一种石榴皮单宁液态发酵制备的鞣花酸及其制备方法

摘要

一种石榴皮单宁液态发酵制备的鞣花酸及其制备方法，属化妆品、药品、保健品技术领域。本发明直接以石榴皮单宁提取浓缩水溶液为底物发酵罐液态发酵；使用黑曲霉菌(Aspergillus niger)、青霉菌（Pencicillin G）和大肠杆菌（Escherichia.Coli）3种菌按照一定比例混合，并使用羧甲基纤维素钠、海藻酸钠和硅藻土制备固定化胶粒，可多次使用，提高了菌种的利用效率；使用3种菌混合发酵能形成互补效应，使鞣花酸转化效率更高；该工艺发酵条件温和，大大减少化学物质的消耗，环境污染小，更适合大规模的生产。

权利要求

1.一种石榴皮单宁液态发酵制备鞣花酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）石榴皮单宁提取液制备

将干燥的石榴皮粉碎至40目，使用61%～70%体积分数的乙醇溶液60-80℃回流提取3次，第1次加入乙醇溶液是石榴皮粉末质量的10～15倍，提取2 h，离心分离滤液和滤渣；第2次向滤渣中加入乙醇溶液8～10倍，提取1.5 h，离心分离；第3次向滤渣中加入乙醇溶液6～

8倍，提取1 h，离心分离；合并3次滤液，经蒸馏回收乙醇，得石榴皮单宁提取浓缩水溶液，可直接用于发酵生产，经测定提取浓缩水溶液中单宁含量1%～1.5%；

（2）发酵菌种的培养与共固定

将黑曲霉菌、青霉菌和大肠杆菌分别在液体完全培养基中于33 ℃振荡培养12 h(80r/min)后，将3种培养液分别于5200～6000 r/min离心12～10 min，得到孢子和菌体悬液，以无菌水稀释菌悬液，使孢子或菌体数达106～107个/mL，然后将3种菌悬液以3∶2∶2的体积比例混合均匀后，再按1∶1的比例与羧甲基纤维素钠和海藻酸钠的胶体水溶液混合，胶体水溶液中羧甲基纤维素钠的质量百分比为1%，海藻酸钠的质量百分比为4%，再按1%～2%的质量比加入60目的硅藻土，搅拌均匀，然后滴入不断搅拌的含4%CaCl2和2%MgSO4的混合水溶液中，浸泡2 h，制得直径2～3 mm的球形颗粒，用无菌水洗涤两次后，备用；

（3）接种与发酵

把（1）制得的石榴皮单宁提取浓缩水溶液装入发酵罐，加入质量比0.2%的(NH4)2HPO4，再把固定化菌种胶粒接入发酵罐，接种量为发酵液质量比的10%～15%，发酵温度控制在33～35℃，从发酵罐底部泵入无菌空气，空气流量为发酵液体积的0.4～0.6倍每小时，发酵4～5天，过滤分离发酵液与固定化菌种胶粒，菌种胶粒可连续使用20次以上，发酵液用于提取鞣花酸；

（4）萃取

含鞣花酸的发酵液通过离心分离，获得含鞣花酸的沉淀，第1次加入4～6倍体积的无水甲醇70 ℃回流萃取4 h，过滤；第2次向滤渣中加入2～3倍体积的无水甲醇回流萃取3 h，过滤；合并次滤液，旋蒸回收甲醇至饱和，饱和的浓缩液在室温下静置结晶，过滤所得固体结晶经去离子水水洗后冷冻干燥即得鞣花酸产品。

说明书

一种石榴皮单宁液态发酵制备的鞣花酸及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种石榴皮单宁液态发酵制备鞣花酸及其制备方法，属化妆品、药品、保健品等技术领域。

背景技术

[0002] 鞣花酸 (ellagic acid)，分子式 C14H6O8，它是没食子酸的二聚衍生物，是一种多酚二内酯。鞣花酸纯品是一种黄色针状晶体，微溶于水、醇，溶于热甲醇、碱和吡啶。其分子结构如下：

[0003] 鞣花酸是广泛存在于各种坚果、水果中的天然多酚类化合物，尤以石榴皮中含量丰富。但游离态的较少，更多的是以缩合形式 ( 如鞣花单宁、苷等 ) 存在。我国石榴种植面积大，石榴皮资源丰富，除少部分被用于中药材以外，大部分都被废弃，造成了很大的浪费。以石榴皮为原料生产鞣花酸，生产成本低，产品附加值高，还能变废为宝。

[0004] 近20年的研究发现鞣花酸具有较强的抗脂质过氧化、捕捉自由基的能力；可以抑制致癌剂的代谢活动，解除致癌物的毒性；对人体免疫缺陷病毒具有抑制作用；还具有胃肠动力学和泌尿生殖动力学作用，以及具有凝血、降压、镇静作用。因此，倍受人们关注。

[0005] 鞣花酸可以通过提取、化学合成法和天然产物降解法得到，具体制备方法主要有以下几种：

[0006] 第一种是从植物中提取鞣花酸。在板栗壳斗、树莓、石榴以及高粱种壳等植物材料中含有少量游离的鞣花酸 (约1％)，用此法可制备高纯度的鞣花酸。但由于原料成本较高、且鞣花酸含量低，在生产上没有实际意义。

[0007] 第二种是通过没食子酸(或其酯)的氧化聚合。合成前体物质——没食子酸(酯)需要在酶的作用下氧化聚合制取鞣花酸。此法鞣花酸的产率为 20％～30％。但没食子酸(酯)的制备过程繁琐复杂，酶也需要精制纯化，而且合成产物中存在未知的醌类物质，其与鞣花酸的比例为 1∶2.4，给产品的分离纯化带来了一定的困难，目前较少用此法进行鞣花酸的生产。

[0008] 第三种是酸水解法制备鞣花酸的工艺(专利号：200510002081.X)，此法具有较高的产率和纯度，但需消耗高浓度强酸，并在长时间加热条件下完成，对设备抗腐蚀能力要求很高，对环境污染较重。

[0009] 第四种是目前公开的以石榴皮为原料非化学制备鞣花酸的方法。其一是酶催化法(专利号：200810056007.X)，其主要过程分为两步：液态发酵产酶阶段和酶促转化阶段，此法过程繁琐，且酶促转化条件要求严格，不易控制。公开的另一方法是黑曲霉固态发酵法（专利号：201010178430.4），其过程是石榴皮粉末置于发酵罐中，石榴皮用占总重量 47％～60％的初始润湿水溶液润湿，所用润湿液中加有0.1％ NaCl、0.1％ MgSO4和0.5％NH4NO3，其中NH4NO3 作为N源，pH 5～7，115℃灭菌30 min，冷却后接入黑曲霉(Aspergillus niger 3.316) 孢子悬液，石榴皮和黑曲霉的用量比例为 5 g石榴皮添加1 mL浓度为1×1010个/mL的黑曲霉孢子悬液。混匀并静置培养，30 ℃发酵 5～7天，得到含有鞣花酸的发酵产物。该方法使用发酵罐固态发酵，装料与出料均比较麻烦，上下部分发酵不均匀；再是该法仅使用单一菌种发酵，效率有待提高，这些方面对大规模工业化生产有一定的限制。

发明内容

[0010] 本发明的目的是提供一种以石榴皮单宁为底物制备鞣花酸更高效的液态发酵方法。通过以石榴皮单宁提取液为发酵底物，经黑曲霉菌(Aspergillus niger)、青霉菌（Pencicillin G）与大肠杆菌（Escherichia. Coli）共固定化液态发酵法生产鞣花酸，经甲醇萃取得到高纯度鞣花酸。该方法操作简单，鞣花酸的纯度和产率较高。

[0011] 本发明以黑曲霉菌、青霉菌和大肠杆菌为发酵菌种，并使用羧甲基纤维素钠、海藻酸钠共固定，以石榴皮单宁提取液为发酵底物，进行液态发酵。发酵过程中，黑曲霉、青霉和大肠杆菌均合成单宁酶并将其分泌到胞外，单宁酶催化石榴皮中的鞣花单宁降解生成鞣花酸，发酵产物经萃取和洗涤纯化获得高纯度鞣花酸，包括以下步骤：

[0012] （1）石榴皮单宁提取液制备

[0013] 将干燥的石榴皮粉碎至40目，使用61%～70%体积分数的乙醇溶液60-80℃回流提取3次，第1次加入乙醇溶液是石榴皮粉末质量的10～15倍，提取2 h，离心分离滤液和滤渣；第2次向滤渣中加入乙醇溶液8～10倍，提取1.5 h，离心分离；第3次向滤渣中加入乙醇溶液
6～8倍，提取1 h，离心分离；合并3次滤液，经蒸馏回收乙醇，得石榴皮单宁提取浓缩水溶液，可直接用于发酵生产。经测定提取浓缩水溶液中单宁含量1%～1.5%。

[0014] （2）发酵菌种的培养与共固定

[0015] 将黑曲霉菌、青霉菌和大肠杆菌分别在液体完全培养基中于33 ℃振荡培养12 h(80r/min)后，将3种培养液分别于5200～6000 r/min离心12～10 min，得到孢子和菌体悬液，以无菌水稀释菌悬液，使孢子或菌体数达106～107个/mL，然后将3种菌悬液以3∶2∶2的体积比例混合均匀后，再按1∶1的比例与羧甲基纤维素钠和海藻酸钠的胶体水溶液混合，胶体水溶液中羧甲基纤维素钠的质量百分比为1%，海藻酸钠的质量百分比为4%，再按1%～2%的质量比加入60目的硅藻土，搅拌均匀，然后滴入不断搅拌的含4%CaCl2和2%MgSO4的混合水溶液中，浸泡2 h，制得直径2～3 mm的球形颗粒，用无菌水洗涤两次后，备用。

[0016] （3）接种与发酵

[0017] 把（1）制得的石榴皮单宁提取浓缩水溶液装入发酵罐，加入质量比0.2%的(NH4)2HPO4，再把固定化菌种胶粒接入发酵罐，接种量为发酵液质量比的10%～15%，发酵温度控制在33～35℃，从发酵罐底部泵入无菌空气，空气流量为发酵液体积的0.4～0.6倍每小时，发酵4～5天。过滤分离发酵液与固定化菌种胶粒，菌种胶粒可连续使用20次以上，发酵液用于提取鞣花酸。

[0018] （4）萃取

[0019] 含鞣花酸的发酵液通过离心分离，获得含鞣花酸的沉淀，第1次加入4～6倍体积的无水甲醇70 ℃回流萃取4 h，过滤；第2次向滤渣中加入2～3倍体积的无水甲醇回流萃取3 h，过滤；合并次滤液，旋蒸回收甲醇至饱和，饱和的浓缩液在室温下静置结晶，过滤所得固体结晶经去离子水水洗后冷冻干燥即得鞣花酸产品。

[0020] 本发明的实质是以石榴皮单宁为液态发酵底物，黑曲霉菌、青霉菌和大肠杆菌发酵产生单宁酶，其特异性高，专一性的降解鞣花单宁中的酯键，使石榴皮鞣花单宁降解生成鞣花酸，经萃取纯化后获得高纯度的鞣花酸。

[0021] 本发明的优点是：本发明使用3种菌混合发酵能形成互补效应，使鞣花酸转化效率更高；3种菌按照一定比例混合，并使用羧甲基纤维素钠、海藻酸钠和硅藻土制备固定化胶粒，增加了固定化胶粒的利用次数，提高了菌种的利用效率。该工艺发酵条件温和，大大减少化学物质的消耗，环境污染小，更适合大规模的生产。

具体实施方式

[0022] 实施例1：

[0023] （1）石榴皮单宁提取液制备

[0024] 将干燥的石榴皮粉碎至40目，使用62%体积分数的乙醇溶液72℃回流提取3次，第1次加入乙醇溶液是石榴皮粉末质量的12倍，提取2 h，离心分离滤液和滤渣；第2次向滤渣中加入乙醇溶液10倍，提取1.5 h，离心分离；第3次向滤渣中加入乙醇溶液8倍，提取1 h，离心分离；合并3次滤液，经蒸馏回收乙醇，得石榴皮单宁提取浓缩水溶液，可直接用于发酵生产。经测定提取浓缩水溶液中单宁含量1%～1.5%。

[0025] （2）发酵菌种的培养与共固定

[0026] 将黑曲霉菌、青霉菌和大肠杆菌分别在液体完全培养基中于33 ℃振荡培养12 h(80r/min)后，将3种培养液分别于5200 r/min离心12 min，得到孢子和菌体悬液，以无菌水稀释菌悬液，使孢子或菌体数达106～107个/mL，然后将3种菌悬液以3∶2∶2的体积比例混合均匀后，再按1∶1的比例与羧甲基纤维素钠和海藻酸钠的胶体水溶液混合，胶体水溶液中羧甲基纤维素钠的质量百分比为1%，海藻酸钠的质量百分比为4%，再按1%%的质量比加入60目的硅藻土，搅拌均匀，然后滴入不断搅拌的含4%CaCl2和2%MgSO4的混合水溶液中，浸泡2 h，制得直径2～3 mm的球形颗粒，用无菌水洗涤两次后，备用。

[0027] （3）接种与发酵

[0028] 把（1）制得的石榴皮单宁提取浓缩水溶液装入发酵罐，加入质量比0.2%的(NH4)2HPO4，再把固定化菌种胶粒接入发酵罐，接种量为发酵液质量比的10%，发酵温度控制在33 ℃，从发酵罐底部泵入无菌空气，空气流量为发酵液体积的0.4倍每小时，发酵5天。过滤分离发酵液与固定化菌种胶粒，菌种胶粒可连续使用20次以上，发酵液用于提取鞣花酸。

[0029] （4）萃取

[0030] 含鞣花酸的发酵液通过离心分离，获得含鞣花酸的沉淀，第1次加入4倍体积的无水甲醇70 ℃回流萃取4 h，过滤；第2次向滤渣中加入3倍体积的无水甲醇回流萃取3 h，过滤；合并次滤液，旋蒸回收甲醇至饱和，饱和的浓缩液在室温下静置结晶，过滤所得固体结晶经去离子水水洗后冷冻干燥即得鞣花酸产品。

[0031] 实施例2：

[0032] （1）石榴皮单宁提取液制备

[0033] 将干燥的石榴皮粉碎至40目，使用:65%体积分数的乙醇溶液73℃回流提取3次，第1次加入乙醇溶液是石榴皮粉末质量的14倍，提取2 h，离心分离滤液和滤渣；第2次向滤渣中加入乙醇溶液9倍，提取1.5 h，离心分离；第3次向滤渣中加入乙醇溶液7倍，提取1 h，离心分离；合并3次滤液，经蒸馏回收乙醇，得石榴皮单宁提取浓缩水溶液，可直接用于发酵生产。经测定提取浓缩水溶液中单宁含量1%～1.5%。

[0034] （2）发酵菌种的培养与共固定

[0035] 将黑曲霉菌、青霉菌和大肠杆菌分别在液体完全培养基中于33 ℃振荡培养12 h(80r/min)后，将3种培养液分别于5500 r/min离心11 min，得到孢子和菌体悬液，以无菌水稀释菌悬液，使孢子或菌体数达106～107个/mL，然后将3种菌悬液以3∶2∶2的体积比例混合均匀后，再按1∶1的比例与羧甲基纤维素钠和海藻酸钠的胶体水溶液混合，胶体水溶液中羧甲基纤维素钠的质量百分比为1%，海藻酸钠的质量百分比为4%，再按1.5%的质量比加入60目的硅藻土，搅拌均匀，然后滴入不断搅拌的含4%CaCl2和2%MgSO4的混合水溶液中，浸泡2 h，制得直径2～3 mm的球形颗粒，用无菌水洗涤两次后，备用。

[0036] （3）接种与发酵

[0037] 把（1）制得的石榴皮单宁提取浓缩水溶液装入发酵罐，加入质量比0.2%的(NH4)2HPO4，再把固定化菌种胶粒接入发酵罐，接种量为发酵液质量比的12%，发酵温度控制在34 ℃，从发酵罐底部泵入无菌空气，空气流量为发酵液体积的0.5倍每小时，发酵4.5天。过滤分离发酵液与固定化菌种胶粒，菌种胶粒可连续使用20次以上，发酵液用于提取鞣花酸。

[0038] （4）萃取

[0039] 含鞣花酸的发酵液通过离心分离，获得含鞣花酸的沉淀，第1次加入5倍体积的无水甲醇70 ℃回流萃取4 h，过滤；第2次向滤渣中加入3倍体积的无水甲醇回流萃取3 h，过滤；合并次滤液，旋蒸回收甲醇至饱和，饱和的浓缩液在室温下静置结晶，过滤所得固体结晶经去离子水水洗后冷冻干燥即得鞣花酸产品。

[0040] 实施例3：

[0041] （1）石榴皮单宁提取液制备

[0042] 将干燥的石榴皮粉碎至40目，使用70%体积分数的乙醇溶液75 ℃回流提取3次，第1次加入乙醇溶液是石榴皮粉末质量的15倍，提取2 h，离心分离滤液和滤渣；第2次向滤渣中加入乙醇溶液8倍，提取1.5 h，离心分离；第3次向滤渣中加入乙醇溶液6倍，提取1 h，离心分离；合并3次滤液，经蒸馏回收乙醇，得石榴皮单宁提取浓缩水溶液，可直接用于发酵生产。经测定提取浓缩水溶液中单宁含量1%～1.5%。

[0043] （2）发酵菌种的培养与共固定

[0044] 将黑曲霉菌、青霉菌和大肠杆菌分别在液体完全培养基中于33 ℃振荡培养12 h(80r/min)后，将3种培养液分别于6000 r/min离心10 min，得到孢子和菌体悬液，以无菌水稀释菌悬液，使孢子或菌体数达106～107个/mL，然后将3种菌悬液以3∶2∶2的体积比例混合均匀后，再按1∶1的比例与羧甲基纤维素钠和海藻酸钠的胶体水溶液混合，胶体水溶液中羧甲基纤维素钠的质量百分比为1%，海藻酸钠的质量百分比为4%，再按2%的质量比加入60目的硅藻土，搅拌均匀，然后滴入不断搅拌的含4%CaCl2和2%MgSO4的混合水溶液中，浸泡2 h，制得直径2～3 mm的球形颗粒，用无菌水洗涤两次后，备用。

[0045] （3）接种与发酵

[0046] 把（1）制得的石榴皮单宁提取浓缩水溶液装入发酵罐，加入质量比0.2%的(NH4)2HPO4，再把固定化菌种胶粒接入发酵罐，接种量为发酵液质量比的15%，发酵温度控制在35℃，从发酵罐底部泵入无菌空气，空气流量为发酵液体积的0.6倍每小时，发酵4天。过滤分离发酵液与固定化菌种胶粒，菌种胶粒可连续使用20次以上，发酵液用于提取鞣花酸。

[0047] （4）萃取

[0048] 含鞣花酸的发酵液通过离心分离，获得含鞣花酸的沉淀，第1次加入6倍体积的无水甲醇70 ℃回流萃取4 h，过滤；第2次向滤渣中加入2倍体积的无水甲醇回流萃取3 h，过滤；合并次滤液，旋蒸回收甲醇至饱和，饱和的浓缩液在室温下静置结晶，过滤所得固体结晶经去离子水水洗后冷冻干燥即得鞣花酸产品。