合成的双表位化合物

摘要

本发明涉及式I的双表位化合物：其中：‑E1和E2相同或不同，各自独立地表示包含分析物的至少一个表位的肽序列；X和Y相同或不同，各自独立地表示连接臂，‑载体分子是可溶的，并且‑Z表示在其与载体分子键合之前具有硫醇官能团的氨基酸衍生物。它还涉及含有该化合物的组合物，以及这种化合物或含有该化合物的组合物作为免疫测定中的对照或标准的用途，使用该化合物或含有该化合物的组合物作为对照或标准的方法，以及最后包含该化合物或含有该化合物的组合物用于实施免疫测定的试剂盒。

权利要求

1.一种模拟心肌肌钙蛋白I的双表位化合物，所述双表位化合物为式(I)：其中：

‑E1为ATEPHAKKK或KISASRKLQLKT；

‑E2为AGLGFAELQDL；

‑X和Y可以相同或不同，各自独立地表示连接臂，X和Y为8‑氨基‑3,6‑二氧杂辛酸的二聚体，或X和Y均独立地选自序列SGGG和序列GGGS；

‑所述载体分子为可溶的，且所述载体分子选自BSA和IgG；

‑Z表示半胱氨酸。

2.如权利要求1所述的式(I)的双表位化合物，其中：‑E1选自ATEPHAKKK和KISASRKLQLKT‑E2为AGLGFAELQDL，‑X和Y为8‑氨基‑3,6‑二氧杂辛酸的二聚体，和‑所述载体分子为BSA。

3.如权利要求1所述的式(I)的双表位化合物，其中：‑E1为ATEPHAKKK，‑E2为AGLGFAELQDL，‑X和Y为8‑氨基‑3,6‑二氧杂辛酸的二聚体，和‑所述载体分子为IgG。

4.如权利要求1所述的式(I)的双表位化合物，其中：‑E1为ATEPHAKKK，‑E2为AGLGFAELQDL，‑X为GGGS，

‑Y为SGGG，和

‑所述载体分子为BSA。

5.一种双表位化合物，所述双表位化合物为式(I)：其中：

‑E1为QAEDDPLQAK，‑E2为WTGVLSPTQEYR，‑X和Y为8‑氨基‑3,6‑二氧杂辛酸的二聚体，‑所述载体分子为BSA，和Z表示半胱氨酸。

6.一种用于实施免疫测定的试剂盒，其包含如权利要求1至5中任一项定义的式(I)的双表位化合物。

说明书

合成的双表位化合物

技术领域

[0001] 本发明涉及诊断或预后领域。特别地，本发明涉及在免疫测定的实施期间使用的合成的双表位化合物。

背景技术

[0002] 免疫测定通常用于临床、食物、药物和化学分析领域中。因此，它们的目的是确定在可以含有这些分析物的样品中以蛋白质(抗原/抗体)、肽或半抗原(例如类固醇或维生素)形式的大量分析物的存在。免疫测定是本领域技术人员众所周知的测试，其涉及待检测分析物与关于该分析物的一种或多种结合配偶体之间的免疫反应。作为这样的免疫测定的例子，可以提及可以根据“夹心”原理或根据“竞争”原理操作的方法，例如ELISA(酶联免疫吸附测定)、ELFA(酶联荧光测定)和RIA(放射免疫测定)，以及免疫检测方法例如免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫荧光、蛋白质印迹和斑点印迹。“竞争”方法通常用于小分子如半抗原，“夹心”方法用于其他分析物。

[0003] 特别是在生物测试实验室进行的这些免疫测定除测试所需的试剂(例如结合配偶体、显色剂或稀释溶液)之外，还要求制造商提供测试的阳性对照，所述阳性对照通常在类似于待研究的样品的测试条件下同时使用，作用于验证免疫测定是否已正确进行。如果确实发现阳性对照是阳性的，则测试结果被验证并可以被解释。如果发现阳性对照不是阳性的，则这指示免疫测定的实施未符合预期发生。无效的测试结果不应该被解释，并且分析应该重新开始。

[0004] 关于在可能含有所述分析物的生物样品中通过免疫测定的分析物定量，除测试所需的上述试剂和阳性对照之外，还要求使用标准曲线。所述曲线通过下述得到：i)通过测量由标准(也称为校准物)生成的信号，所述信号对应于分析物或在所使用的免疫测定中具有与分析物的相同抗原反应性的化合物的增加和已知的量或浓度，ii)然后绘制以量或浓度作为函数给出信号的曲线。通常找到数学模型是标准实践，所述数学模型尽可能地可靠地表示信号与量或浓度之间的关系，以便能容易地计算定量免疫测定的结果。

[0005] 为了实现这点，对照或标准溶液必须模拟通过免疫测定中使用的结合配偶体所寻求且以相同方式被识别的分析物。因此，如果免疫测定的方法是夹心法，则对照或标准溶液必须包含具有用于识别所使用的两种结合配偶体的两个表位的化合物。然后使用术语“双表位化合物”。

[0006] 双表位化合物的两个表位是相同的这不是不可能的。当待检测或定量的分析物是多聚体(至少是二聚体)时，能够在夹心免疫测定的捕获和检测中使用相同的结合配偶体。在这种情况下，双表位化合物将含有两倍的相同表位。

[0007] 通常用于免疫测定测试中的对照或标准溶液可具有人或动物起源，并且可以含有如此天然状态下的分析物。这些溶液由冷冻干燥产物制备，并且以单位剂量冷冻并在20℃或80℃下贮存。这种贮存不适合于流体实验室实践。此外，这些冻干的对照或标准溶液需要再溶解，以使其能够被使用。然而，在免疫测定的背景下，测试的实施必须是快速的，并且这种再溶解导致时间的损失。此外，这种再溶解的执行可以导致由于稀释偏差的测量误差。因此，特别推荐在+2/8℃下以液体形式贮存的即用型对照或标准溶液，这是为了方便起见的明显原因。然而，为了代表测定的实际条件，这些即用型对照或标准溶液仅含有低浓度的分析物，例如约1pg/ml、1ng/ml 或1μg/mL，取决于相关分析物的测量范围，这导致其在+2/8℃的温度下的稳定性受到影响。因此，为了克服这个缺点，已使用合成标准。

[0008] 欧洲专利申请EP 0 650 053A描述了通过树枝状结构彼此连接，含有一个或多个受体的活性位点的合成标准。该申请描述了更特异性的肌钙蛋白T 合成标准。然而，这些标准在溶液中的稳定时间在4℃下不超过3周。

[0009] 专利申请WO 98/24816就其本身而言提供了可以用作“夹心”免疫测定中的标准，用于测定肌钙蛋白I，并且稳定数月的合成双表位化合物。具有式 的所述化合物包含两个肽序列E1和E2，其包含最低限度的肌钙蛋白I表位，这些表位各自通过连接基团 彼此键合，所述连接基团 可以是包含1至40个氨基酸的中心肽。每个表位还可以在其末端处包含1至10个氨基酸的肽序列(Σ和Ψ)。然而，该专利申请中提出的解决方案具有以下缺点：为了与免疫测定中使用的结合配偶体充分免疫反应，所述双表位化合物必须具有显著数目的氨基酸，使得它们并不容易合成。此外，由于其独特的肽性质，在对照或标准溶液中需要大量化合物，以便与免疫测定中使用的结合配偶体具有最佳的免疫反应性，这对于含有这种对照或这种标准的试剂盒的制造商以及因此对于使用由此生产的试剂盒的实验室而言具有显著的成本。

[0010] 专利US 6 114 180就其本身而言提出了可以用作免疫测定中的对照或标准的合成化合物，其包括通过载体分子例如BSA彼此连接的两个肌钙蛋白I表位，目的是增加其在溶液中的溶解度和/或其稳定性。然而，该化合物的特殊构造使得它难以产生，并且引起与载体分子连接的两个表位之间的等摩尔性(equimolarity)的问题。

[0011] 申请人已令人惊讶地证明了用于“夹心”免疫测定中的合成化合物，其克服了现有技术中描述的缺点。实际上，它的合成是容易和简化的，它在+ 2/8℃下是稳定的，并且在低浓度下，它是可溶的，并且它显示出与免疫测定中使用的结合配偶体优异的免疫反应性。此外，如果化合物存在于对照或标准溶液中，为了与免疫测定中使用的结合配偶体具有最佳的免疫反应性，则它无需以大量使用。最后，根据本发明的化合物的构造无疑保证两个表位的等摩尔性。

发明内容

[0012] 因此，本发明的第一个主题是式(I)的双表位化合物：

[0013]

[0014] 其中：

[0015] ‑E1和E2可以相同或不同，各自独立地表示包含分析物的至少一个表位的肽序列，[0016] ‑X和Y可以相同或不同，各自独立地表示连接臂，

[0017] ‑载体分子是可溶的，和

[0018] ‑Z表示在其与载体分子键合之前具有硫醇官能团的氨基酸衍生物。

[0019] 本发明的另一个主题涉及在水、缓冲液或生物流体中的溶液中含有式I 化合物的组合物。

[0020] 另外一个主题涉及这种双表位化合物或含有该化合物的组合物作为免疫测定中的对照或标准或调节物的用途。

[0021] 本发明的另外一个主题涉及使用式I的双表位化合物或含有该化合物的组合物作为对照和/或标准或调节物的免疫测定方法。

[0022] 最后，本发明的最后一个主题是用于实施免疫测定的试剂盒，其包含式(I)的双表位化合物或含有这种化合物的组合物。

[0023] 申请人因此已针对所有期望开发出合成双表位化合物，这使得能够克服上述现有技术的所有缺点。本发明化合物具有下式(I)：

[0024]

[0025] 其中：

[0026] ‑E1和E2可以相同或不同，各自独立地表示包含分析物的至少一个表位的肽序列，[0027] ‑X和Y可以相同或不同，各自独立地表示连接臂，

[0028] ‑载体分子是可溶的，和

[0029] ‑Z表示在其与载体分子键合之前具有硫醇官能团的氨基酸衍生物。

具体实施方式

[0030] 本发明的化合物因此是双表位化合物。术语“双表位化合物”预期意指包含一种和相同分析物的两个表位的化合物，以便在夹心免疫测定中模拟所述分析物的抗原识别。当然，合成双表位化合物决不由与其模拟的分析物相同的序列组成。该合成化合物因此不对应于天然存在的氨基酸序列，例如蛋白质或蛋白质片段。在申请自始至终以明显和等同的方式，本发明化合物被称为双表位化合物、非天然双表位化合物、合成双表位化合物或非天然合成双表位化合物。

[0031] 术语“免疫测定”中的前缀“免疫”例如在本申请中不应被视为严格地指示结合配偶体必须是免疫学起源的配偶体，例如抗体或抗体片段。实际上，如本领域技术人员众所周知的，该术语更广泛地还用于指示其中结合配偶体不是免疫学起源/性质的配偶体的测试和方法，但由例如需要检测和/或定量的分析物的受体组成。无论其起源或性质如何，有关结合配偶体应该能够与所寻求的分析物结合，优选特异性结合。因此，已知实践是使用术语“ELISA测定”用于使用在严格意义上非免疫学的结合配偶体的测定，也广泛地被称为“配体结合测定”，而术语“免疫”包括在完全对应于首字母缩略词ELISA的术语中。为了清楚和一致的目的，术语“免疫”在本申请中用于指示使用适合与所寻求的分析物结合并且检测和/或定量后者(优选特异性地)的至少一种结合配偶体的任何生物学分析，甚至当所述结合配偶体在严格意义上不具有免疫学性质或起源时。

[0032] 夹心型免疫测定(或更简单的“夹心免疫测定”)使用称为“捕获结合配偶体”的第一结合配偶体来特异性结合所寻求的分析物，以及称为“检测结合配偶体”的第二结合配偶体，其被标记并且还预期与所寻求的分析物特异性结合，因此揭示捕获结合配偶体与分析物之间的结合，并且因此揭示分析物的存在。换言之，所寻求的分析物在所述第一结合配偶体和第二结合配偶体之间的“夹心”中，所述第一(“捕获”)结合配偶体一般相对于所寻求的分析物过量存在。捕获结合配偶体可以例如被固定在固体支持物上(通过共价键合、吸附或任何其他适当的方法)。

[0033] 表位也称为抗原决定簇，是可以被互补位识别的抗原的最小部分，所述互补位是抗体的可变部分。表位的结构与抗体的互补位互补。所涉及的结构可以是在线性表位(也称为顺序表位)的情况下的一级结构，或在构象表位(也称为非连续表位)的情况下的三级结构。

[0034] 线性表位的序列可以包含“保守”修饰，从特异性的角度来看，所述“保守”修饰不显著改变表位和抗体之间的结合。

[0035] 模拟表位是大分子，通常是肽，其模拟给定表位的三维结构。识别所述表位的抗体也能够识别和结合模拟该表位的模拟表位。在蛋白质性质的抗原的情况下，因此是线性的肽模拟表位通常用于模拟构象表位。根据本发明，构象表位可以用模拟表位替代。模拟表位也包括在本申请的范围内作为术语表位的替代物。

[0036] 当抗原具有蛋白质性质时，如通常的情况，线性表位和模拟表位对应于可变长度的肽序列。在线性表位的情况下，应该区分最小表位和最佳表位的概念。最小表位对应于由相应抗体特异性识别的最小尺寸的肽序列。当缺失所述肽序列的N末端或C末端的氨基酸时，抗体的结合不再可能，并且识别丧失。最小表位可以含有3至20个氨基酸，更经常为4至8个氨基酸。

[0037] 最佳表位对应于特异性识别相应抗体且对相应抗体具有最佳可能反应性(最强信号)的肽序列。它通常涉及长度6至30个氨基酸的肽序列。作为一般规则，最佳表位包含最小表位。在极少数情况下，最佳表位和最小表位可以合并。

[0038] 本发明的化合物是这样的，使得它含有包含分析物的至少一个表位的两个肽序列E1和E2。表述“包含分析物的至少一个表位的肽序列”预期意指肽序列至少由最小表位的氨基酸组成。根据本发明的一个实施方案，肽序列至多由最佳表位的氨基酸组成。当然，本领域技术人员知道，也可以在最佳表位的一侧或两侧添加1、2、3、4或5个额外的氨基酸，而对抗原识别没有太大的作用。这些额外的氨基酸也包括在定义中。

[0039] 这些肽序列的氨基酸可以是分析物的序列中天然发现的氨基酸，或者类似氨基酸。术语“类似氨基酸”预期意指其替代是在自然界中发生(即在氨基酸家族中发生)的保守取代的两个氨基酸。具体地，氨基酸一般分为4 个家族，即(1)酸性氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸，(2)碱性氨基酸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸，(3)非极性氨基酸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，以及(4)极性不带电氨基酸如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。例如，可以合理地预测，亮氨酸由异亮氨酸或缬氨酸、天冬氨酸由谷氨酸、苏氨酸由丝氨酸的分离取代、或者氨基酸由结构相关的另一种氨基酸的类似保守取代对生物活性或抗原性没有重大影响。参考本领域众所周知的Hopp/Woods和 Kyte‑Doolite图，本领域技术人员将容易地确定可以耐受变化的氨基酸。根据一个实施方案，肽序列的氨基酸是分析物中天然发现的氨基酸。根据另一个实施方案，肽序列E1或肽序列E2或两者都是模拟表位，并且因此肽序列的氨基酸占优势地不同于分析物中天然发现的氨基酸。

[0040] 术语“分析物”指示具有生物起源，包含在样品中，通过分析检测、鉴定和/或定量的物质。在广义上，它应该理解为指示其为一个或多个分析的对象的化学、生物学或生物化学物质。作为分析物的例子，可以提及蛋白质或肽。

[0041] 分析物将代表病理状况或微生物在培养基中的存在。术语“病理状况”预期意指由于通过众多因素例如环境(有传染性的)、遗传和/或生物因素引起的疾病，患者健康的任何受损状态。作为疾病的例子，可以提及由于微生物例如病毒、细菌或寄生虫(肝炎、败血症等)的传染病、自身免疫疾病、神经变性疾病、癌症(乳腺、前列腺、结肠等)、心血管疾病(心肌梗死等)等。然后将分析物与各种疾病相关联。作为分析物的例子，可以提及心肌肌钙蛋白I(其具有作为心肌梗死的分析物的用途)和作为结肠癌分析物的防御素原(prodefensin)‑A6。随后将更详细地描述这些分析物。根据一个实施方案，E1和E2是包含至少一个心肌肌钙蛋白I表位或防御素原‑A6表位的肽序列。

[0042] 中心原子团Z是在其与载体分子键合之前具有硫醇官能团的氨基酸衍生物。术语“氨基酸衍生物”预期意指与它与之键合的连接臂X和Y形成两个肽键‑CO‑NH‑的任何分子。为了实现这点，相应的氨基酸在其与连接臂X 或Y键合之前包含反应基团‑NH2和反应基团–COOH。在与连接臂X和Y 键合之后，氨基酸衍生物因此包含基团–NH‑和基团–CO‑。相应的氨基酸在其与载体分子键合之前还包含硫醇官能团(–SH)。这些原子团Z的例子包含半胱氨酸衍生物、高半胱氨酸衍生物和青霉胺衍生物。用于形成这些衍生物的相应氨基酸当然是半胱氨酸、高半胱氨酸和青霉胺，其为本领域技术人员已知的氨基酸。

[0043] 本发明化合物的两个连接臂X和Y彼此相同或不同。连接臂的特征在于它们各自形成两个肽键–CO‑NH‑的能力，一方面与E1或E2形成肽键，并且另一方面与中心原子团Z形成肽键。连接臂X和Y然后是包含基团–NH‑和基团–CO‑的氨基酸衍生物。为了实现这点，用于形成连接臂的化合物在其与肽序列E1或E2键合之前包含反应基团–NH2和反应基团–COOH。当然，连接臂可以包含其他基团，例如侧基，其像这样不是反应性的，或者不是反应性的，因为它们被本领域技术人员已知的保护基团保护，所述保护基团例如三苯甲基、叔丁基、叔丁基丁基醚苄基或苄酯基。连接臂可以由一种或多种化合物获得，在其涉及本发明的双表位化合物之前，所述化合物各自具有反应基团–COOH和反应基团–NH2。这些化合物将被称为“用于形成连接臂的单体”。

[0044] 用于形成连接臂的单体可以是本领域技术人员已知的，用于合成生物蛋白质所需的蛋白原性α‑氨基酸。这些蛋白原性α‑氨基酸可以是遗传编码的；在这种情况下，其中存在22种。普遍分布在所有生物中的20种蛋白原性α‑氨基酸是：L‑丙氨酸、L‑精氨酸、L‑天冬酰胺、L‑天冬氨酸、L‑半胱氨酸、L‑谷氨酸、L‑谷氨酰胺、L‑甘氨酸、L‑组氨酸、L‑异亮氨酸、L‑ 亮氨酸、L‑赖氨酸、L‑甲硫氨酸、L‑苯丙氨酸、L‑脯氨酸、L‑丝氨酸、L‑ 苏氨酸、L‑色氨酸、L‑酪氨酸和L‑缬氨酸。其他2种蛋白原性氨基酸罕见得多：L‑吡咯赖氨酸仅在某些产甲烷古细菌中发现，而L‑硒代半胱氨酸仅存在于氧化还原酶家族的某些酶中。

[0045] 除这22种遗传编码的氨基酸之外，还存在可以通过酶促修饰从上述获得的几十种其他生物氨基酸，例如L‑瓜氨酸、L‑焦谷氨酸、L‑鸟氨酸、L‑3,4‑ 二羟基苯丙氨酸、γ‑氨基丁酸和软骨藻酸。

[0046] 用于形成连接臂的单体也可以是假氨基酸，也称为人造氨基酸，即非生物氨基酸。在这种情况下，唯一的要求是该化合物包含两个官能团‑COOH 和–NH2。

[0047] 根据本发明的一个特定实施方案，可以相同或不同的连接臂X和Y各自包含一个或多个氨基酸衍生物(例如蛋白原性α‑氨基酸和/或生物氨基酸和/或假氨基酸)。连接臂可以由一至六个氨基酸，优选一至四个氨基酸制备。例如，连接臂可具有序列GGGS、或序列SGGG、或序列GSGSGS或序列SGSGSG。

[0048] 根据本发明的一个实施方案，式(I)中的X和Y，即在与E1/E2/Z形成肽键后，显示出下式(II)单体的一种或多种衍生物：

[0049] ‑NH‑R‑CO‑(II)

[0050] 其中R是独立地选自基团(‑C(R’)H‑C(R”)H、(‑C(R’)H‑C(R”)H‑O‑)、 (‑C(R’)H‑)和(‑C(R’)H‑O‑)的一个或多个基团，R’和R”独立地选自氢、羟基和C1‑C5烷基。根据一个实施方案，R由独立地选自(‑CH2‑CH2‑O‑)、(‑CH2‑O‑) 和(‑CH2‑)的一个或多个基团组成。根据一个特定实施方案，原子团R可以包含一至六个基团(‑CH2‑CH2‑O‑)，优选一至四个基团(‑CH2‑CH2‑O‑)。作为原子团R的非限制性例子，可以提及五氧杂十八烷酰基、四氧杂十五烷酰基、三氧杂十二烷酰基、三氧杂十一烷酰基、二氧杂辛酰基、氧杂戊酰基和六氧杂二十烷酰基(hexaoxaheneicosanoyl)及其衍生物。作为用于得到式(II)的单体衍生物的化合物的例子，可以提及8‑氨基‑3,6‑二氧杂辛酸 (CAS号：134978‑97‑5)，其为已知的假氨基酸。例如，连接臂可以是8‑ 氨基‑3,6‑二氧杂辛酸、(Ado)2或(Ado)3的二聚体或三聚体。

[0051] 作为原子团R的其他例子，可以提及以残基形式的上述生物氨基酸衍生物，即不含其‑COOH和–NH2基团但包含–NH‑基团和–CO‑基团。因此，例如，如果形成连接臂的化合物是式(CH3)2CH‑CH2‑CH(NH2)‑COOH的亮氨酸，则式(II)化合物的R为

[0052]

[0053] 每个连接臂在两个末端的–CO和–NH基团之间具有10至 优选20至 的尺寸，其构成本发明的一个特定实施方案。

[0054] 因为用于形成连接臂X和Y的单体在它们涉及本发明的双表位化合物之前具有反应基团–COOH和–NH2并且允许形成肽键，所以序列 E1‑X‑Z‑Y‑E2可以视为肽，以下称为双表位肽，使得它可以通过肽合成产生，其具有以下优点：

[0055] ‑容易、快速标准化、可重现和简化的合成，

[0056] ‑生产相对于E1和E2等摩尔的化合物。

[0057] 双表位肽根据本领域技术人员众所周知的程序，例如由Merrifield，1963 描述的固相肽合成获得。该技术的改进已经由Fields和Noble，1990综述和讨论。这样的合成使用第一C末端氨基酸与之附着的固相。在该背景下，加入以便形成肽的新氨基酸的每个‑NH2基团被Fmoc(9‑芴甲氧基羰基)或 Boc(叔丁氧羰基)型保护基团保护，以便促进由固相呈现的–NH2基团与加入的新氨基酸的–COOH基团之间的反应，如本领域技术人员众所周知的。

[0058] 根据本发明，双表位肽的长度不超过对应于100个氨基酸的长度，优选地，它不超过对应于20至30个氨基酸的长度，且更优先地，它不超过对应于25个至27个氨基酸的长度。

[0059] 双表位肽经由原子团Z与载体分子键合。载体分子具有稳定双表位化合物的作用，并且使得能够使包含所述双表位化合物的分析物的至少一个表位的肽序列E1和E2更可用，这同时保存E1和E2之间的等摩尔性。

[0060] 术语“载体分子”预期意指可以与肽偶联的任何可溶性分子。作为可溶性分子，可以提及蛋白质如牛血清白蛋白、免疫球蛋白G和甲状腺球蛋白，以及聚合物如聚赖氨酸。根据一个实施方案，载体分子是其分子量在20kDa 至700kDa之间，优选在60kDa至250kDa之间的蛋白质。

[0061] 聚赖氨酸是本领域技术人员已知的聚合物。它们例如从Sigma‑Aldrich 可获得。

[0062] 牛血清白蛋白和甲状腺球蛋白是本领域技术人员已知的。对于免疫球蛋白G，应这样选择使得它既不来自用于获得免疫测定的抗体的物种，也不来自待分析样品来源的物种，以便避免干扰问题。作为例子，可以提及兔、小鼠、马、山羊、猪等免疫球蛋白G(非详尽列表)。

[0063] 根据一个实施方案，载体分子是牛血清白蛋白。

[0064] 根据另一个实施方案，载体分子是免疫测定中的兔免疫球蛋白G，其中抗体来自小鼠，并且待分析的样品来自人类。

[0065] 根据本领域技术人员众所周知的方法，可以通过共价来产生在原子团Z 的水平上的双表位肽与蛋白质性质的载体分子之间的偶联。存在于原子团Z 的侧链中的巯基(‑SH)相对于马来酰亚胺、卤代乙酰基和吡啶基二硫基是反应性的。因此，在第一步中，载体分子应通过与摩尔过量的交联剂反应来活化，所述交联剂能够在载体分子的可接近的胺基(–NH2)的水平上反应，并且因此在载体分子的表面处引入选自马来酰亚胺或卤代乙酰基的反应基团。这些基团是优选的，因为它们能够经由稳定的硫醚键来获得偶联。在能够引入马来酰亚胺基团的交联剂中，可以非详尽地提及N‑(ε‑马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺酯、间马来酰亚胺基苯甲酰基‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基4‑(N‑马来酰亚胺基甲基)环己烷‑1‑羧酸酯、或磺基琥珀酰亚胺基4‑(N‑马来酰亚胺基甲基)环己烷‑1‑羧酸酯。在使得能够引入卤代乙酰基的交联剂中，可以非详尽地提及N‑琥珀酰亚胺基(4‑碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯和磺基琥珀酰亚胺基(4‑碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯。然后通过脱盐，例如通过凝胶过滤色谱法，或者通过透析，来纯化活化的载体分子，以去除过量的交联剂和副产物。最后，将活化的载体分子置于包含相对中心位置中的原子团Z的双表位肽的存在下。马来酰亚胺或卤代乙酰基与双表位肽的原子团Z的巯基(‑SH)反应，以便形成稳定的共价硫醚键。
马来酰亚胺和巯基之间的反应应该在接近中性pH(pH 6.5至7.5)的条件下进行，并且应该从反应缓冲液的组成中排除外来硫醇，例如大部分还原剂，以避免竞争偶联位点。卤代乙酰基和巯基之间的反应应在pH 7.2至9下进行。为了限制能够与酪氨酸、组氨酸和色氨酸反应的游离碘的生成，优选在黑暗下进行反应。本领域技术人员已知的这些方法例如在通过Shan S. Wong,CRC Press Inc.,Boca Raton,Florida,United States,1991的“Chemistry of Protein Conjugation and Cross‑linking”中描述。

[0066] 为了促进双表位肽在原子团Z上的偶联，如果连接臂X/Y和/或肽序列 E1/E2含有具有硫醇官能团的氨基酸衍生物，则对于所述肽的形成，可建议使用在该硫醇官能团的水平上被保护基团保护的氨基酸衍生物，所述保护基团在合成所述肽的步骤期间以及在与载体分子偶联的步骤期间是稳定的。因此，仅用于给出原子团Z的氨基酸将具有反应性硫醇官能团。为了避免保护臂X/Y和/或肽序列E1/E2的硫醇官能团的这种步骤，可建议X、 Y、E1和E2都不含有具有硫醇官能团的氨基酸衍生物，这构成本发明的一个特定实施方案。

[0067] 在其硫醇官能团的水平上受保护的氨基酸可从如 获得。

[0068] 在双表位肽与载体分子偶联之后，硫醇官能团将根据本领域技术人员已知的技术任选地脱保护。作为保护基团，可以提及在DTT(二硫苏糖醇) 的存在下在水性介质(0.1M碳酸氢铵)中容易去除的叔丁硫基。当仅偶联臂X/Y含有具有硫醇官能团的氨基酸衍生物时，这种脱保护是不必要的，并且不建议使用。当肽序列E1/E2含有具有硫醇官能团的氨基酸衍生物时，如果这影响表位识别，则这种脱保护是必要的。

[0069] 偶联臂和/或肽序列也可以不含有具有硫醇官能团的氨基酸衍生物。因此，本发明的双表位化合物包含下述特征中的一个或多个：

[0070] ‑连接臂X不包含具有硫醇官能团的氨基酸衍生物，

[0071] ‑连接臂Y不包含具有硫醇官能团的氨基酸衍生物，

[0072] ‑肽序列E1不包含具有硫醇官能团的氨基酸衍生物，

[0073] ‑肽序列E2不包含具有硫醇官能团的氨基酸衍生物。

[0074] 根据一个特定实施方案，肽序列E1和E2不包含具有硫醇官能团的氨基酸衍生物。根据另外一个实施方案，X、Y、E1和E2中的元素无一包含具有硫醇官能团的氨基酸衍生物。

[0075] 对于其在免疫测定中的实施，本发明的化合物可以包含在组合物中，所述组合物包含或含有在水、缓冲液或生物流体中的溶液中的所述式(I) 化合物，这构成本发明的另一个主题。

[0076] 在水中的溶液中含有式(I)的双表位化合物的组合物是通过所述化合物的完全溶解而获得的透明液体溶液，并且其主要溶剂是水，代表相对于溶液的总体积(按体积计)至少50％。溶剂的量当然取决于所涉及的分析物，并且将由本领域技术人员容易地确定。

[0077] 式(I)化合物也可以在缓冲液中的溶液中。所使用的缓冲液是本领域技术人员众所周知的，并且取决于所涉及的分析物。作为缓冲液的例子，可以提及缓冲液例如PBS、HEPES和Tris‑HCl缓冲液。

[0078] 当组合物含有生物流体时，所述流体可以对应于期望测试的样品。作为例子，可以提及总血液或其衍生物例如血清或血浆、尿、唾液和积液。

[0079] 本发明的组合物中式(I)化合物的量取决于所涉及的分析物和相应的测量范围。它通过本领域的技术人员容易地确定。因此，它可以是约1pg/ml、 1ng/ml或1μg/ml。

[0080] 特别是关于E1、E2、X、Y、Z、载体分子和分析物的选择先前所述的相同的特征和优点，也适用于本发明的组合物。

[0081] 当然，本发明的组合物可以包含本领域技术人员已知的其他化合物，例如盐、填充蛋白如BSA、或者葡聚糖或聚乙二醇型的合成聚合物、或洗涤剂。

[0082] 如先前所述，本发明的化合物和组合物是特别有利的，因为它们易于合成，在+2/8℃下是稳定的并且在免疫测定的条件下是可溶的。此外，本发明的化合物具有针对所有预期特别高的对免疫测定中使用的结合配偶体的免疫反应性，即结合配偶体特别良好地识别它们，使得如果需要使用它们作为对照、标准和/或调节物，则它们可以以低量包含在对照、标准和调节物溶液中，同时在免疫测定的条件下是稳定的。

[0083] 因此，本发明的另一个主题涉及这种双表位化合物或含有该化合物的这种组合物在免疫测定中作为对照或标准或调节物的用途。

[0084] 术语“作为式(I)化合物或含有该化合物的组合物的对照的用途”预期意指其尤其用于验证免疫测定根据预期操作(也称为阳性对照)，并且测试样品中的分析物检测不是假阴性的用途。

[0085] 表述“作为式(I)化合物或含有该化合物的组合物的标准的用途”预期意指其用于建立标准范围的用途。标准范围的建立是能够进行分析物的定量的必要步骤，是本领域技术人员众所周知的步骤，如先前所述。它由下述组成：测量通过增加和已知量或浓度的分析物生成的信号，绘制以量或浓度作为函数的信号的曲线，以及找到尽可能可靠地表示该关系的数学模型。为了实现这点，使用本发明的几种水性组合物，各自含有不同浓度的分析物。数学模型用于通过外推来确定测试样品中包含的未知量或浓度的分析物。

[0086] 表述“作为式(I)化合物或含有该化合物的组合物(其是特定标准) 的调节物(也称为校准物)的用途”预期意指其用于调节分析物的免疫测定的测量的用途。在这种情况下，分析物的浓度是固定和已知的。在免疫测定中的使用期间通过调节物生成的信号也是已知的。调节物作用于验证在免疫测定实施期间产生的测量(信号)确实对应于预期值。如果不是这种情况，则调节物作用于测量偏差，所述偏差在适当时能够在数学上校正或通过对测量仪器的物理干预校正(调节)。为了方便起见，在本申请中，术语“标准”将包括术语“调节物”。

[0087] 如先前所述，分析物是通过分析来检测、鉴定和/或定量的样品中含有的生物学、化学或生物化学起源的任何物质。

[0088] 根据第一个实施方案，分析物是心肌肌钙蛋白I，并且式(I)化合物或含有它的组合物用作心肌肌钙蛋白I免疫测定中的对照、标准或调节物。

[0089] 已知肌钙蛋白是由三种蛋白质：肌钙蛋白I、T和C组成的肌原纤维蛋白复合物。通2+
过与肌球蛋白和肌动蛋白相互作用，这种蛋白质复合物使得能够促成调节Ca 离子介导的肌肉收缩。

[0090] 心肌肌钙蛋白I(Uniprot登录号P19429)是负责抑制肌球蛋白和肌动蛋白之间的结合的肌钙蛋白亚基。

[0091] 心肌肌钙蛋白I表位和模拟表位是本领域技术人员已知的。在本发明的一个特定模式中，肽序列E1和E2选自下述序列：

[0092] 序列1：ATEPHAKKK

[0093] 序列2：AGLGFAELQDL

[0094] 序列3：KISASRKLQLKT

[0095] 通过氨基酸的取代、缺失或插入而衍生自所述肽序列的肽序列也属于本发明的领域，只要它们保留被所讨论的抗体识别的能力。

[0096] 根据另一个实施方案，式(I)化合物或含有它的组合物在防御素原‑A6 免疫测定中用作对照、标准或调节物。

[0097] 防御素是涉及针对微生物攻击的宿主防御的抗微生物肽家族。在成熟形式中，它们由30至40个氨基酸组成，并且具有选择性分解膜的性质。如同其他真核蛋白，防御素不仅可以以成熟蛋白质形式存在，还可以以前体形式存在。然后使用术语“防御素原”。防御素原‑A6(Uniprot登录号 Q01524)已被描述为可能用作癌症且特别是结肠直肠癌背景下的标记物，特别是在申请人的专利申请WO 2010/112777中。

[0098] 防御素原‑A6蛋白质表位和模拟表位是已知的，并且例如在专利申请 WO 2010/112777中描述。在本发明的一个特定模式中，肽序列E1和E2独立地选自下述序列组，假设如果E1选自一组，则E2选自另一组：

[0099] 组1：

[0100] ‑序列4：NYVTPPWAIFRH

[0101] ‑序列5：WTGVLSPTQEYR

[0102] ‑序列6：SHLTPPWMDYRV

[0103] ‑序列7：VMAVTCSTCDSR

[0104] ‑序列8：LTPPTEDLRPPD

[0105] 组2：

[0106] ‑序列9：YGNHSCTHIGHC

[0107] ‑序列10：GPSYTCLHFGHC

[0108] ‑序列11：TEREVHNWFPFH

[0109] 组3：

[0110] ‑序列12：YPHPWSMHVIRA

[0111] ‑序列13：TTTPHPWALFAV

[0112] ‑序列14：TPHPWQRWVVYS

[0113] ‑序列15：EDVLRWHPEWPG

[0114] 组4：

[0115] ‑序列16：YHETWPPKSAQL

[0116] ‑序列17：YHDNWPQPSRSW

[0117] ‑序列18：QHNHQRHGAMGA

[0118] ‑序列19：YHDMWPMSGRMA

[0119] ‑序列20：YHDNWPPLNGAR

[0120] ‑序列21：YHDMWPAIQLSP

[0121] ‑序列22：YHEKFPGPVVLP

[0122] 组5：

[0123] ‑序列23：QAEDDPLQAK

[0124] 这些对照、标准和/或调节物特别适用于在可能含有所述分析物的测试样品中通过免疫测定检测和/或定量分析物的方法。

[0125] 因此，本发明的另一个主题涉及在可能含有所述分析物的测试样品中通过免疫测定用于检测分析物的方法，其包括：

[0126] i.通过使所述测试样品与分析物的一个或多个结合配偶体接触的免疫测定，[0127] ii.通过将如先前定义的式I的双表位化合物或如先前定义的组合物以阳性对照的方式与所述分析物的一个或多个结合配偶体接触，来验证免疫测定测试的有效性的测试，

[0128] iii.如果有效性验证测试为阳性，则读取免疫测定测试，

[0129] iv.当通过步骤i的免疫测定测试获得的信号大于免疫测定测试的检测阈值时，确定测试样品中所述分析物的存在。

[0130] 在本发明上下文中的测试样品可以具有各种起源，例如食物、环境、生物学、兽医学、临床、药物或化妆品起源。

[0131] 在食物起源的样品中，可以非详尽地提及乳制品(酸奶、干酪等)、肉类、鱼类、鸡蛋、水果、蔬菜、水、饮料(牛奶、果汁、苏打水等)的样品。当然，这些食物起源的样品也可以来自酱汁或更精细的菜肴或者未经转化或部分转化的原材料。食物样品也可以衍生自动物饲料，例如油饼或动物膳食。所有这些样品，如果它们不是液体，则被预处理以便成为液体形式。

[0132] 如先前所述，样品可以具有环境起源，并且可以由例如表面取样、水取样等组成。

[0133] 样品还可以由人或动物起源的生物样品组成，所述生物样品可以对应于生物流体(尿、总血液或衍生物例如血清或血浆、唾液、脓、脑脊髓液等)、粪便(例如霍乱样腹泻)、鼻、喉咙、皮肤、伤口、器官、组织的取样或分离的细胞取样、或拭子样品。这个列表显然不是详尽的。

[0134] 一般地，术语“样品”指为了分析目的从一个或多个实体取得的部分或量，更特别地小部分或少量。该样品可以任选地已经历预处理，涉及例如混合、稀释或者研磨步骤，特别是如果起始实体处于固体状态。

[0135] 分析的样品一般可以含有或疑似含有代表微生物或者待检测、表征或监测的疾病的存在的至少一种分析物。

[0136] 用于通过免疫测定来检测分析物的该方法的步骤是先前已描述的本领域技术人员已知的步骤。特别地，第一步由下述组成：使测试样品与分析物的一个或多个结合配偶体接触，优选用于夹心测试的两个结合配偶体。如先前所述，两个配偶体之一可以与标记偶联，以便形成缀合物或示踪剂。如本领域技术人员已知的，另一个结合配偶体可以在固体支持物上捕获。然后术语“捕获配偶体”用于后者，而“检测配偶体”用于前者。

[0137] 由缀合物发射的测量信号然后与生物样品中分析物的量成比例。

[0138] 目的分析物的结合配偶体是能够结合分析物的任何分子。作为分析物的结合配偶体的例子，可以提及免疫学性质或起源的结合配偶体，例如本领域技术人员众所周知的(单克隆或多克隆)抗体和抗体片段，以及并非免疫学性质或起源的结合配偶体，例如nanofiti、分析物的受体(如果存在的话)、适体、DARPins或已知与所述分析物具有相互作用的任何其他分子。

[0139] Nanofitin(商品名)是小蛋白质，如同抗体，其能够结合生物靶，因此使得能够检测它、捕获它或很简单地靶向生物内的它。

[0140] 通过称为SELEX“指数富集的配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponentiel Enrichment)”(Ellington AD和Szostak JW.，1990) 的体外选择的组合15
方法，在含有10 个不同序列的文库中鉴定的，适体是寡核苷酸，一般是RNA或DNA。大多数适体是RNA化合物，由于RNA 采用不同的复杂结构的能力，从而使得能够在其表面处产生各种几何形状的空腔，使得其能够结合各种配体。它们是可以用于生物技术、诊断或治疗应用的感兴趣的生物化学工具。它们的选择性及其配体结合性质与抗体的那些可比较。

[0141] “DARPins”设计的锚蛋白重复蛋白(Designed Ankyrin Repeat ProteINS) (Boersma YL和PlütckthunA，2011)是另一类蛋白质，其使得能够模拟抗体并且能够以高亲和力和高选择性结合靶蛋白。它们衍生自其为衔接蛋白的锚蛋白家族，其使得能够结合对膜收缩蛋白/肌动蛋白网络整合的膜蛋白，所述膜收缩蛋白/肌动蛋白网络构成细胞质膜的“脊柱”。锚蛋白的结构基于大约33个氨基酸的单元的重复，并且对于DARPins也是如此。每个单元具有螺旋‑转角‑螺旋型的二级结构。DARPins含有至少三个，优选四至五个重复单元，并且通过筛选组合文库得到。

[0142] 术语“标记”预期特别意指任何分子，其包含直接没有化学修饰与结合配偶体的基团反应的基团，或在化学修饰后以便包括这样的基团，该分子能够直接或间接生成可检测信号。这些直接检测标记的非限制性列表由下述组成：

[0143] ·产生可例如通过比色法、荧光或发光检测的信号的酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β‑半乳糖苷酶或6‑磷酸葡萄糖脱氢酶，

[0144] ·发色团，例如荧光、发光或染料化合物，

[0145] ·放射性分子，例如32P、35S或125I，

[0146] ·荧光分子，例如Alexas或藻蓝蛋白，和

[0147] ·电化学发光盐，例如基于吖啶鎓或钌的有机金属衍生物。

[0148] 还可以使用间接检测系统，例如能够与抗配体反应的配体。配体然后对应于与结合配偶体一起构成缀合物的标记。

[0149] 配体/抗配体对是本领域技术人员众所周知的，其是例如使用下述对的情况：生物素/链霉抗生物素蛋白、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖/ 凝集素、多核苷酸/与之互补的多核苷酸。

[0150] 抗配体然后可以通过先前描述的直接检测标记直接检测，或者本身可以由另一种配体/抗配体对检测，等等。

[0151] 这些间接检测系统可以在某些条件下导致信号的放大。该信号放大技术是本领域技术人员众所周知的，并且可以参考申请人的现有专利申请FR 2781802或WO 95/08000。

[0152] 取决于所使用的标记类型，本领域技术人员将添加试剂，所述试剂允许可通过任何类型的适当测量装置检测的标记的显现或信号的发射，所述适当测量装置例如分光光度计、分光荧光计、密度计或者高清晰度摄像机。

[0153] 其为验证免疫测定的有效性的测试步骤如先前所述。

[0154] 免疫测定测试i)和验证测试ii)可以以任何顺序、同时或连续地、任选地在相同的固体支持物上进行。

[0155] 免疫测定测试的读取也是本领域技术人员众所周知的一个步骤，这取决于所使用的测试。

[0156] 最后，最后一步由下述组成：当通过步骤i的免疫测定测试获得的信号大于免疫测定测试的检测阈值时，确定测试样品中所述分析物的存在。该步骤也是本领域技术人员众所周知的。

[0157] 除检测之外，本发明的化合物还适合于定量测试样品中的分析物。因此，本发明的另一个主题涉及在可能含有所述分析物的测试样品中通过免疫测定用于定量分析物的方法，其包括：

[0158] i.通过使所述测试样品与分析物的一个或多个结合配偶体接触的免疫测定，[0159] ii.通过使阳性对照与所述分析物的一个或多个结合配偶体接触，来验证免疫测定测试的有效性的测试，

[0160] iii.如果有效性验证测试为阳性，则读取免疫测定测试，和

[0161] iv.通过免疫测定测试的信号与使用如先前定义的式(I)的双表位化合物或如先前定义的组合物预先获得的标准曲线的比较，来确定测试样品中所述分析物的量。

[0162] 定量方法的所述步骤如先前定义。特别地，免疫测定测试i)和验证测试ii)可以以任何顺序、同时或连续地、任选地在相同的固体支持物上进行。

[0163] 在该定量方法中，阳性对照可以是用作对照的任何化合物，其具有与所使用的免疫测定中的分析物可比较的抗原反应性。根据一个实施方案，阳性对照是如先前定义的双表位化合物或组合物。

[0164] 用本发明的化合物或组合物制备标准曲线。然而，可以使用任何其他适当的标准溶液。因此，本发明的另一个主题涉及在可能含有所述分析物的测试样品中通过免疫测定用于定量分析物的方法，其包括：

[0165] i.通过使所述测试样品与分析物的一个或多个结合配偶体接触的免疫测定，[0166] ii.通过将如先前定义的式I的双表位化合物或如先前定义的组合物作为阳性对照与所述分析物的一个或多个结合配偶体接触，来验证免疫测定测试的有效性的测试，[0167] iii.如果有效性验证测试为阳性，则读取免疫测定测试，和

[0168] iv.通过免疫测定测试的信号与标准曲线的比较，来确定测试样品中所述分析物的量。

[0169] 特别是关于特定化合物和分析物的选择，对于免疫测定的各个步骤先前描述的相同的特征和优先选择也适用于本发明的检测和定量方法。

[0170] 特别地，在所有这些检测和定量方法中，分析物可以是心肌肌钙蛋白I 或防御素原‑A6。

[0171] 本发明的免疫测定方法涉及使用包含本发明化合物或组合物的诊断试剂盒，这构成本发明的另一个主题。

[0172] 除如上所述的本发明的化合物或组合物之外，根据本发明的试剂盒还可以含有实施用于通过免疫测定(例如通过夹心型免疫测定)检测或定量目的分析物的存在的方法所需的化合物，例如结合配偶体和用于证明结合配偶体和目的分析物之间的反应所需的所有化合物。

[0173] 借助于以非限制性举例说明给出的下述实施例以及附图将更清楚地理解本发明，在所述附图中：

[0174] ‑图1是给出通过 自动化装置测定的，以它们浓度作为函数，通过根据现有技术的双表位化合物(REF化合物)、根据本发明的双表位化合物(化合物1)、以及对应于本发明的双表位化合物1但不与载体分子偶联的双表位肽(非偶联肽1)发射的荧光信号RFV的图；

[0175] ‑图2是给出通过 自动化装置测定的，以它们浓度作为函数，通过根据现有技术的双表位化合物(REF化合物)、以及根据本发明的双表位化合物(化合物1和3)发射的荧光信号RFV的图；

[0176] ‑图3是给出通过 自动化装置测定的，以它们浓度作为函数，通过根据现有技术的双表位化合物(REF化合物)、以及根据本发明的双表位化合物(化合物1和4)发射的荧光信号RFV的图。

[0177] 实施例

[0178] 实施例1：肽合成

[0179] 使用来自Applied Biosystems(Foster City，CA，美国)的ABI 433A 合成仪或来自CEM Corporation(Matthews，NC，美国)的Liberty合成仪进行肽合成。使用Rink Amide MBHA树脂(目录号855003，  Merck Millipore，Molsheim，法国)作为聚合物固体支持物。

[0180] 在化学合成结束时，在三氟乙酸‑乙二硫醇‑三异丙基硅烷‑水 (94/2.5/1/2.5V/V/V/V)的混合物存在下，将肽脱保护并且从聚合物中切割大约2小时。在通过过滤去除聚合物后，通过在0℃下从二乙醚中沉淀分离肽。

[0181] 为了提高其纯度，通过在Vynac DenaliTM C18，10μm柱(Mandel Scientific Company Inc.，Guelph，Ontario，加拿大)上的反相制备型高效液相色谱(HPLC)纯化肽。每种肽用在含有0.1％三氟乙酸的水溶液中阶式梯度的乙腈(0至95％)洗脱，已选择了步骤的乙腈百分比，以便优化对应于目的肽的峰的分离。在该最后一步之后，进行两种不同的分析技术以便验证且表征所获得的肽。

[0182] 对于每种肽，在 高分辨率RP‑18封端的反相柱(Merck Millipore，Molsheim，法国)上生成分析型HPLC谱。借助于在含有0.1％三氟乙酸的水溶液中的乙腈线性梯度(0至100％)进行洗脱，并且通过测量在214nm处的吸光度进行监测。该分析使得能够确定肽的纯度水平。

[0183] 还通过在与Accurate‑Mass  Q‑TOF LC/MS  6540UHD质谱仪(AgilentTechnologies)偶联的Zorbax Eclipse Plus C18 RRHD 2.1×50mm柱，粒度 1.8μm
(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美国)上的液相色谱‑质谱法(LC/MS)来分析每种肽。该分析使得能够确定肽的摩尔质量。

[0184] 所合成的肽的序列以及表征结果呈现于表1中。

[0185] 表1.所合成的肽的序列和特征。

[0186]

[0187] 缩写TnI对应于心肌肌钙蛋白I，并且PDEF‑A6对应于防御素原‑A6。缩写Ado对应于8‑氨基‑3,6‑二氧杂辛酸(CAS号：134978‑97‑5)。

[0188] 表2.根据本发明获得并且根据免疫反应性测试的双表位化合物(式I) 的概括[0189] 标识符 分析物 表位E1 表位E2 臂X 臂Y 载体分子化合物1 TnI ATEPHAKKK AGLGFAELQDL (Ado)2 (Ado)2 BSA
化合物2 TnI KISASRKLQLKT AGLGFAELQDL (Ado)2 (Ado)2 BSA
化合物3 TnI ATEPHAKKK AGLGFAELQDL (Ado)2 (Ado)2 IgG
化合物4 TnI ATEPHAKKK AGLGFAELQDL GGGS SGGG BSA
化合物5 PDEF‑A6 QAEDDPLQAK WTGVLSPTQEYR (Ado)2 (Ado)2 BSA

[0190] 缩写TnI对应于心肌肌钙蛋白I，并且PDEF‑A6对应于防御素原‑A6。缩写Ado对应于8‑氨基‑3,6‑二氧杂辛酸(CAS号：134978‑97‑5)。缩写BSA对应于牛血清白蛋白。IgG是兔免疫球蛋白G。

[0191] 实施例2：双表位化合物的制备

[0192] 通过一方面在实施例1中获得的肽和另一方面载体分子之间进行共价偶联获得双表位化合物。表2详细呈现了所制备的根据本发明的各种双表位化合物。所有这些化合物都对应于式I。表3就其本身而言概括了进行的所有偶联，同时指定肽和载体‑分子对。

[0193] 偶联程序如下：

[0194] 首先，在过量的磺基‑SMCC(磺基琥珀酰亚胺基‑4‑(N‑马来酰亚胺基甲基)环己烷‑1‑羧酸酯，CAS号：92921‑24‑9，目录号22322，Pierce，Thermo Scientific，Villebon sur Yvette，法国)的存在下，选择作为载体分子的蛋白质被活化。对于牛血清白蛋白(BSA，Proliant Health&Biologicals，Ankeny， IA，美国)，选择1/20BSA/SMCC摩尔比。因此，将BSA在PBS(磷酸盐缓冲盐水)pH 7.2中稀释至10mg/ml，并且逐滴加入临时制备的53μl在水中以 25mg/ml的磺基‑SMCC溶液。在30℃±2℃下在水浴中温育1小时±5分钟后，伴随轻轻的磁力搅拌，使BSA‑SMCC在具有12至14kDa的截止阈值的透析管中针对含有150mM NaCl，pH 
6.8的50mM磷酸盐缓冲液进行透析。透析在环境温度下进行，并且透析浴每小时更换3次。透析后，通过测量在 280nm处的吸光度来测定BSA‑SMCC溶液的蛋白质浓度，并且将该浓度在含有150mM NaCl，pH 6.8的50mM磷酸盐缓冲液中调节至5mg/ml。该步骤使得能够修饰载体分子的表面，其从此具有马来酰亚胺型的几个反应基团。

[0195] 考虑到纯度，将待偶联的肽以5mg/ml溶解在含有150mM NaCl和5mM EDTA，pH 6.8的50mM磷酸盐缓冲液中。选择1/10 BSA/肽摩尔比。因此，将以5mg/ml浓度的2.35mg BSA‑SMCC(0.47ml)加入以5mg/ml浓度的1mg 肽(200μl)中。将该混合物在2/8℃下在轮上温育最少16小时。然后通过加入在临时制备的含有150mM NaCl pH 6.8的50mM磷酸盐缓冲液中的0.1M 2‑巯基乙胺(CAS号：60‑23‑1，半胱胺)来阻断反应。在实验室温度下在轮上温育20±5分钟后，使肽‑BSA缀合物在具有12至14kDa截止阈值的透析管中针对PBS缓冲液pH 7.2进行透析。透析在2/8℃下持续最少16小时。透析后，将蛋白质浓度调节至PBS缓冲液pH 7.2中
2mg/ml的BSA理论浓度。然后通过测量在280nm处的吸光度来确定肽‑BSA缀合物的浓度。该步骤允许在末端或中间半胱氨酸的水平上(取决于要偶联的肽序列)，马来酰亚胺基团和肽的巯基(–SH)之间的反应，以便形成硫醚键。

[0196] 化合物1、2、4和5全部通过应用上述程序获得。对于对应于如专利US 6 114 180中所述的双表位化合物的REF化合物，同样应用相同的程序，除了2 种肽(肽2和肽3)同时置于BSA‑SMCC的存在下，并且每种肽以1/10的理论 BSA/肽摩尔比偶联之外。对于化合物3，将肽1偶联至兔多克隆免疫球蛋白 G(bioMérieux)。程序是相同的，除了BSA用另一种载体分子替代之外。理论载体分子/肽摩尔比为1/10。

[0197] 表3.肽‑载体分子偶联的概括

[0198]

[0199] 实施例3：根据本发明的双表位化合物1的免疫反应性的研究

[0200] 借助于使用 免疫分析自动化装置(bioMérieux)的心肌肌钙蛋白I免疫测定进行化合物的双表位性质的研究。一次性使用的尖端充当反应的固相和吸液系统两者。药液筒由10个孔组成(X0至X9由密封和标记的铝片覆盖。第一孔(X0)包括预切割部分，以便促进样品的引入。最后一个孔(X9)是在其中光学测量底物的荧光的光学比色皿。分析所需的各种试剂包含在中间孔中。测试的所有步骤都由仪器自动进行。它们由反应介质的抽吸/吹回的一系列循环组成。借助于单步骤夹心测试进行心肌肌钙蛋白I 免疫测定。

[0201] a)尖端的敏化和钝化

[0202] 所使用的抗体的特征和供应商呈现于表4中。使用300μl各自在PBS缓冲液pH 6.2中稀释至2.5μg/ml的19C7和B90单克隆抗体溶液使尖端致敏。在 +18/25℃下与敏化溶液温育大约20小时后，将尖端排空。然后加入300μl含有10g/l牛血清白蛋白的这种相同溶液。钝化在+18/25℃下持续过夜。将尖端排空，干燥，然后在无水分的环境中在+4℃下贮存直到使用。

[0203] 表4.用于心肌肌钙蛋白I免疫测定的抗体

[0204]

[0205] NA：不可用。缩写TnI对应于心肌肌钙蛋白I，并且缩写TnC对应于心肌肌钙蛋白C。缩写目录号对应于供应商的目录参考。

[0206] b)免疫测定程序

[0207] 将测试化合物以不同浓度在PBS‑BSA缓冲液中稀释，并且作为样品进行测定。

[0208] 一旦 尖端与样品接触，免疫反应就开始，因为捕获抗体固定在该尖端上。自动化装置将测试样品(135μl)与270μl缀合物溶液混合。该溶液含有以碱性磷酸酶偶联的Fab'片段形式的2种单克隆抗体，3D5F7和 7B9。将这些缀合物在还含有150mM NaCl和填充蛋白的100mM磷酸盐缓冲液pH 6.4中稀释至大约0.75μg/ml。

[0209] 温育在37℃下持续6.8分钟，并且允许心肌肌钙蛋白I或心脏TnI双表位化合物或心脏TnI肽一方面特异性结合吸附在尖端上的抗体上，并且另一方面特异性结合缀合物。然后通过用含有300mM NaCl和0.2％Triton X‑100的 200mM Tris缓冲液pH 7.8的3次洗涤来去除未结合的组分。在最终显色步骤期间，将4‑甲基伞形酮基磷酸酯底物向上抽吸，然后在尖端中吹回；缀合物的酶催化该底物水解为4‑甲基伞形酮的反应，所述4‑甲基伞形酮的发射荧光在450nm处进行测量。荧光信号的值(RFV＝相对荧光值)与样品中存在的抗原浓度成比例。

[0210] 表5概括了当比较REF双表位化合物(现有技术)、根据本发明的双表位化合物1和非偶联的肽1(实施例1)的免疫反应性时，通过 自动化装置测定的荧光信号(RFV＝相对荧光值)。图1以图形表示这些相同的数据。作为提醒，肽1包含2个心脏TnI表位，一个由先前描述的免疫测定的B90捕获抗体识别，并且另一个由3D5F7检测抗体识别。在根据本发明的化合物1 中，肽1经由BSA上的中间半胱氨酸偶联，以便确保其更佳的抗原呈递和改进的稳定性。REF化合物具有也与BSA偶联的相同的两个TnI表位。与化合物1不同，2个表位各自是已在末端半胱氨酸的水平上与BSA偶联的单个肽 (肽2和3)的形式。化合物1，对应于如专利US 6 114 180中所述的双表位化合物的REF化合物，以及对应于如专利申请WO 98/
24816中所述的合成双表位化合物的肽1，在心脏TnI免疫测定中都是反应性的，但其反应性水平非常不同。因此，为了获得大约1000RFV的信号，与1118μM的REF化合物相比，需要21μM的化合物1，即少大约50倍。化合物1因此显示出比REF化合物好得多的免疫反应性。此外，用化合物1获得的 信号的良好动力学无法用REF化合物再现，即使当测试高得多浓
度的该化合物时。非偶联肽1比与BSA偶联的两种双表位化合物识别差得多。

[0211] 表5.双表位化合物1、3、4和REF以及心脏TnI肽1的免疫反应性

[0212]

[0213] 缩写[c]对应于以μM的化合物浓度。缩写S对应于RFV中的信号。

[0214] 实施例4：使用各种载体分子的本发明双表位化合物的免疫反应性的比较

[0215] 在该实施例中，将包含2个不同的心脏TnI表位的肽1偶联至2种不同的载体分子：BSA(化合物1)和兔免疫球蛋白G(化合物3)。这些双表位化合物的获得在实施例2中描述。如实施例3所述进行这些化合物在心脏TnI免疫测定中的免疫反应性的比较，并且结果呈现于上表5和图2中，所述图2代表给出以它们浓度作为函数，通过各种化合物：根据现有技术的双表位化合物(REF化合物)和根据本发明的双表位化合物(化合物1和3)发射的 RFV荧光信号。结果显示化合物1和3在心脏TnI免疫测定中都是反应性的，并且显示出比对于REF化合物观察到的那种大得多的可比较反应性。

[0216] 实施例5：使用各种间隔臂的根据本发明双表位化合物的免疫反应性的比较

[0217] 在该实施例中，所比较的双表位化合物仅在间隔臂方面不同。在化合物1的情况下，两个间隔臂是相同的，它是Ado人造氨基酸的二聚体。化合物4就其本身而言包含作为臂X的GGGS序列和作为臂Y的SGGG序列。作为提醒，两种化合物具有2个心脏TnI表位，并且载体分子是BSA。这些双表位化合物的获得在实施例2中描述。如实施例3所述进行这些化合物在心脏TnI 免疫测定中的免疫反应性的比较，并且结果呈现于上表5和图3中，所述图3 代表给出以它们浓度作为函数，通过各种化合物：根据现有技术的双表位化合物(REF化合物)和根据本发明的双表位化合物(化合物1和4)发射的 RFV荧光信号。结果显示包含GGGS和SGGG臂的化合物4比包含Ado臂的化合物1识别更差，但远远大于REF化合物。

[0218] 实施例6：稳定性测试

[0219] 化合物1和2在表6所示的各种缓冲液中稀释至3.75ng/ml。在制备溶液的当天，D0时进行第一次测定。所获得的值充当用于监测稳定性的参考。将双表位化合物的稀释溶液贮存在+2/8℃下，并且在D7(制备后第7天)时进行测定。下表6显示了在D0和D7之间的免疫测定的RFV信号中的变化(信号 D7/信号D0×100)。化合物1和2是稳定的，并且当它们在+2/8℃下贮存1周时，其抗原性质得到保存。

[0220] 表6.化合物1和2在+2/8℃下7天的稳定性

[0221]稀释缓冲液 化合物1 化合物2
柠檬酸盐pH5，150mM NaCl，50g/l BSA 102％ 98％
柠檬酸盐pH6，150mM NaCl，50g/l BSA 99％ 95％
PBS，pH 6.2，50g/l BSA 99％ 89％

[0222] 在第二步中，仅对在含有50g/l BSA的PBS，pH 6.2中稀释的化合物1进行更长持续时间的稳定性研究。当在+2/8℃下贮存时，化合物1在稀释溶液中是稳定的：在1个月贮存时发现97％的免疫测定信号，在3个月时为94％，并且在6个月时为90％。当在+18/25℃下贮存时，化合物1在稀释溶液中稳定大约1个月(发现88％的信号)。还要着重指出化合物1能够经受住在20℃下的至少三次冻/融循环，而无其抗原性质的任何降解。没有测试更多数目的冻/融循环。

[0223] 所有这些结果都证明了根据本发明的化合物1的溶液的优异稳定性。

[0224] 实施例7：包含模拟表位的根据本发明的双表位化合物5的免疫反应性研究

[0225] 双表位化合物5被设计成在防御素原A6免疫测定期间充当对照和/或标准和/或调节物。化合物5组合线性表位(QAEDDPLQAKL)和模拟表位 (WTGVLSPTQEYR)。使用自动化免疫分析装置(bioMérieux)，根据申请WO 2010/112777中所述的方案，即使用识别序列EDDPLQ的线性最小表位的12H4E1克隆(bioMérieux)作为捕获抗体，并且使用其表位不是线性的而是序列WTGVLSPTQEYR的模拟表位的1H8C9克隆 (bioMérieux)作为检测抗体，进行防御素原A6免疫测定。这些表位/模拟表位是化合物5中发现的那些。

[0226] 下表7概括了当测试各种浓度的化合物5(分子摩尔质量：98 155道尔顿) 时，通过自动化装置测定的荧光信号(RFV＝相对荧光值)。化合物 5在防御素原A6免疫测定中确实是反应性的。

[0227] 表7.双表位化合物5的免疫反应性

[0228] 以ng/ml的[c]肽 以mM的[c] RFV信号17.5 0.2 385
35 0.4 583
175 1.8 1306
1750 18 2637
17 500 178 3448

[0229] 文献参考

[0230] ‑Boersma YL和Plütckthun A,2011,Curr.Opin.Biotechnol,22:849‑857

[0231] ‑Ellington AD和Szostak JW.,1990,Nature,346:818‑822

[0232] ‑Fields和Noble,1990,Int J Pept Protein Res.,35:161‑214

[0233] ‑Merrifield 1963,J Am Chem Soc.85:2149‑2154

[0234] ‑Shan S.Wong,1991,Chemistry of Protein Conjugation and Cross‑linking》,CRC Press Inc.,Boca Raton,Florida,United States。