本发明公开了一种利用氮磷掺杂碳量子点探针检测血红蛋白的方法，包括：步骤一、制备氮磷掺杂碳量子点，具体为：将水滑石粉和硅溶胶溶于去离子水，加入磷酸和氨基磺酸钠搅拌，冷却取上清液过滤，取滤液微波处理，烘干，取粉末、亚氨基二乙酸、以及磷酸溶液溶于无氧高纯水，加入甲基亚氨基二乙酸，搅拌，取上清液红外照射即可，将其配制成溶液，向其中添加不同浓度的血红蛋白标准溶液，照射激发光，建立血红蛋白浓度与荧光强度的关系；步骤二、照射激发光，检测含有血红蛋白的待测溶液对应的荧光强度，根据步骤一中检测的血红蛋白浓度与荧光强度，读取待测溶液中对应的血红蛋白的浓度。本发明具有检测灵敏、抗干扰能力强、检测准确度高的有益效果。
1.一种利用氮磷掺杂碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备氮磷掺杂碳量子点，配制氮磷掺杂碳量子点溶液，向其中添加不同浓度的血红蛋白标准溶液，照射激发光，建立血红蛋白浓度与荧光强度的关系；
步骤二、照射激发光，检测含有血红蛋白的待测溶液对应的荧光强度，根据步骤一中检测的血红蛋白浓度与荧光强度，读取待测溶液中对应的血红蛋白的浓度；
S1、将1.5g水滑石粉和0.5g硅溶胶溶于10mL去离子水中，加入0.8mL质量分数为40％的磷酸和0.2g氨基磺酸钠于60℃水浴条件下搅拌3h，冷却至室温，取上清液于0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液微波处理30s，于30℃条件下烘干得粉末，其中，微波功率为900W，微波温度为180℃；
S2、取0.1g步骤S1中的粉末、0.2g亚氨基二乙酸、以及50mL质量分数为10％的磷酸溶液溶解于250mL无氧高纯水中，加入1.5g甲基亚氨基二乙酸，以200r/min的速度搅拌1h，取上清液红外照射20min，即得氮磷掺杂碳量子点，其中，红外照射功率为500W。
2.如权利要求1所述的利用氮磷掺杂碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，步骤一中建立血红蛋白浓度与荧光强度的关系具体为：检测每份血红蛋白标准溶液对应的荧光光谱，并记录每份血红蛋白标准溶液对应的荧光强度，以浓度为0的血红蛋白标准溶液对应的荧光强度与任一份其它浓度的血红蛋白标准溶液对应的荧光强度的比值为纵坐标，每份血红蛋白标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算方程；
步骤二具体为：将含有血红蛋白的待测溶液加入到一份氮磷掺杂碳量子点溶液中，照射激发光，检测待测溶液对应的荧光光谱，并记录待测溶液对应的荧光强度，代入所述方程得到待测溶液中对应的血红蛋白的浓度。
3.如权利要求1所述的利用氮磷掺杂碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，步骤一中的多份不同浓度的血红蛋白标准溶液的浓度依次为：0、1×10-9mol/L、6×10-
9mol/L、2×10-8mol/L、4×10-8mol/L、6×10-8mol/L、2×10-7mol/L、4×10-7mol/L、5×10-
7mol/L、8×10-7mol/L、1.3×10-6mol/L、2.5×10-6mol/L、3.5×10-6mol/L、4×10-6mol/L、以及6×10-6mol/L。
4.如权利要求2所述的利用氮磷掺杂碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，激发光的波长为380nm。
5.如权利要求1所述的利用氮磷掺杂碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，采用pH为7.4的PBS缓冲溶液配制氮磷掺杂碳量子点溶液和血红蛋白标准溶液，采用pH为
7.4的PBS缓冲溶液将待测溶液的pH值调节至7.4。
6.如权利要求1所述的利用氮磷掺杂碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，氮磷掺杂碳量子点溶液的浓度为0.5mg/mL。
7.如权利要求5所述的利用氮磷掺杂碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，配制氮磷掺杂碳量子点溶液具体为：将氮磷掺杂碳量子点和PBS缓冲溶液按质量体积比为
0.5mg:1mL混合后，超声处理20min，超声频率为40kHz，超声温度为80℃，然后依次置于只能透过蓝色光的透过率分别为10％、40％、以及80％的容器中密封，并采用日光灯分别照射
40min，倒入密封袋中密封冰冻45min，在150MPa下高压处理30min，再置于暗箱中静置30min即可。
8.如权利要求5所述的利用氮磷掺杂碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，血红蛋白标准溶液的配制方法具体为：将血红蛋白与PBS缓冲溶液混合，置于4℃的冷水浴中搅拌2min，再依次置于只能透过红色光的透过率分别为80％、40％、以及10％的容器中密封，同时置于4℃的冷水浴中，并采用日光灯分别照射20min，再置于暗箱中静置30min即可；
含有血红蛋白的待测溶液还进行了预处理，具体为：将待测溶液用PBS缓冲溶液调节pH值为7.4，置于4℃的冷水浴中搅拌2min，再依次置于只能透过红色光的透过率分别为10％、
40％、以及80％的容器中密封，同时置于4℃的冷水浴中，并采用日光灯分别照射20min，再置于暗箱中静置30min即可。
利用氮磷掺杂碳量子点探针检测血红蛋白的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及血红蛋白检测领域。更具体地说，本发明涉及一种利用氮磷掺杂碳量子点探针检测血红蛋白的方法。
背景技术
[0002] 血红蛋白是人体不可缺少的蛋白，多数被储存在红细胞中，它是一种由2条α与2条β多肽链组合成的四聚物蛋白质，其中每条肽链又与一个血红素辅基(亚铁卟啉辅基)结合。研究表明，生物体内诸多和氧、能量以及代谢相关的重要活动都有血红蛋白的参与。而且血红蛋白既是一种氧化还原蛋白，又是一种别构蛋白，血红蛋白的别构效应和氧化还原性受到了广大科学研究者的热情关注。而且血红蛋白在血液中的浓度与诸多与血液、心脏等相关的疾病有紧密的联系，所以人体血液中血红蛋白浓度的测量相当重要。
[0003] 科技的迅速发展使得纳米材料的应用和研究发展迅猛，其中荧光纳米材料因具有普通纳米材料的通性以及出色的荧光性能而在生物、化学、医学等领域得到广泛的应用。常见的荧光纳米材料有量子点(Quantum dots,QDs)、金属掺杂的荧光纳米材料、金属纳米簇、有机-无机复合材料等。量子点又因其具有窄的发射峰形、宽且连续的吸收光谱、易于控制的发射波长等优点，使其在生物化学、生物学、药物学等领域得到广泛的应用。但由于自身含重金属离子，对环境以及人体都会造成不可忽视的伤害，限制了其在各领域的应用。2004年，一种荧光材料被发现，其后，经过一系列的研究，碳点(Carbon dots)正式成为这种新的荧光纳米材料的名称。相对于其它同类型的材料，碳点以原料廉价易得、低毒性、生物相容性、良好的水溶性、化学性质稳定等优点而在生物化学、生物医药、分析化学等领域得到广泛应用。近期，以碳点荧光的性质为依据的对重金属离子以及生物分子进行测定的研究日益增多。碳点已在离子和分子的检测、细胞成像等方面得到应用，在生物、化学、材料等领域有良好的发展前景和广阔的发展空间。
[0004] 常规检测血红蛋白的方法多采用比色法，但是比色法检测血红蛋白的浓度时，灵敏度不高，准确性不够高，抗干扰能力有待加强。
发明内容
[0005] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0006] 本发明还有一个目的是提供一种利用氮磷掺杂碳量子点探针检测血红蛋白的方法，可以灵敏的检测出血红蛋白，准确可靠的检测出溶液中血红蛋白的浓度，抗干扰能力强。
[0007] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种利用氮磷掺杂碳量子点探针检测血红蛋白的方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤一、制备氮磷掺杂碳量子点，配制氮磷掺杂碳量子点溶液，向其中添加不同浓度的血红蛋白标准溶液，照射激发光，建立血红蛋白浓度与荧光强度的关系；
[0009] 步骤二、照射激发光，检测含有血红蛋白的待测溶液对应的荧光强度，根据步骤一中检测的血红蛋白浓度与荧光强度，读取待测溶液中对应的血红蛋白的浓度。
[0010] 优选的是，步骤一中建立血红蛋白浓度与荧光强度的关系具体为：检测每份血红蛋白标准溶液对应的荧光光谱，并记录每份血红蛋白标准溶液对应的荧光强度，以浓度为0的血红蛋白标准溶液对应的荧光强度与任一份其它浓度的血红蛋白标准溶液对应的荧光强度的比值为纵坐标，每份血红蛋白标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算方程；
[0011] 步骤二具体为：将含有血红蛋白的待测溶液加入到一份氮磷掺杂碳量子点溶液中，照射激发光，检测待测溶液对应的荧光光谱，并记录待测溶液对应的荧光强度，代入所述方程得到待测溶液中对应的血红蛋白的浓度。
[0012] 优选的是，步骤一中的多份不同浓度的血红蛋白标准溶液的浓度依次为：0、1×10-9mol/L、6×10-9mol/L、2×10-8mol/L、4×10-8mol/L、6×10-8mol/L、2×10-7mol/L、4×10-
7mol/L、5×10-7mol/L、8×10-7mol/L、1.3×10-6mol/L、2.5×10-6mol/L、3.5×10-6mol/L、4×-6 -6
10 mol/L、以及6×10 mol/L。
[0013] 优选的是，激发光的波长为380nm。
[0014] 优选的是，采用pH为7.4的PBS缓冲溶液配制氮磷掺杂碳量子点溶液和血红蛋白标准溶液，采用pH为7.4的PBS缓冲溶液将待测溶液的pH值调节至7.4。
[0015] 优选的是，氮磷掺杂碳量子点溶液的浓度为0.5mg/mL。
[0016] 优选的是，氮磷掺杂碳量子点的制备方法具体为：
[0017] S1、将1.5g水滑石粉和0.5g硅溶胶溶于10mL去离子水中，加入0.8mL质量分数为40％的磷酸和0.2g氨基磺酸钠于60℃水浴条件下搅拌3h，冷却至室温，取上清液于0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液微波处理30s，于30℃条件下烘干得粉末，其中，微波功率为900W，微波温度为180℃；
[0018] S2、取0.1g步骤S1中的粉末、0.2g亚氨基二乙酸、以及50mL质量分数为10％的磷酸溶液溶解于250mL无氧高纯水中，加入1.5g甲基亚氨基二乙酸，以200r/min的速度搅拌1h，取上清液红外照射20min，即得氮磷掺杂碳量子点，其中，红外照射功率为500W。
[0019] 优选的是，配制氮磷掺杂碳量子点溶液具体为：将氮磷掺杂碳量子点和PBS缓冲溶液按质量体积比为0.5mg:1mL混合后，超声处理20min，超声频率为40kHz，超声温度为80℃，然后依次置于只能透过蓝色光的透过率分别为10％、40％、以及80％的容器中密封，并采用日光灯分别照射40min，倒入密封袋中密封冰冻45min，在150MPa下高压处理30min，再置于暗箱中静置30min即可。
[0020] 优选的是，血红蛋白标准溶液的配制方法具体为：将血红蛋白与PBS缓冲溶液混合，置于4℃的冷水浴中搅拌2min，再依次置于只能透过红色光的透过率分别为80％、40％、以及10％的容器中密封，同时置于4℃的冷水浴中，并采用日光灯分别照射20min，再置于暗箱中静置30min即可；
[0021] 含有血红蛋白的待测溶液还进行了预处理，具体为：将待测溶液用PBS缓冲溶液调节pH值为7.4，置于4℃的冷水浴中搅拌2min，再依次置于只能透过红色光的透过率分别为10％、40％、以及80％的容器中密封，同时置于4℃的冷水浴中，并采用日光灯分别照射
20min，再置于暗箱中静置30min即可。
[0022] 本发明至少包括以下有益效果：
[0023] 第一、本发明的检测方法具有灵敏度高、抗干扰能力强、检测准确可靠的优点；
[0024] 第二、从荧光光谱图中可得知，血红蛋白浓度为0对应的荧光强度与待检测溶液对应的荧光强度随血红蛋白的浓度的增加而增大，且荧光强度比值与血红蛋白的浓度有良好的线性关系；
[0025] 第三、将水滑石粉和硅溶胶溶于去离子水中，加入质量分数为40％的磷酸和氨基磺酸钠于60℃水浴条件下搅拌3h，冷却至室温，取上清液于0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液微波处理30s，于30℃条件下烘干得粉末，可以使碳原子附近形成一些微孔结构，以容纳氮或磷，并且去除了其它颗粒较大的固定物质，留下0.45μm以下的具有微孔结构的碳混合物，再与亚氨基二乙酸和质量分数为10％的磷酸溶液溶解于无氧高纯水中，加入甲基亚氨基二乙酸，以200r/min的速度搅拌1h，取上清液红外照射，可以将氮和磷镶嵌入微孔结构内，并保持一定的自由度，可以在微孔结构内旋转，轻微浮动，当有激发光照射时，可以提高能量转换效率，增强发射光强度；
[0026] 第四、将氮磷掺杂碳量子点和PBS缓冲溶液混合后，超声处理，使液体不断冲击微孔结构内部，促进氮、磷活动，再依次置于只能透过蓝色光的透过率分别为10％、40％、以及80％的容器中密封，并采用日光灯分别照射，利用蓝色可见光梯度照射，对氮、磷和碳进行温和激活，冰冻后进行高压处理，冰冻后再高压处理可以压碎位于微孔外部的冰晶，而微孔内部的冰晶结构不变，保持氮、磷和碳的微激活状态，使再置于暗箱中静置，微孔内部冰晶融化，氮、磷和碳完全激活；
[0027] 第五、将血红蛋白与PBS缓冲溶液混合，冷水浴搅拌，使血红蛋白结构收缩，再依次置于只能透过红色光的透过率分别为80％、40％、以及10％的容器中密封，同时置于4℃的冷水浴中，并采用日光灯分别照射，红色可见光可以缓慢诱导血红蛋白的α亚基和β亚基向外凸出，形成特异结构，再置于暗箱中静置，血红蛋白的结构伸长，但由α亚基和β亚基向外凸出形成的特异结构仍然保持凸出状态，这个结构正好可以伸入到氮磷掺杂碳量子点的微孔结构中，抑制氮、磷和碳的活动，显著抑制氮磷掺杂碳量子点的荧光效应。
[0028] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0029] 图1为本发明的血红蛋白标准溶液的荧光光谱图；
[0030] 图2为本发明的荧光强度比值与血红蛋白浓度的标准曲线图。
具体实施方式
[0031] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0032] <实施例1>
[0033] 一种利用氮磷掺杂碳量子点探针检测血红蛋白的方法，包括以下步骤：
[0034] 步骤一、采用pH为7.4的PBS缓冲溶液配制浓度为0.5mg/mL的氮磷掺杂碳量子点溶液，采用pH为7.4的PBS缓冲溶液配置多份不同浓度的血红蛋白标准溶液，血红蛋白标准溶液的浓度依次为：0、1×10-9mol/L、6×10-9mol/L、2×10-8mol/L、4×10-8mol/L、6×10-8mol/L、2×10-7mol/L、4×10-7mol/L、5×10-7mol/L、8×10-7mol/L、1.3×10-6mol/L、2.5×10-6mol/L、3.5×10-6mol/L、4×10-6mol/L、6×10-6mol/L、7×10-6mol/L、8×10-6mol/L、1×10-
5mol/L，分别量取18份体积为3ml的氮磷掺杂碳量子点溶液，一份氮磷掺杂碳量子点溶液中分别添加一份血红蛋白标准溶液，照射波长为380nm的激发光，得到如图1示出的发射光的荧光光谱图，并记录每份血红蛋白标准溶液对应的480nm的荧光强度，以浓度为0的血红蛋白标准溶液对应的480nm的荧光强度与任一份其它浓度的血红蛋白标准溶液对应的480nm的荧光强度的比值为纵坐标，每份血红蛋白标准溶液的浓度为横坐标，如图2示出的，血红蛋白标准溶液的浓度为0～6×10-6mol/L时，荧光强度比值与血红蛋白的浓度具有良好的线性关系，绘制标准曲线并计算方程；
[0035] 步骤二、采用pH为7.4的PBS缓冲溶液将含有血红蛋白的待测溶液的pH值调节到7.4，将待测溶液加入到一份体积为3ml的氮磷掺杂碳量子点溶液中，照射波长为380nm的激发光，检测待测溶液对应的荧光光谱，并记录待测溶液对应的480nm的荧光强度，代入所述方程得到待测溶液中对应的血红蛋白的浓度。
[0036] <实施例2>
[0037] 测定步骤同实施例1，其中，不同的是步骤一中氮磷掺杂碳量子点的制备方法、氮磷掺杂碳量子点溶液的配制方法、血红蛋白标准溶液的配制方法、以及含有血红蛋白的待测溶液的预处理不同，具体如下所述：
[0038] 氮磷掺杂碳量子点的制备方法具体为：
[0039] S1、将1.5g水滑石粉和0.5g硅溶胶溶于10mL去离子水中，加入0.8mL质量分数为40％的磷酸和0.2g氨基磺酸钠于60℃水浴条件下搅拌3h，冷却至室温，取上清液于0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液微波处理30s，于30℃条件下烘干得粉末，其中，微波功率为900W，微波温度为180℃；
[0040] S2、取0.1g步骤S1中的粉末、0.2g亚氨基二乙酸、以及50mL质量分数为10％的磷酸溶液溶解于250mL无氧高纯水中，加入1.5g甲基亚氨基二乙酸，以200r/min的速度搅拌1h，取上清液红外照射20min，即得氮磷掺杂碳量子点，其中，红外照射功率为500W。
[0041] 配制氮磷掺杂碳量子点溶液具体为：将氮磷掺杂碳量子点和PBS缓冲溶液按质量体积比为0.5mg:1mL混合后，超声处理20min，超声频率为40kHz，超声温度为80℃，然后依次置于只能透过蓝色光的透过率分别为10％、40％、以及80％的容器中密封，并采用日光灯分别照射40min，倒入密封袋中密封冰冻45min，在150MPa下高压处理30min，再置于暗箱中静置30min即可。
[0042] 血红蛋白标准溶液的配制方法具体为：将血红蛋白与PBS缓冲溶液混合，置于4℃的冷水浴中搅拌2min，再依次置于只能透过红色光的透过率分别为80％、40％、以及10％的容器中密封，同时置于4℃的冷水浴中，并采用日光灯分别照射20min，再置于暗箱中静置30min即可；
[0043] 含有血红蛋白的待测溶液还进行了预处理，具体为：将待测溶液用PBS缓冲溶液调节pH值为7.4，置于4℃的冷水浴中搅拌2min，再依次置于只能透过红色光的透过率分别为10％、40％、以及80％的容器中密封，同时置于4℃的冷水浴中，并采用日光灯分别照射
20min，再置于暗箱中静置30min即可。
[0044] <对比例1>
[0045] 采用比色法检测待测溶液中血红蛋白的浓度，其中，配制16份含有血红蛋白的待测溶液，含有血红蛋白的待测溶液中血红蛋白的浓度分别为2×10-9mol/L、3×10-8mol/L、6×10-7mol/L以及5×10-6mol/L，分成A、B、C、以及D共4组，每组4份，向B组待测溶液中加入芳基钌，使待测溶液中芳基钌的浓度最终为1×10-7mol/L，得到4份含有血红蛋白和芳基钌的待测溶液，向C组待测溶液中加入六价铬，使待测溶液中浓度六价铬的浓度最终为1.2×10-5mol/L，得到4份含有血红蛋白和六价铬的待测溶液，向D组待测溶液中加入芳基钌和六价铬，使待测溶液中芳基钌和六价铬的浓度分别为1×10-7mol/L和1.2×10-5mol/L，得到含有血红蛋白、芳基钌和六价铬的待测溶液。
[0046] <对比例2>
[0047] 测定步骤同实施例1，其中，含有血红蛋白的待测溶液不同，待测溶液的配制方法同对比例1。
[0048] <对比例3>
[0049] 测定步骤同实施例2，其中，含有血红蛋白的待测溶液不同，待测溶液的配制方法同对比例1。
[0050] <检测结果>
[0051] 如表1所示为血红蛋白检测结果：
[0052]
[0053]
[0054] 从表1中可以看出实施例1和实施例2的血红蛋白检出限明显低于对比例1，说明采用氮磷掺杂碳量子点探针检测血红蛋白的方法比常规比色法的检出限低，检测更灵敏，实施例1和实施例2的A组血红蛋白的检测准确率明显高于对比例1，说明采用氮磷掺杂碳量子点探针检测血红蛋白的方法的准确度高于常规比色法；
[0055] 对比例3的B组、C组、以及D组的血红蛋白检测准确率均显著高于对比例1和对比例2的，说明对比例3的方法可以避免芳基钌和六价铬对血红蛋白的检测的干扰，提高准确率；
[0056] 对比例2的B组、C组、以及D组的血红蛋白检测准确率均低于对比例1的方法，说明当有待测溶液中含有芳基钌或六价铬时，会降低对比例2的方法的准确度，反而没有常规方法准确。
[0057] 这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
[0058] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
