蜱3种代谢产物的方法及装置。所述方法包括以下步骤：(A)目标化合物选择：3,5,6‑三氯‑2‑吡啶醇、磷酸二乙酯、硫代磷酸二乙酯；(B)样品酶解；(C)样品提取；(D)样品净化与浓缩；(E)仪器分析：所述装置主要包括：主体和色谱－离串联质谱检测仪，所述主体内包含电源装置、解冻装置、离心装置一、水浴装置、涡旋混合装置、离心装置二、净化装置、旋转蒸发装置、PLC控制器。本发明的装置具有简洁快速的优点，实现了智能化控制，可控性强，准确度高。本发明的方法大大提高了检测的有效性和可靠性，节省了检测时间和检测费用。
1.一种同时检测尿液中毒死蜱3种代谢产物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)目标化合物选择毒死蜱的3种体内代谢产物：3,5,6-三氯-2-吡啶醇、磷酸二乙酯、硫代磷酸二乙酯；
(B)酶解：取冰冻尿样于室温下缓慢解冻，取10mL尿样于50mL离心管中，加入4mL 6M HCl振荡，于80℃水浴条件下水解2h，2h后取出，降至室温；
(C)提取：尿样中加入10mL乙腈溶液，3g NaCl，涡旋混合1min后，离心分离，取上层5mL乙腈；
(D)净化与浓缩：将提取后的乙腈过自制净化小柱，上样完毕后，再以5mL乙腈洗脱，收集所有洗脱液，旋转蒸发至干，氮气吹干后，1mL乙腈定容，待测样品在-20℃的环境中避光保存，测试前加入内标磷酸二正丁酯；
(E)待测样品使用色谱－串联质谱检测，色谱选择超高效液相色谱仪，色谱条件：色谱柱选择反相C18色谱柱，柱温为35℃，流动相A为0.2‰氨水，流动相B为乙腈，进样体积为2μL，质谱条件：电离方式电喷雾离子源，负离子模式，多反应离子监测(MRM)，离子源温度：500℃，离子喷雾电压：-4500V，气帘气(curtain gas,CUR)压力为35psi，喷雾气(ion source gas 1,GS1)压力为50psi，辅助加热气(ion source gas 2,GS2)压力为55psi；
所述步骤(E)中的流动相流速为0.3mL/min左右，梯度洗脱程序为0～2min，99％A:1％B，2～3min，70％A:30％B，3～10min，5％A:95％B，10～13min，5％A:95％B，13.1～15min，
2.根据权利要求1所述的一种同时检测尿液中毒死蜱3种代谢产物的方法，其特征在于，所述步骤(C)中的离心速度为8000r/min。
3.根据权利要求1中所述的一种同时检测尿液中毒死蜱3种代谢产物的方法，其特征在于，所述步骤(D)中的自制净化小柱的配方为100mg PSA、50mg GCB、2g无水Na2SO4填充。
4.根据权利要求1中所述的一种同时检测尿液中毒死蜱3种代谢产物的方法，其特征在于，所述步骤(E)中的选择特征离子对分别为：3,5,6-三氯-2-吡啶醇：196.0/35.0(m/z)和
198.0/35.0(m/z)；磷酸二乙酯：153.0/79.0(m/z)和153.0/125.0(m/z)；硫代磷酸二乙酯：
169.0/95.0(m/z)和169.0/141.0(m/z)。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种同时检测尿液中毒死蜱3种代谢产物的方法所用的装置，其特征在于，主要包括：主体(1)和检测仪器(39)，所述检测仪器(39)为超高效液相色谱质谱联用仪；所述主体(1)内包含电源装置(2)、解冻装置(3)、离心装置一(4)、水浴装置(5)、涡旋混合装置(6)、离心装置二(7)、净化装置(8)、旋转蒸发装置(9)、PLC控制器(10)，所述电源装置(2)位于所述主体(1)的左侧，所述解冻装置(3)位于所述电源装置(2)的后上方，所述离心装置一(4)、离心装置二(7)、净化装置(8)、旋转蒸发装置(9)依次从左至右位于主体(1)内部，所述水浴装置(5)位于离心装置一(4)的前方，所述涡旋混合装置(6)位于离心装置二(7)的前方，所述PLC控制器(10)位于主体(1)的右上方，在所述解冻装置(3)的后方设置有HCl存储装置(11)，在主体(1)的后侧上方从左至右依次设有乙腈存储装置(12)、氮气存储装置(13)、内标磷酸二正丁酯存储装置(14)，所述解冻装置(3)通过导管一(16)连接至所述离心装置一(4)，在所述导管一(16)上设有流量控制阀一(27)，所述HCl存储装置(11)通过导管二(17)连接至所述离心装置一(4)，所述离心装置一(4)底部设有旋转电机一(4a)，在所述导管二(17)上设有流量控制阀二(28)，所述离心装置一(4)通过导管三(18)连接至所述水浴装置(5)，在所述导管三(18)上设有流量控制阀三(29)，所述水浴装置(5)通过导管四(19)连接至所述涡旋混合装置(6)，在所述导管四(19)上设有流量控制阀四(30)，所述涡旋混合装置(6)通过导管五(20)连接至所述乙腈存储装置(12)，在所述导管五(20)上设有流量控制阀五(31)，所述涡旋混合装置(6)、导管六(21)连接至所述离心装置二(7)，在所述导管六(21)上设有流量控制阀六(32)，所述离心装置二(7)通过导管七(22)连接至所述净化装置(8)，所述导管七(22)上设有流量控制阀七(33)，所述净化装置(8)通过导管八(23)连接至所述乙腈存储装置(12)，在所述导管八(23)上设有流量控制阀八(34)，所述旋转蒸发装置(9)上设有旋转瓶(9a)、收集瓶(9b)、连接口一(9c)和连接口二(9d)，所述净化装置(8)通过导管九(24)连接至所述旋转蒸发装置(9)的连接口一(9c)，在所述导管九(24)上设有流量控制阀九(35)，所述旋转蒸发装置(9)上的连接口二(9d)通过导管十(25)连接至所述氮气存储装置(13)，在所述导管十(25)上设有流量控制阀十(36)，所述收集瓶(9b)通过导管十一(26)连接至所述内标磷酸二正丁酯存储装置(14)，在所述导管十一(26)上设有流量控制阀十一(37)，所述流量控制阀一(27)、流量控制阀二(28)、流量控制阀三(29)、流量控制阀四(30)、流量控制阀五(31)、流量控制阀六(32)、流量控制阀七(33)、流量控制阀八(34)、流量控制阀九(35)、流量控制阀十(36)、流量控制阀十一(37)均通过各自的电磁继电阀和导线(38)连接至所述PLC控制器(10)，所述标磷酸二正丁酯存储装置(14)通过导液管(15)连接至所述检测仪器(39)，所述电源装置(2)为所述解冻装置(3)、离心装置一(4)、水浴装置(5)、涡旋混合装置(6)、离心装置二(7)、净化装置(8)、旋转蒸发装置(9)、PLC控制器(10)提供电源。
6.根据权利要求5所述的一种同时检测尿液中毒死蜱3种代谢产物的方法所用的装置，其特征在于，所述解冻装置(3)外侧设有加热装置(3a)，所述离心装置一(4)底部设有旋转电机一(4a)，所述水浴装置(5)底部设有水浴加热器(5a)，所述涡旋混合装置(6)底部设有电动混合器(6a)，所述离心装置二(7)底部设有旋转电机二(7a)，所述加热装置(3a)、旋转电机一(4a)、水浴加热器(5a)、电动混合器(6a)、旋转电机二(7a)均连接至所述电源装置(2)，在所述电源装置(2)上设有控制面板(2a)。
一种同时检测尿液中毒死蜱3种代谢产物的方法及装置
技术领域
[0001] 本发明涉及农药检测技术领域，具体是涉及一种同时检测尿液中毒死蜱3种代谢产物的方法及装置。
背景技术
[0002] 毒死蜱属于一种广泛用于农作物多种病虫害防治的广谱性有机磷杀虫剂。毒死蜱是我国杀虫剂市场的主导农药品种，在世界上的生产量和使用量也居高不下。毒死蜱可通过食物、空气、土壤等介质暴露进入人体。
[0003] 毒死蜱可抑制胆碱酯活性，而中枢神经系统的乙酰胆碱酯酶对维持中枢神经系统神经细胞的发生和成熟具有重要作用。越来越多的研究证实毒死蜱对发育期的中枢神经系统存在慢性毒性作用，与儿童注意多动缺陷障碍、记忆力减退、认知障碍等相关。欧美等发达国家对毒死蜱污染对儿童的智力与生长发育影响给予了高度关注。环境污染带来的健康风险一直以来就是人们关注的焦点，人体内暴露水平是确定环境污染物人体负荷浓度的关键指标，也是最直接的指标。部分有机污染物进入人体后会发生代谢，产生多种代谢产物，准确定量污染物的内暴露，须同时测定该物质的多种代谢产物。
[0004] 2016年《职业卫生与应急救援》第34卷第4期278-281页中介绍了一种使用气相色谱法测定血浆中3,5,6-三氯-2-吡啶醇的方法，本法对3,5,6-三氯-2-吡啶醇检出下限为3μg/L。2015年《理化检验-化学分册》第51卷第9期927-931页中介绍了一种利用气相色谱串联质谱法对鱼肉中3,5,6-三氯-2-吡啶醇的分析方法，线性范围为1.0～1000μg/L，检测下限0.3μg/kg。2015年《环境污染与防治》第37卷第9期80-83页中介绍了一种利用双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺进行衍生化，测定毒死蜱及其代谢产物的方法，主要使用固相萃取富集，利用气相色谱质谱联用方法测定水样中3,5,6-三氯-2-吡啶醇的方法，检出限为0.100μg/L。2016年《中国职业医学》第43卷第5期590-596页中介绍了一种利用超高效液相色谱对血浆中3,5,6-三氯-2-吡啶醇进行检测的方法，线性范围为1.00～50.00mg/L，检出限为
0.30mg/L。2013年《色谱》第31卷第9期903-907页中介绍了一种利用超高效液相色谱-串联质谱法测定人尿中3,5,6-三氯-2-吡啶醇的方法，方法检出限为0.41μg/L。
[0005] 综上所述，已有的文献报道主要针对血浆、水样中的毒死蜱代谢产物，尿液中毒死蜱代谢产物的检测方法研究较少，且仅关注3,5,6-三氯-2-吡啶醇一种代谢产物。然而，毒死蜱进入人体后，在体内发生代谢产生3,5,6-三氯-2-吡啶醇之外，还会产生磷酸二乙酯、硫代磷酸二乙酯等2种重要的代谢产物，同时快速准确地定量测定尿液中毒死蜱3种代谢产物是准确衡量毒死蜱人体内暴露的前提条件，对于准确定量毒死蜱的人体负荷具有重要作用。
[0006] 且以往的方法中使用的气相色谱-火焰离子化检测器、气相色谱-电子捕获检测器、气相色谱-氮磷检测器、高效液相色谱-紫外检测器等，对于同时检测3种毒死蜱代谢产物方面，在面对背景复杂、干扰物质多时，无法准确定性定量，甚至出现假阳性结果，远远无法对人体样本(如尿液、血浆)中痕量毒死蜱代谢产物的分析监测要求。
发明内容
[0007] 本发明解决的技术问题是针对当前人体尿液中毒死蜱代谢产物同时检测的方法匮乏，本发明提供一种同时定量尿液中毒死蜱3种主要代谢产物的检测方法，建立了毒死蜱3种代谢产物尿液样品检测的酶解、提取、净化与浓缩的方法，同时建立并优化了3种主要代谢产物同时检测的高效液相色谱和二级质谱(MS/MS)检测方法。
[0008] 本发明的技术方案是：
[0009] 一种同时检测尿液中毒死蜱3种代谢产物的方法，包括以下步骤：
[0010] (A)目标化合物选择毒死蜱的3种代谢产物：3,5,6-三氯-2-吡啶醇、磷酸二乙酯、硫代磷酸二乙酯；
[0011] (B)酶解：取冰冻尿样于室温下缓慢解冻，取10mL尿样于50mL离心管中，加入4mL HCl(6M)振荡，于80℃水浴条件下水解2h，2h后取出，降至室温；
[0012] (C)提取：尿样中加入10mL乙腈溶液，3g NaCl，涡旋混合1min后，离心分离，取上层5mL乙腈；
[0013] (D)净化与浓缩：将提取后的乙腈过自制净化小柱，上样完毕后，再以5mL乙腈洗脱，收集所有洗脱液，旋转蒸发至干，氮气吹干后，1mL乙腈定容，待测样品在-20℃的环境中避光保存，测试前加入内标磷酸二正丁酯；
[0014] (E)待测样品使用色谱－离串联质谱检测，色谱选择超高效液相色谱仪，色谱条件：色谱柱选择反相C18色谱柱，柱温为35℃，流动相A为0.2‰氨水，流动相B为乙腈，进样体积为2μL，质谱条件：电离方式电喷雾离子源，负离子模式，多反应离子监测(MRM)，离子源温度：500℃，离子喷雾电压：-4500V，气帘气(curtain gas,CUR)压力为35psi，喷雾气(ion source gas 1,GS1)压力为50psi，辅助加热气(ion source gas 2,GS2)压力为55psi。
[0015] 进一步地，在上述方案中，所述步骤(C)中的离心速度为8000r/min。
[0016] 进一步地，在上述方案中，所述步骤(D)中的自制净化小柱的配方为100mg PSA、50mg GCB、2g无水Na2SO4填充。
[0017] 进一步地，在上述方案中，所述步骤(E)中的流动相流速为0.3mL/min，梯度洗脱程序为：
[0018]时间(min) A(％) B(％)
0.00 99.0 1.0
2.00 99.0 1.0
3.00 70.0 30.0
10.0 5.0 95.0
13.0 5.0 95.0
13.1 99.0 1.0
15.0 99.0 1.0
[0019] 进一步地，在上述方案中，所述步骤(E)中的选择特征离子对分别为：3,5,6-三氯-2-吡啶醇：196.0/35.0(m/z)和198.0/35.0(m/z)；磷酸二乙酯：153.0/79.0(m/z)和153.0/
125.0(m/z)；硫代磷酸二乙酯：169.0/95.0(m/z)和169.0/141.0(m/z)。
[0020] 选择离子参数为：
[0021]
[0022] 所述的一种同时检测尿液中毒死蜱种代谢产物的方法所用的装置主要包括：主体和检测仪器，所述检测仪器为超高效液相色谱质谱联用仪；所述主体内包含电源装置、解冻装置、离心装置一、水浴装置、涡旋混合装置、离心装置二、净化装置、旋转蒸发装置、PLC控制器，所述电源装置位于所述主体的左侧，所述解冻装置、位于所述电源装置的后上方，所述离心装置一、离心装置二、净化装置、旋转蒸发装置依次从左至右位于主体内部，所述水浴装置位于离心装置一的前方，所述涡旋混合装置位于离心装置二的前方，所述PLC控制器位于主体的右上方，在所述解冻装置的后方设置有Hl存储装置，在主体的后侧上方从左至右依次设有乙腈存储装置、氮气存储装置、内标磷酸二正丁酯存储装置，所述解冻装置通过导管一连接至所述离心装置一，在所述导管一上设有流量控制阀一，所述Hl存储装置通过导管二连接至所述离心装置一，在所述导管二上设有流量控制阀二，所述离心装置一通过导管三连接至所述水浴装置，在所述导管三上设有流量控制阀三，所述水浴装置通过导管四连接至所述涡旋混合装置，在所述导管四上设有流量控制阀四，所述涡旋混合装置通过导管五连接至所述乙腈存储装置，在所述导管五上设有流量控制阀五，所述涡旋混合装置导管六连接至所述离心装置二，在所述导管六上设有流量控制阀六，所述离心装置二通过导管七连接至所述净化装置，所述导管七上设有流量控制阀七，所述净化装置通过导管八连接至所述乙腈存储装置，在所述导管八上设有流量控制阀八，所述旋转蒸发装置上设有旋转瓶、收集瓶、连接口一和连接口二，所述净化装置通过导管九连接至所述旋转蒸发装置的连接口一，在所述导管九上设有流量控制阀九，所述旋转蒸发装置上的连接口二通过导管十连接至所述氮气存储装置，在所述导管十上设有流量控制阀十，所述收集瓶通过导管十一连接至所述内标磷酸二正丁酯存储装置，在所述导管十一上设有流量控制阀十一，所述流量控制阀一、流量控制阀二、流量控制阀三、流量控制阀四、流量控制阀五、流量控制阀六、流量控制阀七、流量控制阀八、流量控制阀九、流量控制阀十、流量控制阀十一均通过各自的电磁继电阀和导线连接至所述PLC控制器，所述标磷酸二正丁酯存储装置通过导液管连接至所述色谱－离串联质谱检测仪，所述电源装置为所述解冻装置、离心装置一、水浴装置、涡旋混合装置、离心装置二、净化装置、旋转蒸发装置、PLC控制器提供电源。本装置非常适用于本发明的方法，二者配合使用效果非常好。
[0023] 进一步地，在上述方案中，所述解冻装置外侧设有加热装置，所述离心装置一底部设有旋转电机一，所述水浴装置底部设有水浴加热器，所述涡旋混合装置底部设有电动混合器，所述离心装置二底部设有旋转电机二，所述加热装置、旋转电机一、水浴加热器、电动混合器、旋转电机二均连接至所述电源装置，在所述电源装置上设有控制面板。所述PLC控制器是由由内部CPU，指令及资料内存、输入输出单元、电源模组、数字模拟等单元所模组化组合成。
[0024] 本发明的原理是：通过对尿液样品进行酶解、提取、净化与浓缩，对尿液中毒死蜱3种主要代谢产物进行提取富集，自制净化小柱显著降低尿液中色素、糖分、盐分等干扰；通过使用串联质谱利用两根四级质量分析器对目标化合物进行定量、定性分析，该系列方法抗背景干扰能力强、定性可靠、定量准确。
[0025] 结果：优化后的HPLC-MS/MS检测方法对毒死蜱3种代谢产物的的仪器检测限(3倍信噪比)为均为0.001mg/L，定量检测限均为0.005mg/L(10倍信噪比)，5点标准曲线相关系数(R2)在0.9916-0.9991之间，尿液中毒死蜱的加标回收率为80.3％～90.0％，能够满足定量分析的要求。其回收率结果如下：3,5,6-三氯-2-吡啶醇、磷酸二乙酯、硫代磷酸二乙酯；
[0026]
[0027]
[0028]
[0029] 本发明的有益效果是：本发明提供了一种同时检测尿液中毒死蜱3种代谢产物的液相色谱-质谱联用方法及装置，该方法是通过对尿液样品进行酶解、提取、净化与浓缩，对尿液中毒死蜱3种主要代谢产物进行提取富集，自制净化小柱显著降低尿液中色素、糖分、盐分等干扰；利用高效液相色谱/串联质谱(HPLC-MS/MS)的多反应监测技术(MRM)来解决以往常规检测器如UV-Vis、ECD、NPD等在检测复杂背景基质中痕量目标组分的选择性、灵敏度上存在的劣势，利用二级质谱的背景降噪功能大大简化了样品预处理步骤，提高了样品定性准确性，由于MRM技术能够兼具灵敏度与选择性的优点，定性结果准确可靠，同时准确测定尿液中毒死蜱3种主要代谢产物。
[0030] 采用本发明的装置具有简洁快速的优点，解决了现有实验室中设备不齐全，或者操作程序复杂的问题，能够一次性快速得出结果，而且实现了智能化控制，可控性强，准确度高，减少误差，大大节约时间。
[0031] 采用本发明优化后的方法较常规检测方法有更好的选择性和更高的灵敏度，此种二级质谱检测技术在毒死蜱人体尿液中3种代谢产物定性上具有显著优势，可以通过简单快速的批量前处理方法，快速定量检测尿液中毒死蜱3种主要代谢产物浓度的需求，大大提高了检测的有效性和可靠性，节省了检测时间和检测费用。
附图说明
[0032] 图1为本发明所用装置的结构示意图；
[0033] 图2为毒死蜱3种代谢产物及内标标准色谱图(3,5,6-三氯-2-吡啶醇：TCPyr、磷酸二乙酯：DEP、硫代磷酸二乙酯：DETP、磷酸二正丁酯：DBP)；
[0034] 图3为空白尿样色谱图；
[0035] 图4为加标尿样色谱图(3,5,6-三氯-2-吡啶醇：TCPyr、磷酸二乙酯：DEP、硫代磷酸二乙酯：DETP、磷酸二正丁酯：DBP)；
[0036] 图5为实际尿样典型色谱图(3,5,6-三氯-2-吡啶醇：TCPyr、磷酸二乙酯：DEP、硫代磷酸二乙酯：DETP、磷酸二正丁酯：DBP)。
[0037] 其中，1-主体、2-电源装置、3-解冻装置、4-离心装置一、5-水浴装置、6-涡旋混合装置、7-离心装置二、8-净化装置、9-旋转蒸发装置、10-PLC控制器、11-HCl存储装置、12-乙腈存储装置、13-氮气存储装置、14-内标磷酸二正丁酯存储装置、15-导液管、16-导管一、17-导管二、18-导管三、19-导管四、20-导管五、21-导管六、22-导管七、23-导管八、24-导管九、25-导管十、26-导管十一、27-流量控制阀一、28-流量控制阀二、29-流量控制阀三、30-流量控制阀四、31-流量控制阀五、32-流量控制阀六、33-流量控制阀七、34-流量控制阀八、
35-流量控制阀九、36-流量控制阀十、37-流量控制阀十一、38-导线、2a-控制面板、3a-加热装置、4a-旋转电机一、5a-水浴加热器、6a-电动混合器、7a-旋转电机二、9a-旋转瓶、9b-收集瓶、9c-连接口一、9d-连接口二。
具体实施方式
[0038] 以下通过实施例结合附图来进一步说明本发明。本发明的保护范围并不仅仅限于本实施例。
[0039] 实施例1：
[0040] (1)标准曲线配制：
[0041] 准确称取毒死蜱代谢产物标样及内标(DBP)(Dr.Ehrenstorfer GmbH,Germany)0.01±0.0001g至10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得浓度为1000mg/L的TCPyr、DEP、DETP及内标DBP标准储备溶液。并用乙腈稀释，配制得到浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、
0.20mg/L的工作溶液。
[0042] (2)仪器分析条件：
[0043] 仪器色谱条件：所述超高效液相色谱为Agilent公司的1290Infinity；色谱柱选择Agilent反相C18色谱柱(ZORBAX Eclipse Plus C18 3.5μm，2.1×150mm，Agilent)，柱温为35℃，流动相A为0.2‰氨水，流动相B为乙腈，流速为0.3mL/min，进样体积为2μL；流动相梯度为：
[0044]时间(min) A(％) B(％)
0.00 99.0 1.0
2.00 99.0 1.0
3.00 70.0 30.0
10.0 5.0 95.0
13.0 5.0 95.0
13.1 99.0 1.0
15.0 99.0 1.0
[0045] 质谱条件：电离方式电喷雾离子源，负离子模式，多反应离子监测(MRM)，离子源温度：500℃，离子喷雾电压：-4500V，气帘气(curtain gas,CUR)压力为35psi，喷雾气(ion source gas 1,GS1)压力为50psi，辅助加热气(ion source gas 2,GS2)压力为55psi。选择离子参数为：
[0046]
[0047] (3)标准曲线绘制：
[0048] 在上述色谱条件下进样分析，3,5,6-三氯-2-吡啶醇、磷酸二乙酯和硫代磷酸二乙酯的保留时间，线性方程相关系数。线性方程中y：代表毒死蜱代谢物的峰面积与内标磷酸二正丁酯的峰面积比。
[0049]
[0050] 并由此确定，3种毒死蜱代谢产物的仪器检出限(LOD)为0.001mg/L，仪器定量限(LOQ)为0.005mg/L。
[0051] 实施例2：
[0052] 一种同时检测尿液中毒死蜱3种代谢产物的方法，包括以下步骤：
[0053] (A)目标化合物选择毒死蜱的3种代谢产物：3,5,6-三氯-2-吡啶醇、磷酸二乙酯、硫代磷酸二乙酯；
[0054] (B)称取6份空白尿样品，每份尿样品10.0mL(±0.01mL)，平均分成两组，分别添加0.01mg/kg、0.050mg/kg、0.20mg/L的毒死蜱代谢产物标准溶液，按上述样品前处理方法：加入4mL HCl(6M)振荡，于80℃水浴条件下水解2h。2h后取出，降至室温。
[0055] (C)提取：尿样中加入10mL乙腈溶液，3g NaCl，涡旋混合1min后，以8000r/min离心分离，取上层5mL乙腈；
[0056] (D)净化与浓缩：将提取后的乙腈过自制净化小柱，该自制净化小柱的配方为100mg PSA、50mg GCB、2g无水Na2SO4填充，上样完毕后，再以5mL乙腈洗脱，收集所有洗脱液，旋转蒸发至干，氮气吹干后，1mL乙腈定容，待测样品在-20℃的环境中避光保存，测试前加入内标磷酸二正丁酯；
[0057] (E)仪器分析条件：
[0058] 仪器色谱条件：所述超高效液相色谱为Agilent公司的1290Infinity；色谱柱选择Agilent反相C18色谱柱(ZORBAX Eclipse Plus C18 3.5μm，2.1×150mm，Agilent)，柱温为35℃，流动相A为0.2‰氨水，流动相B为乙腈，流速为0.3mL/min，进样体积为2μL；流动相梯度为：
[0059]时间(min) A(％) B(％)
0.00 99.0 1.0
2.00 99.0 1.0
3.00 70.0 30.0
10.0 5.0 95.0
13.0 5.0 95.0
13.1 99.0 1.0
15.0 99.0 1.0
[0060] 质谱条件：电离方式电喷雾离子源，负离子模式，多反应离子监测(MRM)，离子源温度：500℃，离子喷雾电压：-4500V，气帘气(curtain gas,CUR)压力为35psi，喷雾气(ion source gas 1,GS1)压力为50psi，辅助加热气(ion source gas 2,GS2)压力为55psi。选择离子参数为：
[0061]
[0062] 结果显示，尿样中毒死蜱代谢产物添加浓度为0.01～0.2mg/kg时，回收率为80.3％～90..0％，相对标准偏差1.20％～6.47％。
[0063] 实施例3：
[0064] (A)目标化合物为3,5,6-三氯-2-吡啶醇、磷酸二乙酯和硫代磷酸二乙酯；
[0065] (B)样品采集：采样时间为2016年9月2日，采样地点为南京市高淳区桠溪镇，受试尿样来自于儿童；
[0066] (C)酶解：取冰冻尿样于室温下缓慢解冻，取10mL尿样于50mL离心管中，加入4mL HCl(6M)振荡，于80℃水浴条件下水解2h，2h后取出，降至室温；
[0067] (D)提取：尿样中加入10mL乙腈溶液，3g NaCl，涡旋混合1min后，离心分离后，取上层5mL乙腈；
[0068] (E)净化与浓缩：将提取后的乙腈过自制净化小柱，上样完毕后，再以5mL乙腈洗脱，收集所有洗脱液，旋转蒸发至近干，氮气吹干后，1mL乙腈定容，待测样品在-20℃的环境中避光保存，测试前加入内标磷酸二正丁酯，样品使用高效液相色谱串联质谱法进行测定，测定条件如下：
[0069] 仪器色谱条件：所述超高效液相色谱为Agilent公司的1290Infinity；色谱柱选择Agilent反相C18色谱柱(ZORBAX Eclipse Plus C18 3.5μm，2.1×150mm，Agilent)，柱温为35℃，流动相A为0.2‰氨水，流动相B为乙腈，流速为0.3mL/min，进样体积为2μL；流动相梯度为：
[0070]时间(min) A(％) B(％)
0.00 99.0 1.0
2.00 99.0 1.0
3.00 70.0 30.0
10.0 5.0 95.0
13.0 5.0 95.0
13.1 99.0 1.0
15.0 99.0 1.0
[0071] 质谱条件：电离方式电喷雾离子源，负离子模式，多反应离子监测(MRM)，离子源温度：500℃，离子喷雾电压：-4500V，气帘气(curtain gas,CUR)压力为35psi，喷雾气(ion source gas 1,GS1)压力为50psi，辅助加热气(ion source gas 2,GS2)压力为55psi。选择离子参数为：
[0072]
[0073] 检测结果显示，该儿童尿液中3,5,6-三氯-2-吡啶醇浓度为15.41μg/g，磷酸二乙酯浓度为7.62μg/g，硫代磷酸二乙酯浓度为4.36μg/g。
[0074] 上述实施例1-3所用的装置主要包括：主体1和检测仪器39，检测仪器39为超高效液相色谱质谱联用仪，选自Agilent公司的1290Infinity+AB Sciex公司的QTRAP 4500，主体1内包含电源装置2、解冻装置3、离心装置一4、水浴装置5、涡旋混合装置6、离心装置二7、净化装置8、旋转蒸发装置9、PLC控制器10，电源装置2位于主体1的左侧，解冻装置3、位于电源装置2的后上方，离心装置一4、离心装置二7、净化装置8、旋转蒸发装置9依次从左至右位于主体1内部，水浴装置5位于离心装置一4的前方，涡旋混合装置6位于离心装置二7的前方，PLC控制器10位于主体1的右上方，在解冻装置3的后方设置有HCl存储装置11，在主体1的后侧上方从左至右依次设有乙腈存储装置12、氮气存储装置13、内标磷酸二正丁酯存储装置14，解冻装置3通过导管一16连接至离心装置一4，在导管一16上设有流量控制阀一27，HCl存储装置11通过导管二17连接至离心装置一4，在导管二17上设有流量控制阀二28，离心装置一4通过导管三18连接至水浴装置5，在导管三18上设有流量控制阀三29，水浴装置5通过导管四19连接至涡旋混合装置6，在导管四19上设有流量控制阀四30，涡旋混合装置6通过导管五20连接至乙腈存储装置12，在导管五20上设有流量控制阀五31，涡旋混合装置6导管六21连接至离心装置二7，在导管六21上设有流量控制阀六32，离心装置二7通过导管七22连接至净化装置8，导管七22上设有流量控制阀七33，净化装置8通过导管八23连接至乙腈存储装置12，在导管八23上设有流量控制阀八34，旋转蒸发装置9上设有旋转瓶9a、收集瓶9b、连接口一9c和连接口二9d，净化装置8通过导管九24连接至旋转蒸发装置9的连接口一9c，在导管九24上设有流量控制阀九35，旋转蒸发装置9上的连接口二9d通过导管十25连接至氮气存储装置13，在导管十25上设有流量控制阀十36，收集瓶9b通过导管十一26连接至内标磷酸二正丁酯存储装置14，在导管十一26上设有流量控制阀十一37，流量控制阀一27、流量控制阀二28、流量控制阀三29、流量控制阀四30、流量控制阀五31、流量控制阀六32、流量控制阀七33、流量控制阀八34、流量控制阀九35、流量控制阀十36、流量控制阀十一
37均通过各自的电磁继电阀和导线38连接至PLC控制器10，标磷酸二正丁酯存储装置14通过导液管15连接至检测仪器39，电源装置2为解冻装置3、离心装置一4、水浴装置5、涡旋混合装置6、离心装置二7、净化装置8、旋转蒸发装置9、PLC控制器10提供电源。解冻装置3外侧设有加热装置3a，离心装置一4底部设有旋转电机一4a，水浴装置5底部设有水浴加热器5a，涡旋混合装置6底部设有电动混合器6a，离心装置二7底部设有旋转电机二7a，加热装置3a、旋转电机一4a、水浴加热器5a、电动混合器6a、旋转电机二7a均连接至电源装置2，在电源装置2上设有控制面板2a。
[0075] 3,5,6-三氯-2-吡啶醇、磷酸二乙酯、硫代磷酸二乙酯的回收率结果如下：
[0076]
[0077]
[0078]
[0079] 结果表明：优化后的HPLC-MS/MS检测方法对毒死蜱3种代谢产物的的仪器检测限(3倍信噪比)为均为0.001mg/L，定量检测限均为0.005mg/L(10倍信噪比)，5点标准曲线相关系数(R2)在0.9916-0.9991之间，尿液中毒死蜱的加标回收率为80.3％～90.0％，能够满足定量分析的要求。
[0080] 最后应该说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
