一种评价肾脏功能的试剂盒

摘要

本发明提供了一种评价肾脏功能的试剂盒。本发明采集了892名中国健康成年人的生物学数据，采用相关性分析和多元线性回归模型筛选得到了肾脏衰老可能的标志物——干细胞因子SCF，并分析血清SCF浓度在不同年龄段、不同性别之间的变化。随后在随访中，对其中的289名研究对象的eGFR和SCF变化关系进行了纵向分析，结果发现随着年龄增加，肾脏逐步衰老的同时，血清SCF浓度也逐渐升高，SCF和衰老过程中的肾脏功能变化密切相关，间接反映出衰老肾脏功能的变化，可作为评价肾脏衰老的良好指标。

权利要求

1.干细胞因子在制备评价人类肾脏功能或评价肾脏衰老程度的试剂盒中的应用，随着血清中干细胞因子浓度越高，肾脏功能逐渐越低或肾脏衰老程度逐渐增大，其中<50岁，SCF均值为1083.88pg/mL，标准差232.02pg/mL；50≤CA<60岁SCF均值为1141.02pg/mL，标准差

253.95 60≤CA<70SCF均值1220.51 246.85pg/mL；≥70岁SCF均值1352.59pg/mL，标准差

317.18pg/mL。

2.用以检测干细胞因子在血清中浓度的生物试剂在制备评价人类肾脏功能或评价肾脏衰老程度的试剂盒中的应用，干细胞因子的浓度越高，则肾脏功能越低或肾脏衰老程度越大，并且<50岁，SCF均值为1083.88pg/mL，标准差232.02pg/mL；50≤CA<60岁SCF均值为

1141.02pg/mL，标准差253.95 60≤CA<70SCF均值1220.51 246.85pg/mL；≥70岁SCF均值

1352.59pg/mL，标准差317.18pg/mL。

说明书

一种评价肾脏功能的试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，具体地，涉及一种以干细胞因子为检测靶标的评价肾脏功能或衰老程度的试剂盒。

背景技术

[0002] 随着人类年龄增加，肾脏发生了一系列的结构变化，如肾小球血管粥样硬化增加、间质纤维化加重、肾小管萎缩等等，随之肾脏功能逐步减退。临床实践中常使用eGFR来评价肾脏功能，但现有的eGFR公式对老龄人群的GFR估算存在偏差，目前也并没有评价肾脏衰老的有效指标。科研工作者对肾脏功能在衰老过程中的变化仍知之甚少，或许因为现在并没有发现适合老年人肾脏功能评价的理想eGFR公式。临床常用的eGFR计算公式有Cockcroft–Gault公式(Cockcroft–Gault formula，CG),肾脏病饮食改良研究简化公式(Modification of Diet in Renal Disease formula,MDRD)以及CKD-EPI公式，其中MDRD和CKD-EPI公式均经过严谨的推导和验证，并被众多临床实践指南所推荐。与MDRD公式相比，CKD-EPI公式更为常用，同时其有效性和准确性已在大样本、多种族人群中得以验证，本申请在研究中选用的即是CKD-EPI公式。

[0003] 干细胞因子(stem cell factor，SCF)也称为kit配体(kitligand,KITLG)或青灰因子(steel factor,SF)，主要来源于角质形成细胞，是是酪氨酸激酶c-kit受体的配体，通过与c-kit受体结合能激活多种信号传导通路，已有研究报道，SCF通过激活干细胞、粒细胞、肥大细胞等可触发炎症反应和器官纤维化。SCF有可溶性和细胞膜性两种存在形式，两者均具有生物活性，可与c-kit受体结合。细胞膜SCF在蛋白水解酶的分解下可以变为可溶性SCF，目前对两种形式的转换关系知之甚少，有些学者推测两种存在形式之间的比例失衡可能是某些疾病发生的关键因素。但SCF是否与肾脏衰老相关仍不清楚。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于证实SCF与肾脏的衰老相关，提供一种用于评价肾脏功能或肾脏衰老程度的试剂盒。

[0005] 本发明经过大量试验研究发现青年-老年小鼠连体后，老年小鼠的肾脏功能好转，呈现年轻化的趋势，同时连体老年小鼠的血清SCF水平显著降低，因此SCF可能参与到肾脏衰老中。肾脏衰老的一大主要特征就是纤维化增加，申请人发现，随着年龄增加，肾脏逐步衰老的同时，血清SCF浓度也逐渐升高。因此推断，SCF可能通过反映肾脏纤维化的程度，间接反映出衰老肾脏功能的变化。经过试验验证，SCF能够作为评价肾脏衰老程度的新指标。

[0006] 进一步地，本发明提供一种评价肾脏功能的生物标志物，其为干细胞因子(SCF)。

[0007] 本发明提供了干细胞因子在作为评价肾脏功能或评价肾脏衰老程度的生物标志物中的应用。

[0008] 本发明提供了干细胞因子在制备评价肾脏功能或评价肾脏衰老程度的试剂盒中的应用。

[0009] 上述应用，是随着血清中干细胞因子浓度越高，肾脏功能逐渐越低或肾脏衰老程度逐渐增大。

[0010] 本发明还提供了用以检测干细胞因子的生物试剂在制备评价肾脏功能或评价肾脏衰老程度的试剂盒中的应用。

[0011] 应当理解，凡是能够用于检测干细胞因子浓度变化的生物试剂在制备评价肾脏功能或评价肾脏衰老程度的试剂盒中的用途都应当属于本发明的保护范围。

[0012] 上述的应用，其判断标准是生物试剂检测血清中干细胞因子，干细胞因子的浓度越高，则肾脏功能越低或肾脏衰老程度越大。

[0013] 本发明提供了一种以干细胞因子为检测靶标的评价肾脏功能或评价肾脏衰老程度的试剂盒。

[0014] 本发明提供了一种评价肾脏功能或评价肾脏衰老程度的试剂盒，含有以干细胞因子为检测靶标的生物试剂。

[0015] 上述试剂盒其检测对象为血清或尿液。

[0016] 上述试剂盒其评价标准为，干细胞因子浓度越高，肾脏功能逐渐越低或肾脏衰老程度逐渐增大。根据本发明的实验总结如下：<50岁，SCF均值为1083.88pg/mL，标准差232.02pg/mL；50≤CA<60岁SCF均值为1141.02pg/mL，标准差253.95 60≤CA<70SCF均值
1220.51246.85pg/mL；≥70岁SCF均值1352.59pg/mL，标准差317.18pg/mL。

[0017] 本发明采集了892名中国健康成年人的生物学数据，采用相关性分析和多元线性回归模型筛选得到了肾脏衰老可能的标志物——干细胞因子SCF，并分析血清SCF浓度在不同年龄段、不同性别之间的变化。随后在随访中，对其中的289名研究对象的eGFR和SCF变化关系进行了纵向分析，结果发现随着年龄增加，肾脏逐步衰老的同时，血清SCF浓度也逐渐升高，血清SCF和eGFR呈负相关，SCF越高eGFR越低，SCF升高的人群eGFR更容易降低，说明SCF和衰老过程中的肾脏功能变化密切相关，间接反映出衰老肾脏功能的变化，SCF可作为评价肾脏衰老的良好指标。

附图说明

[0018] 图1为基线研究289名研究对象年龄、性别分布，a图为年龄范围为22～86岁，62岁左右的研究对象数目最多，b图和c图分别为男性和女性的年龄分布图，d图为男性和女性性别比例图。

[0019] 图2为随访289名研究对象年龄、性别分布图，a图为年龄范围为29～85岁，66岁左右的研究对象数目最多，b图和c图分别为男性和女性的年龄分布图，d图为男性和女性比例图。

[0020] 图3为年龄、SCF和eGFR的关系散点图，在单因素线性回归中，年龄(a图，r＝–0.694，P<0.001)和血清SCF浓度(b图，r＝0.424，P<0.001)均与eGFR线性相关。

[0021] 图4为血清SCF浓度的性别、年龄差异图，各年龄组人数占总人数比例如图a所示。通过对男性和女性各年龄组SCF浓度进行比较发现SCF浓度随年龄增长而增加(图b)，但无性别差异；而eGFR随年龄增加而下降，存在性别差异，男性高于女性，**P<0.01。

[0022] 图5为基线和随访eGFR与年龄的关系图，除<50岁年龄组外，其余各年龄组的基线和随访eGFR数值有统计学差异(a)，而△eGFR无统计学差异(b)，c图中蓝色代表基线数据，红色代表随访数据，基线和随访eGFR均与年龄密切相关，随年龄增加而下降，**P<0.01，*P<0.05。

[0023] 图6为基线和随访SCF与年龄的关系图，各年龄组间基线和随访SCF均有统计学差异(a)，而△SCF无统计学差异(b)，c图中蓝色代表基线数据，红色代表随访数据，基线和随访SCF均与年龄密切相关，随年龄增加而升高，**P<0.01。

[0024] 图7为SCF和eGFR变化关系图，基线和随访的SCF均与eGFR线性相关(a)，SCF升高组的随访eGFR显著低于基线水平，而稳定组和降低组的基线和随访eGFR水平均无统计学差异(b)。在各年龄组中，eGFR降低人群所占的比例并无差异(c)。而60～70岁的人群中SCF升高的比例显著高于其余各年龄组(d)。

具体实施方式

[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

[0026] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明实施例中使用的干细胞因子检测试剂盒，R&D Systems,Minneapolis,USA。

[0027] 本研究已通过人民解放军总医院伦理委员会审核，所有研究对象均签署了知情同意书。研究涉及的健康人群是来自北京市区的社区人口。社区一般人群的选取的方法为分层随机抽样，首先在北京市每个行政区利用随机数表各选取两个社区，再根据社区的人口数量确定该社区的抽样人数，最后使用随机数表抽取实验对象。

[0028] 入选标准为：年满18岁；同意并签署知情同意书；近六个月内无高血压、中风、糖尿病、肿瘤、心衰、冠心病、周围血管疾病、精神异常、外伤、肾衰、呼吸系统疾病及传染病病史；具备一定的学习和认知能力；具备一定的社会交际能力。

[0029] 实施例1血清干细胞因子与肾脏功能变化的关联性研究

[0030] 1、方法

[0031] 1.1分组标准、与数据采集与体格检查

[0032] 2014年基线人群和2016年随访人群均根据基线年龄分为<50岁、50≤CA<60岁、60≤CA<70岁和≥70岁四组。本研究分别于2014年和2016年进行两次数据采集过程，采集范围涵盖了体格检查、血生化、尿常规、血清SCF浓度测定共4大类27个指标。记录研究对象的姓名、性别、年龄、联系方式等基本信息。要求研究对象脱去鞋和外衣，保持站立位，由研究者依次测量身高、体重、腰围、臀围，并记录数据，计算BMI和WHR。

[0033] 1.2血生化检测

[0034] 在研究对象空腹情况下抽取5ml静脉血于普通血清管中，送入临床生化检验科，检测指标包括：谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总蛋白、白蛋白、胆红素、Scr、尿素氮、血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血清尿酸。之后根据Scr数值带入慢性肾脏病流行病学协作组公布的eGFR公式：

[0035] eGFR(mL/min/1.73m2)＝a×(Scr/b)c×(0.993)age

[0036] 公式中a＝144(女性)或141(男性)；b＝0.7(女性)或0.9(男性)；当Scr≤0.7mg/dL时，c＝-0.329(女性)或-0.411(男性)，当Scr>0.7mg/dL时，c＝-1.209。

[0037] 1.3尿常规检测

[0038] 受试者留取第一次晨尿清洁中段尿10ml，送入临床检验科，检测指标包括：尿液颜色、酸碱度、尿比重、尿胆原、胆红素、尿白细胞、尿红细胞、尿蛋白、尿糖。

[0039] 1.4血清SCF浓度检测

[0040] 血清SCF浓度测定采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。(1)样本准备：在研究对象晨起空腹情况下抽取5ml静脉血于普通血清管中，之后放入低温离心机，4℃条件下1000g离心15分钟，吸取上层血清于冻存管中，取适量血清用于SCF的ELISA检测。(2)试剂配制：1)洗液：量取20mL Washing buffer(25×)加入到480mL蒸馏水中，配制500mL洗液；2)发光液：取显色液A和显色液B各10mL混合，避光保存，现配现用，配制后15分钟内使用；3)标准品：①2000pg/mL标准品：向标准品蛋白粉中加入1mL稀释液充分溶解，得到2000pg/mL标准品；②1000pg/mL标准品：取500μl 2000pg/mL标准品，加入到500μl稀释液中充分混合，得到1000pg/mL标准品；③500pg/mL标准品：取500μl 1000pg/mL标准品，加入到500μl稀释液中充分混合，得到500pg/mL标准品；④250pg/mL标准品：取500μl 500pg/mL标准品，加入到500μl稀释液中充分混合，得到250pg/mL标准品；⑤125pg/mL标准品：取500μl 250pg/mL标准品，加入到500μl稀释液中充分混合，得到125pg/mL标准品；⑥
62.5pg/mL标准品：取500μl 125pg/mL标准品，加入到500μl稀释液中充分混合，得到
62.5pg/mL标准品；⑦31.3pg/mL标准品：取500μl 62.5pg/mL标准品，加入到500μl稀释液中充分混合，得到31.3pg/mL标准品。(3)ELISA操作步骤：实验操作流程按照说明书严格进行，每个样本及标准品均做复孔检测。取100μl血清或标准品加入检测孔中，同时加入100μl一抗，室温下孵育2小时。倒掉样品和抗体，用事先配好的洗液洗板，每孔加入400μl洗液，震荡
40s，倒掉液体，重复三次，最后一次洗板后在干净的纸巾上拍去多余的洗液，尽量减少洗液残留。加入100μl二抗，室温下孵育2小时，之后重复以上洗板过程，最后一次洗板后，加入
200ul配好的发光液，室温下避光孵育30min。最后每孔加入50μl显色液，轻轻震荡混匀，放入酶标仪中检测，在450nm光下检测吸光光度值，630nm光下进行校正。(4)SCF浓度计算：用四参数法构建标准曲线，通过各样本的OD值计算SCF浓度，单位为pg/mL。

[0041] 1.5统计学分析

[0042] 数据的整理和分析均采用SPSS v20.0软件(IBM SPSS,West Grove,PA,USA)，所有数据均以“均数±标准差”表示，所有计量资料均以“均数标准差”表示，计数资料采用例数或构成比表示。我们同时根据基线数据和随访数据计算了SCF和eGFR的变化率，以SCF为例，SCF变化率，即△SCF＝(基线SCF-随访SCF)/基线SCF，同时定义变化范围在-1％～1％为稳定不变，-1％以下为降低，1％以上为升高。服从正态分布的计量资料相关性分析使用Pearson相关性分析法，不服从正态分布的计量资料采用Spearman相关性分析法。服从正态分布的计量资料，两组间均值比较采用独立样本t检验，多组间比较采用One-way ANOVA比较。P<0.05定义为有统计学意义。

[0043] 2、结果

[0044] 2.1入选人群

[0045] 在2014年，共1368名社区人口同意参加数据采集，其中：299人在过去6月内有既往病史；37人未通过体格检查；34人未成功留取血液样本；52人尿液样本留取失败；52人血生化和尿常规检查检查结果异常，2人的血清样本不符合SCF检测要求，最终892名社区健康人入选2014年研究，平均年龄59.0±13.4岁，其中男性357人，平均年龄58.9±13.5岁，女性535人，平均年龄59.1±13.4岁(图1)。在2016年随访中，有289人入选随访研究，其中男性
112人，平均年龄62.5±12.1岁，女性177人，平均年龄61.3±11.2岁(图2)。

[0046] 2.2健康人群eGFR和血清SCF浓度变化的横向分析

[0047] 2.2.1 eGFR和SCF密切相关

[0048] 2014年基线研究的892名研究对象的平均eGFR为91.64±18.03mL/min/1.73m2，相关性分析结果显示，年龄和SCF浓度与eGFR的相关性较高(|r|>0.30and P<0.05，表1)。其中，年龄和eGFR的相关系数最高(r＝–0.706,P<0.001)。

[0049] 表1各指标与eGFR相关性

[0050]

[0051]

[0052] 2.2.2血清SCF是肾脏衰老可能的生物学标志物

[0053] 使用多元线性回归模型来探索可能用于反映肾脏功能变化的生物学标志物。模型结果显示，SCF(β＝–0.011,P<0.001)和年龄(β＝–0.846,P<0.001)是评价eGFR变化的良好指标(表2)。图3的a和b分别为年龄和SCF与eGFR关系的散点图，三者的关系可以表示如下：

[0054] eGFR＝154.486-0.846×年龄-0.011×SCF。

[0055] 表2年龄、SCF和eGFR的多元线性回归分析结果

[0056]

[0057] 2.2.3血清SCF浓度有年龄差异而无性别差异

[0058] 将所有研究对象按照性别和年龄分组，其中<50岁组200人(男性90人，女性110人)，50～60岁组228人(男性73人，女性155人)，60～70岁组257人(男性116人，女性141人)，≥70岁组207人(男性75人，女性132人)，各年龄组比例如图4的a所示。单因素方差分析结果显示，无论男性还是女性，SCF浓度均在60～70和≥70岁组间有差异(P<0.05)，且这两组的SCF浓度分别高于<50岁组和60～70岁组(P<0.05)，呈现随年龄增加而上升的趋势，但独立样本t检验结果显示SCF浓度无性别差异(图4的b图)；同时eGFR数值在各年龄组之间均存在差异(P<0.05)，呈现随年龄增加而下降的趋势，独立样本t检验结果显示eGFR存在显著的性别差异(P<0.05)，男性eGFR高于女性(图4的c图)。

[0059] 2.3健康人群eGFR和血清SCF浓度变化的纵向分析

[0060] 2.3.1 SCF和eGFR均随年龄增长而显著变化

[0061] 共有289例研究对象进入纵向研究，随访人群的基线年龄为59.8±11.6岁。采用独立样本t检验对随访人群各指标的基线和随访数值进行比较，结果显示除年龄外，总蛋白、Scr、SCF和eGFR的数值在基线和随访时存在统计学差异(表3)。

[0062] 表3随访人群基线和随访数据比较

[0063]

[0064] 将随访人群按照年龄段分组，其中<50岁组51人，50～60岁组82人，60～70岁组90人，≥70岁组66人。分别比较各组基线和随访数据的eGFR和△eGFR。结果显示，除<50岁组外，其余各年龄组的基线和随访eGFR数值有统计学差异，随访eGFR较基线水平降低(P<0.05，图5的a图)，而△eGFR无统计学差异(P>0.05，图5的b图)。2014年基线eGFR与年龄的相关系数为-0.628，2016年随访eGFR与年龄的相关系数为-0.618，均与年龄密切相关(图5的c图)。则50岁以后eGFR随年龄增长呈逐步降低的趋势，根据我们的随访数据可知，eGFR下降的速率为2.84mL/年。

[0065] 再分别比较各年龄组基线和随访数据的SCF和△SCF。结果显示，各年龄组的基线和随访SCF均有统计学差异，随访SCF较基线水平升高(图6的a图)，而△SCF在四个年龄组间均无统计学差异(P>0.05，图6的b图)。2014年基线SCF与年龄的相关系数为0.312，2016年随访SCF与年龄的相关系数为0.301，均与年龄密切相关(图6的c图)。则SCF随年龄增长呈升高的趋势，根据我们的随访数据可知，SCF增加的速率为114.10pg/年。

[0066] 2.3.2 SCF随eGFR降低而升高

[0067] 分别计算基线和随访时各指标与eGFR的相关系数，结果显示年龄、Scr和SCF在基线和随访时均与eGFR有较高的相关性(|r|>0.30and P<0.05)，血清尿酸仅在2016年随访时与eGFR相关性较高，而在基线时与eGFR相关系数较低(表4)。SCF与eGFR的一元回归关系如图7的a所示，eGFR每降低1mL/min/1.73m2，SCF升高40.18pg/mL。

[0068] 表4随访人群基线和随访各指标与eGFR相关系数比较

[0069]

[0070]

[0071] 定义△SCF在-1％以下为SCF降低组，-1％～1％为SCF稳定不变组，在1％以上为SCF升高组，其中SCF降低组68人，基线eGFR为93.80±14.53mL/min/1.73m2，随访eGFR为87.44±18.91mL/min/1.73m2；SCF稳定不变组有13人，基线eGFR为92.02±18.91mL/min/
1.73m2，随访eGFR为88.67±20.48mL/min/1.73m2；SCF升高组有208人，基线eGFR为90.48±
17.30mL/min/1.73m2，随访eGFR为83.96±17.82mL/min/1.73m2。SCF升高组的基线和随访eGFR水平有统计学差异(P<0.05)，随访eGFR显著低于基线水平，而SCF稳定不变组和降低组的基线和随访eGFR无差异(图7的b图)。

[0072] 同时定义△eGFR在-1％以下为eGFR降低组，-1％～1％为eGFR稳定不变组，在1％以上为eGFR升高组，其中eGFR降低组221人，稳定不变组22人，eGFR升高组46人。在<50岁组中，eGFR降低的人数为37人，占该组总人数72.6％；50～60岁组中，eGFR降低的人数为63，占该组总人数76.8％；60～70岁组中，eGFR降低的人数为90，占该组总人数78.9％；≥70岁组中，eGFR降低的人数为66，占该组总人数75.8％(图7的c图)。

[0073] 在<50岁组中，SCF升高的人数为36人，占该组总人数70.6％；50～60岁组中，SCF升高的人数为58，占该组总人数70.7％；60～70岁组中，SCF升高的人数为68，占该组总人数75.6％；≥70岁组中，SCF升高的人数为46，占该组总人数69.7％(图7的d图)。因此，处于60～70岁年龄段的人群，SCF升高的比例更大。

[0074] 上述结果说明，随着年龄增加，肾脏逐步衰老的同时，血清SCF浓度也逐渐升高，血清SCF和eGFR呈负相关，SCF越高eGFR越低，SCF升高的人群eGFR更容易降低，说明SCF和衰老过程中的肾脏功能变化密切相关，间接反映出衰老肾脏功能的变化，SCF可作为评价肾脏衰老的良好指标。不同年龄段SCF正常范围如下表5所示。

[0075] 表5不同年龄段SCF正常值

[0076]

[0077] 本领域技术人员可以根据本发明的内容，设计检测SCF浓度的试剂盒用于评价肾脏的功能或衰老程度，这是基于本发明的内容可以显而易见实现的。因此基于本发明内容延伸得到的检测SCF的试剂盒属于本发明的保护范畴。

[0078] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。